Name: 体外研究可生物降解种植体材料的直接和间接培养方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学习三种体外培养方法评估可生物降解植入材料的细胞相容性，包括直接培养、直接暴露培养和暴露培养法。这些方法模拟体内细胞与植入物的不同相互作用，为生物医学工程研究提供重要工具。

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作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 项目 1512764 和 NSF PIRE 1545852）、美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631）、加州大学（UC）校长教职发展奖学金、研究委员会种子基金（Huinan Liu）以及加州大学河滨分校博士论文研究基金（Jiajia Lin）提供的经费支持。作者感谢加州大学河滨分校先进显微镜与微分析中心（CFAMM）提供扫描电子显微镜/能谱仪（SEM/EDS）的使用机会，并感谢Perry Cheung博士提供X射线衍射仪（XRD）的使用支持。作者还感谢Thanh Vy Nguyen和Queenie Xu在部分编辑工作中的协助。作者同时感谢Cindy Lee为视频录制了解说旁白。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定代表美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的立场。

本方案已获得加州大学河滨分校（UCR）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，用于细胞和组织的采集。视频中以一只12周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠为例进行展示，但更推荐使用较年轻的雌性或雄性大鼠。
1. 细胞培养准备
注意：本文所述的三种培养方法通常适用于不同类型的贴壁细胞。此处以从断奶大鼠中分离的骨髓间充质干细胞（BMSCs）为例，介绍细胞培养的制备过程。根据特定医学应用的相关性，可选用不同类型的细胞，包括从动物或人类供体获取的原代细胞，以及来自细胞/组织库的细胞系。
<ol>
	<li>从断奶大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs） 
	注意：图1中的示意图展示了从断奶大鼠中分离BMSCs的步骤。
	<ol>
		<li>通过吸入CO2处死Sprague Dawley（SD）大鼠。</li>
		<li>去除皮肤、肌肉和结缔组织，解剖出已处死大鼠的股骨。将股骨放入含有细胞培养基的15 mL锥形管（聚丙烯）中，并将锥形管置于冰上，直至进行细胞提取。 
		注意：胫骨也可用于分离BMSCs。细胞培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。</li>
		<li>将骨骼转移至生物安全柜中的培养皿内。使用手术刀片切除骨两端，用装有25½ G针头的注射器吸取细胞培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入50 mL锥形管（聚丙烯）中。 
		注意：将装有18 G针头的注射器插入含骨髓的培养基中，缓慢轻柔地反复吸取和排出液体，以打散大块骨髓组织，直至无可见的细胞/组织团块存在。</li>
		<li>使用70 µm滤器过滤细胞悬液，随后在126 × g（1,000 rpm）下离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，加入10 mL新鲜培养基。使用10 mL移液管轻轻吹打，重悬细胞。</li>
		<li>将悬液直接滴加至T-75培养瓶内底部，并补充培养基至总体积为25 mL。将细胞置于标准无菌细胞培养环境的培养箱中培养（即37 °C、含5% CO2和95%空气的湿润 atmosphere）。</li>
		<li>3–7天后，通过吸除旧培养基并更换新鲜培养基的方式洗去未贴壁细胞。继续培养并定期更换新鲜培养基，直至细胞可用于传代、冻存或实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞维持
	<ol>
		<li>定期更换细胞培养基，约每隔一天一次，以清除细胞代谢废物并补充营养，直至细胞融合度达到90%–100%。当融合度达90%时，进行传代、冻存或用于实验。</li>
		<li>细胞传代 
		注意：传代（也称继代培养）是指将细胞从一个培养容器转移至另一个的过程。新分离的细胞为第0代（P0）。本文所述胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（胰蛋白酶-EDTA）和培养基的用量适用于T-75培养瓶。
		<ol>
			<li>在光学显微镜下观察细胞，确认细胞融合度达90%。</li>
			<li>吸除细胞培养瓶中的培养基。</li>
			<li>使用移液管向培养瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动培养瓶以冲洗细胞，随后吸除全部PBS。 
			注意：此步骤作为额外清洗，确保传代过程中不转移死细胞或细胞代谢废物。</li>
			<li>直接向细胞培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，覆盖细胞表面，轻轻晃动培养瓶使溶液均匀分布。</li>
			<li>将含胰蛋白酶-EDTA的细胞培养瓶放入培养箱中孵育5分钟，使细胞脱落。</li>
			<li>孵育5分钟后，在光学显微镜下检查细胞是否已脱落。若部分细胞仍未脱落，可轻敲培养瓶侧壁，再次检查。</li>
			<li>向细胞培养瓶中加入9 mL新鲜培养基，以稀释胰蛋白酶-EDTA。这可为胰蛋白酶-EDTA提供更多可结合的蛋白，避免其继续裂解细胞。</li>
			<li>将含培养基和胰蛋白酶-EDTA的细胞悬液吹打转移至15 mL锥形管中，在126 × g（1,000 rpm）下离心5分钟。</li>
			<li>在不扰动细胞沉淀的前提下，吸除含胰蛋白酶-EDTA的上清液。</li>
			<li>向离心管中加入5–10 mL新鲜培养基，使用10 mL移液管轻轻吹打，使细胞在培养基中重悬。</li>
			<li>将含细胞的悬液从离心管中吹打转移，分装至2–3个新的培养瓶中。每瓶补充足够培养基，使总体积达到25 mL。 
			&#8203;注意：继代培养时的分瓶比例可能因细胞类型及特定生长特性而异。</li>
			<li>在光学显微镜下检查细胞，并将培养瓶放回培养箱中继续培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞冻存
		<ol>
			<li>在光学显微镜下检查细胞，确认细胞融合度达90%。</li>
			<li>重复步骤1.2.2.2至1.2.2.9。</li>
			<li>使用100–1000 µL移液器向离心管中加入900 µL新鲜培养基，缓慢轻柔地用同一移液器吹打重悬细胞。</li>
			<li>将900 µL细胞悬液转移至冻存管中，加入100 µL二甲基亚砜（DMSO）。</li>
			<li>尽快将冻存管放入专用于控制降温速率的圆柱形泡沫盒中（见材料表），并将泡沫盒置于-80 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞复苏
		<ol>
			<li>在水浴中快速解冻冻存细胞。取一支无菌15 mL锥形管，加入5 mL新鲜培养基，将细胞转入锥形管中，在126 × g（1,000 rpm）下离心5分钟。</li>
			<li>吸除含DMSO的上清液。</li>
			<li>向含细胞的15 mL锥形管中加入5–10 mL新鲜培养基，缓慢轻柔地反复吹打，使细胞重悬。</li>
			<li>将含细胞的悬液从15 mL锥形管中吹打转移，加入新的T-75培养瓶中。滴加细胞时，采用扫动方式，尽可能均匀地分布于培养瓶底部。</li>
			<li>每瓶T-75培养瓶中补充足够新鲜培养基，使总体积达到25 mL。</li>
			<li>在光学显微镜下检查细胞，并将培养瓶放回培养箱中继续培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备与灭菌
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>使用组织培养处理过的培养板，例如本文所述细胞培养实验中的6、12、24、48或96孔板。根据不同的实验设计（如样品尺寸）选择组织培养板的类型以及每孔中的培养基体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行细胞培养前，对所有可生物降解样品进行灭菌或消毒。 
	注意：in vitro 研究中，当样品在涉及高温、氧化剂和/或自由基的某些灭菌条件下容易发生化学和/或表面变化时，可接受采用消毒处理。不同类型的样品其灭菌或消毒方法因材料性质（如聚合物、金属和陶瓷）的不同而异。灭菌或消毒过程可能包括热处理、气体、辐射、化学试剂、高压，或上述方法的组合。
	<ol>
		<li>可生物降解金属
		<ol>
			<li>通常使用紫外线（UV）辐射对用于in vitro 研究的可生物降解金属进行消毒。 
			注意：例如，Zhang 等人报道，在用于细胞研究之前，纯镁（Mg）和 ZC21 镁合金样品在紫外线照射下消毒 4 小时1。对于in vivo 研究，通常要求对样品进行灭菌。对于许多可生物降解金属（如镁或镁合金），应避免使用蒸汽高压灭菌（autoclaving），因为这些样品在水中可能发生氧化或腐蚀6。建议使用石英皿进行紫外线消毒，因其比大多数玻璃和塑料具有更好的紫外线透过性。</li>
			<li>在烘箱中采用干热或高压灭菌法对镁合金样品进行灭菌，温度范围为 100–200 °C。 
			注意：由于某些金属合金在空气中高温下仍可能发生表面氧化，某些情况下可使用高强度辐射作为替代方法。然而，在对薄金属箔进行灭菌时，应避免使用高强度辐射（如α或γ辐射），因其可能导致材料内部原子位移，从而改变材料的微观结构。</li>
			<li>对于对热和辐射敏感的可生物降解金属，可采用环氧乙烷（EtO）气体灭菌作为替代方法26。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可生物降解陶瓷
		<ol>
			<li>通常在in vitro 研究前，使用紫外线辐射或70%乙醇溶液对可生物降解陶瓷进行消毒。 
			注意：例如，Liu 等人报道，磷酸钙样品在用于in vitro 细胞相容性测试前，先浸入70%乙醇中1小时，并在每侧暴露于紫外光下12小时进行消毒27。</li>
			<li>若高温和水蒸气不会破坏其成分和微观结构，可使用高压灭菌器对可生物降解陶瓷进行灭菌。 
			注意：某些陶瓷可能受高压灭菌影响。例如，氧化钇稳定氧化锆陶瓷在121 °C下高压灭菌15分钟后，观察到相变和表面粗糙化。此外，磷酸钙水泥（CPCs）不能通过蒸汽高压灭菌，因为样品会与水发生反应。</li>
			<li>对于上述氧化钇稳定氧化锆陶瓷和CPC样品，可采用钴-60辐射等替代灭菌方法28。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可生物降解聚合物
		<ol>
			<li>通常在用于in vitro 细胞研究前，使用紫外线辐射或70%乙醇对可生物降解聚合物进行消毒。 
			注意：某些聚合物在紫外线照射下可能发生化学变化。对于需要灭菌的情况，可采用γ射线处理（如钴-60辐射）。例如，淀粉粉末在用于in vitro 细胞研究前，已通过钴-60辐射进行灭菌29。</li>
			<li>对能够耐受高温和湿气的聚合物材料进行高压灭菌。 
			注意：例如，聚丙烯等聚合物可进行高压灭菌，因其可耐受高压灭菌温度（即121–134 °C）。而某些聚合物（如聚己内酯，PCL）由于其熔点相对较低（约60 °C），不能进行高压灭菌30。</li>
			<li>对于对热或辐射灭菌敏感的聚合物材料，可使用环氧乙烷（EtO）气体进行灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养方法
<ol>
	<li>直接培养方法 
	注意：图中的示意图 图2A 展示了直接培养法的步骤。本文以将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在置于12孔组织培养处理板孔内的镁衍生板上为例，说明该培养方法。
	<ol>
		<li>按照步骤1.2.2.1-1.2.2.10所述操作，获得细胞悬液。</li>
		<li>使用一个细胞融合度为90%的培养瓶，通过血细胞计数板测定细胞悬液中的细胞浓度。用新鲜培养基将细胞悬液稀释至细胞实验所需的指定细胞浓度 体外. 
		注意：细胞接种密度由实验设计决定。例如，细胞密度为 2,000–40,000 个细胞/cm²2 已在不同细胞研究中使用可生物降解材料。</li>
		<li>将样品（Mg板）置于12孔处理过的组织培养板中央。依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下调节渗透压。向每孔中加入3 mL稀释后的细胞悬液，覆盖目标样品。</li>
		<li>在标准细胞培养条件下，将细胞于培养箱中培养24小时。 
		注意：培养时间可能根据实验设计而长于或短于24 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直接暴露培养 
	注意：图中的示意图 图2B 展示了直接暴露培养的步骤。
	<ol>
		<li>如步骤3.1.1和3.1.2所述，根据实验设计中不同类型细胞及预期应用的要求，制备相应细胞浓度的细胞悬液。</li>
		<li>用 2 mL PBS 和 2 mL DMEM 依次冲洗培养板，以在无菌条件下调节渗透压。每孔加入 3 mL 稀释后的细胞悬液。将细胞置于湿润培养箱中，在标准细胞培养条件下培养 24 小时，或培养至细胞融合度达到 50–80%。 
		注意：不同细胞类型和实验设计的细胞汇合度水平可能有所不同。</li>
		<li>24小时后，用移液枪吸取PBS冲洗培养板中的细胞，以去除悬浮的死细胞。</li>
		<li>将消毒或灭菌后的样品直接置于贴壁细胞上，每孔加入 3 mL 新鲜培养基。</li>
		<li>在标准细胞培养条件下继续培养细胞24小时。 
		注意：培养时间可能根据实验设计而长于或短于24 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露培养 
	注意：图中的示意图 图2C 展示了暴露培养法的步骤。
	<ol>
		<li>细胞准备的初始步骤与暴露培养相同。如步骤3.1.1和3.1.2所述，制备含有目标细胞的细胞悬液。参照步骤3.2.1和3.2.2，将细胞以所需密度接种至培养板中，并在标准细胞培养条件下于培养箱中培养24 h。</li>
		<li>24小时后，用PBS冲洗贴壁细胞以去除悬浮的死细胞，随后每孔加入3 mL新鲜培养基。</li>
		<li>随后，将样品放入孔径为0.4 µm的膜插件中，并将带有样品的膜插件放入含细胞的各孔中。</li>
		<li>在标准细胞培养条件下继续培养细胞24小时。 
		&#8203;注意：培养时间可能根据实验设计而长于或短于24 h。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞培养后的表征
注意：对于直接培养和直接暴露培养，需对黏附在孔板和样品上的细胞进行固定、染色、成像及分析。对于暴露培养，仅分析黏附在孔板上的细胞。
<ol>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>将每个孔中的培养后培养基收集到相应的15 mL锥形管中，用于后续分析。所有样品在培养结束后均需收集，用于进一步分析。</li>
		<li>用PBS将两种样品及孔板上的贴壁细胞冲洗3次。</li>
		<li>向每个孔板中加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA，10%中性缓冲福尔马林）。盖上孔板盖，使PFA反应20分钟。</li>
		<li>20分钟后，吸除PFA并将其排入废液瓶中。用PBS冲洗孔板3次以去除残留PFA，并将废液转移至废液瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞染色
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制染色剂的工作液。 
		注意：例如，Alexa Fluor 488 Phalloidin用于染色F-肌动蛋白，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于染色细胞核。若样品在染色液中降解较快，可适当缩短染色时间。</li>
		<li>向每个孔中加入200–400 µL稀释后的Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂，确保覆盖孔板和样品上的细胞。用铝箔包裹孔板以避光，在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>收集Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂并排入相应的废液瓶中。用PBS冲洗孔板3次以去除多余的Alexa Fluor 488 Phalloidin，并将使用过的PBS排入相应的废液瓶中。</li>
		<li>向每个孔中加入200–400 µL稀释后的DAPI溶液，覆盖孔内及样品上的细胞。用铝箔包裹孔板，在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>收集DAPI溶液并排入相应的废液瓶中。用PBS冲洗孔板3次以去除DAPI，并将使用过的PBS排入相应的废液瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞成像
	<ol>
		<li>染色完成后，使用荧光显微镜对细胞进行成像。在可能的情况下，除荧光图像外，还应采集细胞的相差图像。为避免或减少样品持续降解可能引起的变化，应尽快或在染色后立即对可降解样品上的细胞进行成像。固定后的细胞应储存在2–8 °C的缓冲溶液中，并在染色后尽快成像，以防止荧光信号丢失。</li>
		<li>对于直接培养和直接暴露培养，需对两种类型的细胞进行成像和评估：(1) 样品上的细胞（与样品直接接触）和 (2) 孔板上围绕样品的贴壁细胞（与样品间接接触），如图3A所示。</li>
		<li>对于暴露培养，如图3B所示，在采集细胞荧光图像时使用成像引导，以判断细胞响应是否会因样品的动态降解梯度而不同。分别对位于内环区域（距中心3.5 mm）和外环区域（距中心7 mm）的细胞进行成像和分析。 
		注意：成像引导用于定义细胞与样品之间的距离。</li>
		<li>对于培养板中的每个样品和孔，应在预定义距离下，对细胞与样品直接接触或间接接触的感兴趣区域，每个区域随机采集至少五张图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>对步骤4.3获得的所有细胞图像，使用ImageJ等图像分析软件，通过测量细胞铺展面积和长宽比来定量分析细胞形态。</li>
		<li>统计每张图像区域内的细胞数量。计算在直接接触和间接接触条件下单位面积的细胞黏附密度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 培养后对培养基和样品的分析
<ol>
	<li>测定培养后培养基的pH值。 
	注意：某些样品在降解过程中会改变培养基的pH值。例如，可生物降解金属（如镁合金）通常因其降解而使培养基的pH值升高31相比之下，可生物降解聚合物（如PLGA）在降解过程中往往会降低培养基的pH值32测量培养后培养基的pH值可反映这些样品的降解情况 体外.
	<ol>
		<li>在细胞固定前，按照步骤4.1.1收集培养后培养基。</li>
		<li>使用预先校准的pH计，在收集后立即测量每个孔中培养后培养基的pH值。 
		注意：由于环境条件（如 CO₂）的影响，培养基的 pH 值可能会随时间发生漂移。2 水平和温度，应予以考虑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析培养基成分以评估可生物降解样品的降解行为。对于某些引起培养基颜色变化的样品，使用分光光度计或酶标仪测定培养后培养基的光密度（O.D.）值，以确定其降解行为。或者，可采用紫外-可见光谱法（UV-VIS）和傅里叶变换红外光谱-衰减全反射法（FTIR-ATR）分析培养后培养基中的降解产物。 
	注意：测量培养后培养基中的降解产物对于理解样品的降解行为具有重要意义。最常用的方法之一是使用电感耦合等离子体-光学发射光谱仪（ICP-OES）测定培养后培养基中目标离子的含量。ICP-OES可用于检测金属和陶瓷材料培养后培养基的元素组成，但可能不适用于聚合物材料。聚合物通常由碳、氢和氧元素组成，而ICP-OES难以准确量化这些元素。
	<ol>
		<li>按照步骤 5.1.2 进行 pH 测量后，收集培养基并使用适当的稀释倍数进行稀释，以获得离子浓度的最佳测定效果。</li>
		<li>使用ICP-OES测定培养后培养基中目标离子的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品的培养后分析 
	注意：在……之后 体外 细胞研究中，可生物降解样品的尺寸、质量、表面形貌、微观结构和成分可能发生改变。培养后对样品进行分析有助于理解样品的降解机制。
	<ol>
		<li>细胞培养后，对样品进行拍照，以显示样品在尺寸、颜色、形态及其他可见特征方面的可能变化。</li>
		<li>干燥或脱水培养后的样品，测量样品的质量、尺寸和体积，以量化其在质量、尺寸和体积上的任何变化。</li>
		<li>使用扫描电子显微镜（SEM）表征样品的微观结构和形貌。采用能谱仪（EDX）和X射线衍射（XRD）分析样品上降解产物的成分和物相。利用傅里叶变换红外光谱-衰减全反射（FTIR-ATR）检测样品表面的化学键合情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无利益冲突。

可采用不同的细胞培养方法来评估 体外 生物材料在不同应用方面的细胞相容性 在体. 本文展示了三种 体外 培养方法，即直接培养、直接暴露培养和暴露培养，以模拟不同的 体内 可降解植入材料在人体内应用的各种场景。直接培养法主要用于评估新接种细胞在植入材料表面及其周围直接黏附和生长的行为。直接暴露培养法可模拟 体内 植入材料与已形成的细胞和组织直接接触的情况。暴露培养法可用于展示植入材料的降解产物以及局部微环境的变化如何影响那些未与植入材料直接接触的已形成细胞和组织。
在直接培养中，评估在直接和间接接触条件下新接种的细胞。在直接暴露培养中，可在直接和间接接触条件下评估已建立的细胞。在暴露培养中，仅能评估在间接接触条件下的已建立细胞。直接培养中，在直接接触条件下的新接种细胞会受到材料特性以及材料引起的培养基变化的影响，例如离子浓度和pH值的变化。
上述材料特性可能包括表面形貌、亲水性、表面自由能、刚度和成分。在直接培养法中处于间接接触条件下的新接...

几十年来，可生物降解材料已在骨科1,2、牙科3,4和颅颌面5等生物医学领域得到广泛研究和应用。与永久性植入物和材料不同，可生物降解的金属、陶瓷、聚合物及其复合材料可在生理环境中通过不同的化学反应随时间逐渐降解。例如，镁（Mg）合金1,6,7和锌（Zn）合金8,9等可生物降解金属是骨固定装置的有前景材料。其可生物降解性可避免骨骼愈合后二次手术取出植入物的需要。可生物降解陶瓷如磷酸钙骨水泥（CPCs）在经皮椎体后凸成形术治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折方面展现出令人期待的应用潜力10。CPCs可为骨折的椎体提供机械支撑，并在骨折愈合后逐渐降解。
可生物降解的聚合物，例如某些多糖和聚酯，也已被广泛探索用于生物医学应用。例如，壳聚糖水凝胶作为一种可生物降解的多糖，已显示出其在防止感染和促进皮肤组织再生方面的能力11。聚-L-乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）和聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）是被广泛研究的聚酯材料，常用于制备二维或三维多孔支架，以应用于组织工程12,13,14。此外，复合材料结合了金属、陶瓷和聚合物中的两种或多种相态，为广泛的生物医学应用提供了更先进的功能15,16,17。例如，PLGA与磷酸钙的复合材料可用于制备可生物降解的支架，应用于颅骨缺损修复等18。这些可生物降解的支架和植入物可在体内支持并促进细胞和组织的生长，并随着时间的推移逐渐降解。
如补充&#160;表1所示，不同的可生物降解材料可能具有不同的降解机制、降解产物和降解速率。例如，镁合金（如Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca（ZC21）1、Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr（ZSr41）19 和 Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinc（AZ91）20）通过与水反应而降解，其主要降解产物包括Mg2+离子、OH-离子、H2气体以及矿物质沉积物。可生物降解金属的降解速率因其成分、几何形状和降解环境的不同而有所差异。例如，Cipriano等人19报道，在大鼠胫骨内植入47天后，ZSr41金属丝（Ø1.1 × 15 mm）质量损失达85%，而相同几何尺寸的纯镁金属丝质量损失为40%。可生物降解陶瓷材料（如羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP））可通过溶液驱动的细胞外液体溶解而降解，或先分解为小颗粒，再通过细胞外液体溶解和细胞介导的吸收过程共同降解。这些磷酸钙基陶瓷的降解产物可能包括Ca2+离子、(PO4)3-离子、OH-离子以及矿物质沉积物21。磷酸钙陶瓷的降解速率受其晶体结构的显著影响。例如，Van Blitterswijk等人22报道，在兔胫骨内植入3个月后，含有40 vol.%微孔的HA未发生任何质量损失，而含有相同孔隙率的β-TCP质量损失为30 ± 4%。聚合物（如PLGA14,23）可在水存在下因酯键的水解而降解，其主要降解产物为乳酸和乙醇酸。PLGA 50/50可能需要一个月完成完全降解，而PLGA 95/5则可能需要数月时间24。
细胞反应与细胞相容性测试对于评估和筛选用于生物医学应用的可生物降解植入材料至关重要。然而，目前国际标准化组织（ISO）发布的标准，如 ISO 10993-5:2009 &#34;医疗器械的生物学评价—第5部分 测试项目 体外 细胞毒性&#34;最初设计用于评估不可降解生物材料（如钛合金和铬-钴合金）的细胞毒性 体外25具体而言，ISO 10993-5:2009 仅涵盖 体外 细胞毒性测试包括浸提液测试、直接接触测试和间接接触测试。在浸提液测试中，通过将样品在一种标准时间与温度条件下浸入提取液（如含血清的培养基或生理盐水溶液）中制备浸提液。收集所得浸提液或其稀释液，加入细胞培养体系中以评估细胞毒性。在直接接触测试中，将测试样品直接放置于已贴壁的细胞层上，实现样品与细胞的直接接触。在间接接触测试中，将含有血清和熔化的琼脂培养基移液覆盖于已贴壁的细胞表面，待琼脂凝固后，将样品置于琼脂层上，可选择是否使用滤膜隔开。

细胞毒性测试，浸提液测试，直接接触测试，间接接触测试，细胞培养，琼脂覆盖法，滤膜，含血清培养基，生理盐水，标准条件
ISO标准在用于评估可生物降解材料时表现出一定的局限性 体外与非降解性材料不同，可生物降解材料的降解行为是动态的，可能在不同时间或不同环境条件（如温度、湿度、培养基成分和细胞类型）下发生变化。浸提液试验仅评估材料降解产物的细胞毒性，无法反映样品降解的动态过程。ISO标准中的直接接触试验和间接接触试验仅表征已建立的细胞与样品之间的相互作用。此外，在间接接触试验中，材料与细胞处于不同的微环境，不能真实反映 体内 环境，且无法捕捉可生物降解材料的动态降解过程。
本文旨在介绍并讨论针对各种可生物降解植入材料的细胞相容性测试方法，以解决当前ISO标准中所述方法存在的上述局限性。本文提出的方法考虑了植入材料的动态降解行为以及细胞与材料相互作用的不同情况 体内具体而言，本文提供了三种细胞相容性测试方法，即直接培养法、直接接触培养法和接触培养法，适用于各类可生物降解材料，包括用于医用植入物的可生物降解聚合物、陶瓷、金属及其复合材料。
在直接培养法中，将悬浮于培养基中的细胞直接接种到样品上，从而评估新接种的细胞与植入物之间的相互作用。在直接接触培养法中，将样品直接放置在已形成的细胞层上，以模拟植入物与体内已存在的宿主细胞之间的相互作用。在间接接触培养法中，将样品置于各自的培养小室插入物中，然后放入含有已形成细胞层的培养孔中，用于表征当细胞与植入物无直接接触时，由植入物降解引起的局部环境变化对已存在细胞所产生的影响。直接培养法和直接接触培养法用于评估细胞在同一培养孔内与植入材料直接或间接接触的情况。间接接触培养法用于表征在同一培养孔内、在规定距离范围内细胞与植入材料间接接触的情况。
本文详细描述了针对不同可生物降解材料的细胞相容性测试及其与模型细胞——骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）相互作用的评估方法。实验方案包括细胞的分离、培养、接种、固定、染色与成像，以及对培养后材料与培养基的分析，适用于多种可生物降解植入材料及多种细胞类型。这些方法可用于根据细胞反应和细胞相容性，筛选适用于不同生物医学应用的可生物降解材料。

细胞相容性, 可生物降解材料, 间充质干细胞, 骨髓来源间充质干细胞, BMSCs, 细胞培养, 细胞染色, 显微成像, 植入材料, 生物材料评估 体外.

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>490019-704</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养处理板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形管（聚丙烯）</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;frac12; G 针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形管（聚丙烯）</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙滤网</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-0135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-鬼笔环肽</td><td>Life technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>LABCONCO</td><td>II 级，A2 型</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>转子 F-35-6-30，Centrifuge5430</td><td></td></tr><tr><td>透明熔融石英圆形培养皿</td><td>AdValue Technology</td><td>FQ-4085</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>SANYO</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 冷冻容器</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>设计用于调节降温速率的泡沫容器</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>EDX 分析软件</td><td>Oxford Instruments</td><td>AztecSynergy</td><td></td></tr><tr><td>能量色散X射线光谱（EDX）</td><td>FEI</td><td>50mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; X-Max50 SDD</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>VWR</td><td>100496-496</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院和威斯康星大学光学与计算仪器实验室（LOCI）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电感耦合等离子体&lt;br/&gt; 光发射光谱法（ICP-OES）</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 8000</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>VWR</td><td>VistaVision</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（P/S）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.,</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>VWR</td><td>型号 SB70P</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>VWR</td><td>97062-730</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM 450</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>VWR</td><td>76353-728</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>VWR</td><td>T-75, MSPP-90076</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（胰蛋白酶-EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>X射线衍射仪（XRD）</td><td>PANalytical</td><td>Empyrean Series 2</td><td></td></tr></tbody></table>

可降解植入材料研究的直接与间接培养方法 体外

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

在过去的几十年中，可生物降解材料已被广泛研究用于骨科、牙科和颅颌面植入物等生物医学应用。为了筛选适用于生物医学领域的可生物降解材料，有必要从以下方面对这些材料进行评估： 体外 细胞反应、细胞相容性与细胞毒性。国际标准化组织（ISO）标准已广泛应用于生物材料的评价。然而，大多数ISO标准最初是为评估非降解材料的细胞毒性而建立的，因此在筛选可降解材料时具有局限性。 
本文介绍并讨论了三种不同的培养方法，即直接培养法、直接暴露培养法和暴露培养法，用于评估 体外 可降解植入材料（包括可降解聚合物、陶瓷、金属及其复合材料）与不同类型细胞之间的细胞相容性。研究表明，培养方法会影响细胞对可降解材料的反应，因为材料的动态降解会在界面及局部微环境中引起时空差异。具体而言，直接培养法用于揭示直接接种在植入物表面的细胞的反应；直接接触培养法用于阐明已形成的宿主细胞与植入物发生接触时的反应；而暴露培养法用于评估未与植入物直接接触、但受植入物降解所引起的局部环境变化影响的已形成宿主细胞的反应。 
本文提供了这三种培养方法用于研究的示例 体外 可降解植入材料的细胞相容性及其与骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）的相互作用。同时描述了细胞的分离、传代、培养、接种、固定、染色、表征，以及培养后培养基和材料的分析方法。 体外 本文所述方法模拟了不同的情景 体内 环境，拓展了其适用性和相关性 体外 不同生物材料在多种生物医学应用中的细胞相容性测试

图4展示了使用不同培养方法时，在直接接触和间接接触条件下BMSCs的代表性荧光图像。图4A、B显示了BMSCs在与ZC21镁合金直接共培养24小时后，在直接接触和间接接触条件下的细胞状态1。ZC21合金由97.5 wt% 镁、2 wt% 锌和0.5 wt% 钙组成。未与ZC21合金样品直接接触的细胞比与样品直接接触的细胞铺展更好。如图4C、D所示，在经Fe3+离子交联的透明质酸（HyA）水凝胶直接暴露培养24小时后，直接接触和间接接触条件下的细胞均表现出正常形态。然而，间接接触条件下的细胞数量低于直接接触条件下的细胞数量33。另一项研究报道了ZSr41合金（ф = 1.1 mm）降解产物在24小时暴露培养后对BMSCs的影响19。...

我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估 体外 可降解植入材料的细胞相容性。这些 体外 方法模拟不同 在体 细胞-植入物相互作用，并可用于研究多种可生物降解材料。

在过去的几十年中，可生物降解材料已被广泛研究用于骨科、牙科及其他生物医学领域的应用。

用于体外研究可生物降解植入材料的直接与间接培养方法。在过去几十年中，可生物降解材料已被广泛探索用于生物医学领域，例如骨科、牙科以及颅颌面植入物。为了筛选适用于生物医学的可生物降解材料，有必要从体外细胞反应、细胞相容性及细胞毒性等方面对这些材料进行评估。国际标准化组织（ISO）的标准已广泛应用于生物材料的评价。然而，大多数ISO标准最初是为评估非降解材料的细胞毒性而建立的，因此在筛选可降解材料时具有一定的局限性。在本视频中，我们将介绍并讨论三种不同的培养方法，即直接培养法、直接接触培养法和浸提液接触培养法，用于评估可降解植入材料的体外细胞相容性。具体而言，直接培养法用于评估新接种细胞与植入物之间的相互作用。直接暴露培养模拟体内已建立的细胞与植入物之间的相互作用。暴露培养则用于表征当细胞与植入物彼此不直接接触，但处于材料降解的相同环境中时，二者之间的相互作用。本视频展示了使用这三种培养方法研究可生物降解植入材料体外细胞相容性及其与骨髓来源间充质干细胞相互作用的实例。视频中描述的体外方法模拟了体内环境的不同情况，从而拓宽了针对不同生物医学应用中各类材料的体外细胞相容性测试的适用性和相关性。我们遵循加州大学河滨分校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Community）批准的方案进行细胞和组织的获取。细胞培养准备。本视频中介绍的三种培养方法通常适用于不同类型的贴壁细胞。此处将以从断奶大鼠中分离的骨髓间充质干细胞为例，介绍细胞培养的准备工作：从断奶大鼠中分离骨髓来源的间充质干细胞。本图中的示意图展示了从断奶大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）的步骤。去除皮肤、肌肉和结缔组织，解剖出已实施安乐死的大鼠股骨。将股骨置于含有细胞培养基的15 mL锥形管中。将锥形管置于冰上，直到进行细胞提取时取出。在生物安全柜中将骨骼转移至培养皿内。使用手术刀片切除骨骼两端，并用带有25½号针头的注射器吸取细胞培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入50 mL锥形管中。使用70微米滤器过滤细胞悬液，随后在126 × g条件下离心5分钟，以获得细胞沉淀。吸除上清液，并加入10 mL新鲜培养基。用10 mL血清移液管轻轻吹打，重悬细胞。将悬液直接滴加至T-75培养瓶内底部，并添加培养基至总体积为25毫升。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳和95%空气的湿润培养箱中，在标准无菌细胞培养环境下进行培养。培养三至七天后，吸除旧的培养基，加入新鲜培养基以洗去非贴壁细胞。继续用新鲜培养基培养并换液，直至细胞可用于传代、冻存或实验。样品制备与灭菌。在进行细胞培养前，应对所有样品进行灭菌或消毒。不同类型的样品因其材料性质不同，所采用的灭菌或消毒方法也有所不同。通常，使用紫外线辐射对可降解金属进行体外研究前的消毒。细胞培养方法。本图中的示意图展示了直接培养法的步骤。本视频中，以将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养于置于12孔组织培养板孔内的镁基材料板上为例，说明细胞培养方法。使用细胞汇合度达90%的培养瓶，通过血细胞计数板测定细胞悬液中的细胞浓度。使用新鲜培养基将细胞悬液稀释至体外细胞实验所需的预定细胞浓度。将样品置于12孔组织培养板的中央。在无菌条件下，依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以校准渗透压。向每孔中加入3 mL稀释后的细胞悬液，覆盖待测样品。将细胞置于培养箱中，在标准细胞培养条件下培养24小时。示意图展示了直接暴露培养的步骤。根据实验设计中不同细胞类型和预期应用，制备所需细胞浓度的细胞悬液。在无菌条件下，依次用 2 mL PBS 和 2 mL DMEM 冲洗培养板，以校准渗透压。每孔加入 3 mL 稀释后的细胞悬液。将细胞置于湿润培养箱中，在标准细胞培养条件下培养 24 小时，或直至细胞汇合度达到 50% 至 80%。24小时后，使用移液管以PBS冲洗孔板中的细胞，以去除悬浮的死细胞。将已消毒或灭菌的样品直接放置在贴壁细胞上。每孔加入3 mL新鲜培养基。将细胞在标准细胞培养条件下继续培养24小时。本图中的示意图展示了暴露培养法的步骤。细胞准备的初始步骤与直接暴露培养法相同。随后，将样品放入孔径为 0.4 微米的膜插件中，并将含有样品的膜插件放入含细胞的各孔中。在标准细胞培养条件下继续培养细胞 24 小时。培养后对细胞进行表征分析。对于直接培养和直接暴露培养，固定、染色、成像并分析黏附在孔板和样品上的细胞。对于暴露培养，分析黏附在孔板上的细胞。将每孔的培养后培养基收集至相应的15 mL锥形管中，用于后续分析。培养结束后收集所有样品用于进一步分析。用 PBS 将两种样品及培养板上的贴壁细胞冲洗三次。向每孔培养板中加入 1 mL 4% 多聚甲醛。将盖子重新盖回培养板上，使PFA反应20分钟。20分钟后，吸去PFA溶液并将其排入废液瓶中。用PBS清洗培养板三次以去除残留的PFA，并将废液转移至废液瓶。根据制造商说明书配制染色剂的工作液。向每个孔中加入 200 至 400 微升稀释的 Alexa Fluor 488 Phalloidin 染色剂，以覆盖孔板和样品中的细胞。用铝箔纸包裹孔板以避免光照，室温下避光孵育 20 分钟，使 Alexa Fluor 488 Phalloidin 充分反应。收集 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽染色剂，并将其加入相应的废液瓶中。用 PBS 清洗壁板三次，以去除多余的 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽，每次清洗后将用过的 PBS 加入相应的废液瓶中。向每个孔中加入 200 至 400 微升稀释的 DAPI，确保覆盖孔内及样品上的细胞。用铝箔包裹培养板，在室温下避光孵育5分钟。使用PBS清洗培养板三次，并将废液倒入相应的废液瓶中。染色完成后，使用荧光显微镜观察细胞。在获取荧光图像的同时，应尽可能同时采集细胞的相差图像。对可降解样品上的细胞，应在染色后尽快或立即进行成像，以避免或减少因样品持续降解所导致的可能变化。对于直接培养和直接暴露培养，需对两种类型的细胞进行成像和评估。一种是直接与样品接触的样品表面的细胞，另一种是直接与样品接触的样品周围孔板上的黏附细胞，如图所示。进行暴露培养时，如图所示，在拍摄细胞荧光图像时使用图像指南，以确定细胞对样品动态降解梯度的响应是否存在差异。分别对位于内环（距中心3.5 mm）和外环（距中心7 mm）区域内的细胞进行成像和分析。对于每个样本，在培养板中时，从细胞与样本间接接触或在预设距离处非直接接触的兴趣区域，随机选取至少五张图像。从步骤4.3获得的所有细胞图像中，通过测量细胞铺展面积和长宽比来定量分析细胞形态。统计每张图像区域中的细胞数量。在直接和间接接触条件下，以单位面积的细胞数量计算细胞黏附密度。对培养后的培养基和样品进行分析。在自行固定前，收集培养后的培养基。使用预先校准的pH计，在收集后立即测量每个孔中培养后培养基的pH值。在完成上述pH值测量步骤后，收集培养基并根据所需的稀释倍数进行稀释，以获得最佳的离子浓度测定效果。使用电感耦合等离子体-光学发射光谱仪（简称ICP-OES）测量培养后培养基中目标离子的浓度。体外细胞实验后，可生物降解样品的尺寸、质量、表面形貌、微观结构和成分可能发生改变。对培养后样品进行分析有助于理解样品的降解机制。细胞培养结束后，拍摄样品照片以显示样品在尺寸、颜色、形貌及其他可见特征方面的可能变化。将培养后的样品进行干燥或脱水处理，并测量样品的质量、尺寸和体积，以量化其在质量、尺寸和体积方面的变化。使用扫描电子显微镜对样品的微观结构和形貌进行表征。采用能量色散X射线光谱和X射线衍射技术对样品上降解产物的成分和相态进行表征。使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）或衰减全反射（ATR）检测样品表面的化学键合。代表性结果。此处图示为采用不同培养方法时，骨髓来源干细胞在直接接触和间接接触条件下的代表性荧光图像。该图展示了定量细胞黏附密度的示例数据。如图A所示，在24小时直接暴露培养中，与ZC21直接接触的BMSCs其细胞黏附密度显著高于其他任何组。如图B所示，在直接暴露培养的间接接触条件下，ZC21组的BMSC黏附密度显著高于镁组。然而，与T64组和仅细胞对照组相比，差异无统计学意义。图A显示了直接暴露培养和直接培养后培养基的pH值。在直接暴露培养中，所有样本的培养基pH值范围为8.3至8.4。在直接培养中，各组培养基的 pH 值范围为 7.9 至 8。图 B 显示了培养后培养基中的镁离子浓度。在直接暴露培养和直接培养中，ZC21 组和镁组的镁离子浓度均显著高于其他任何对照组。该图显示了ZSr41和纯镁在三天暴露培养后的XRD图谱。观察到不同物相的晶体结构，如镁、氧化锌和羟基磷灰石。其中，图A展示了氧化镁涂层镁、镁基底对照组以及玻璃对照组在与骨髓间充质干细胞直接共培养24小时后的表面元素组成的SEM图像与EDX图谱叠加结果。图B显示了样品表面的定量表面元素组成，表明在细胞培养过程中形成了不同的沉积物。结论：在本视频中，我们介绍了三种不同的体外方法，用于评估基于不同实验设计和预期应用的可生物降解植入材料的细胞相容性。通过直接培养法、直接接触培养法和暴露培养法，可以研究材料与各类细胞之间的相互作用。本视频介绍了用于研究可生物降解材料及其降解产物对多种医用植入物应用中细胞行为影响的关键体外方法。

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可降解植入材料研究的直接与间接培养方法体外

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