可降解植入材料研究的直接与间接培养方法 体外

用于体外研究可生物降解植入材料的直接与间接培养方法。在过去几十年中，可生物降解材料已被广泛探索用于生物医学领域，例如骨科、牙科以及颅颌面植入物。为了筛选适用于生物医学的可生物降解材料，有必要从体外细胞反应、细胞相容性及细胞毒性等方面对这些材料进行评估。

国际标准化组织（ISO）的标准已广泛应用于生物材料的评价。然而，大多数ISO标准最初是为评估非降解材料的细胞毒性而建立的，因此在筛选可降解材料时具有一定的局限性。在本视频中，我们将介绍并讨论三种不同的培养方法，即直接培养法、直接接触培养法和浸提液接触培养法，用于评估可降解植入材料的体外细胞相容性。

具体而言，直接培养法用于评估新接种细胞与植入物之间的相互作用。直接暴露培养模拟体内已建立的细胞与植入物之间的相互作用。暴露培养则用于表征当细胞与植入物彼此不直接接触，但处于材料降解的相同环境中时，二者之间的相互作用。

本视频展示了使用这三种培养方法研究可生物降解植入材料体外细胞相容性及其与骨髓来源间充质干细胞相互作用的实例。视频中描述的体外方法模拟了体内环境的不同情况，从而拓宽了针对不同生物医学应用中各类材料的体外细胞相容性测试的适用性和相关性。我们遵循加州大学河滨分校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Community）批准的方案进行细胞和组织的获取。

细胞培养准备。本视频中介绍的三种培养方法通常适用于不同类型的贴壁细胞。此处将以从断奶大鼠中分离的骨髓间充质干细胞为例，介绍细胞培养的准备工作：从断奶大鼠中分离骨髓来源的间充质干细胞。

本图中的示意图展示了从断奶大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）的步骤。去除皮肤、肌肉和结缔组织，解剖出已实施安乐死的大鼠股骨。将股骨置于含有细胞培养基的15 mL锥形管中。

将锥形管置于冰上，直到进行细胞提取时取出。在生物安全柜中将骨骼转移至培养皿内。使用手术刀片切除骨骼两端，并用带有25½号针头的注射器吸取细胞培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入50 mL锥形管中。

使用70微米滤器过滤细胞悬液，随后在126 × g条件下离心5分钟，以获得细胞沉淀。吸除上清液，并加入10 mL新鲜培养基。用10 mL血清移液管轻轻吹打，重悬细胞。将悬液直接滴加至T-75培养瓶内底部，并添加培养基至总体积为25毫升。

将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳和95%空气的湿润培养箱中，在标准无菌细胞培养环境下进行培养。培养三至七天后，吸除旧的培养基，加入新鲜培养基以洗去非贴壁细胞。继续用新鲜培养基培养并换液，直至细胞可用于传代、冻存或实验。

样品制备与灭菌。在进行细胞培养前，应对所有样品进行灭菌或消毒。不同类型的样品因其材料性质不同，所采用的灭菌或消毒方法也有所不同。

通常，使用紫外线辐射对可降解金属进行体外研究前的消毒。细胞培养方法。本图中的示意图展示了直接培养法的步骤。

本视频中，以将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养于置于12孔组织培养板孔内的镁基材料板上为例，说明细胞培养方法。使用细胞汇合度达90%的培养瓶，通过血细胞计数板测定细胞悬液中的细胞浓度。使用新鲜培养基将细胞悬液稀释至体外细胞实验所需的预定细胞浓度。

将样品置于12孔组织培养板的中央。在无菌条件下，依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以校准渗透压。向每孔中加入3 mL稀释后的细胞悬液，覆盖待测样品。

将细胞置于培养箱中，在标准细胞培养条件下培养24小时。示意图展示了直接暴露培养的步骤。根据实验设计中不同细胞类型和预期应用，制备所需细胞浓度的细胞悬液。

在无菌条件下，依次用 2 mL PBS 和 2 mL DMEM 冲洗培养板，以校准渗透压。每孔加入 3 mL 稀释后的细胞悬液。将细胞置于湿润培养箱中，在标准细胞培养条件下培养 24 小时，或直至细胞汇合度达到 50% 至 80%。

24小时后，使用移液管以PBS冲洗孔板中的细胞，以去除悬浮的死细胞。将已消毒或灭菌的样品直接放置在贴壁细胞上。每孔加入3 mL新鲜培养基。

将细胞在标准细胞培养条件下继续培养24小时。本图中的示意图展示了暴露培养法的步骤。细胞准备的初始步骤与直接暴露培养法相同。

随后，将样品放入孔径为 0.4 微米的膜插件中，并将含有样品的膜插件放入含细胞的各孔中。在标准细胞培养条件下继续培养细胞 24 小时。培养后对细胞进行表征分析。

对于直接培养和直接暴露培养，固定、染色、成像并分析黏附在孔板和样品上的细胞。对于暴露培养，分析黏附在孔板上的细胞。将每孔的培养后培养基收集至相应的15 mL锥形管中，用于后续分析。

培养结束后收集所有样品用于进一步分析。用 PBS 将两种样品及培养板上的贴壁细胞冲洗三次。向每孔培养板中加入 1 mL 4% 多聚甲醛。

将盖子重新盖回培养板上，使PFA反应20分钟。20分钟后，吸去PFA溶液并将其排入废液瓶中。用PBS清洗培养板三次以去除残留的PFA，并将废液转移至废液瓶。

根据制造商说明书配制染色剂的工作液。向每个孔中加入 200 至 400 微升稀释的 Alexa Fluor 488 Phalloidin 染色剂，以覆盖孔板和样品中的细胞。用铝箔纸包裹孔板以避免光照，室温下避光孵育 20 分钟，使 Alexa Fluor 488 Phalloidin 充分反应。

收集 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽染色剂，并将其加入相应的废液瓶中。用 PBS 清洗壁板三次，以去除多余的 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽，每次清洗后将用过的 PBS 加入相应的废液瓶中。向每个孔中加入 200 至 400 微升稀释的 DAPI，确保覆盖孔内及样品上的细胞。

用铝箔包裹培养板，在室温下避光孵育5分钟。使用PBS清洗培养板三次，并将废液倒入相应的废液瓶中。染色完成后，使用荧光显微镜观察细胞。

在获取荧光图像的同时，应尽可能同时采集细胞的相差图像。对可降解样品上的细胞，应在染色后尽快或立即进行成像，以避免或减少因样品持续降解所导致的可能变化。对于直接培养和直接暴露培养，需对两种类型的细胞进行成像和评估。

一种是直接与样品接触的样品表面的细胞，另一种是直接与样品接触的样品周围孔板上的黏附细胞，如图所示。进行暴露培养时，如图所示，在拍摄细胞荧光图像时使用图像指南，以确定细胞对样品动态降解梯度的响应是否存在差异。分别对位于内环（距中心3.5 mm）和外环（距中心7 mm）区域内的细胞进行成像和分析。

对于每个样本，在培养板中时，从细胞与样本间接接触或在预设距离处非直接接触的兴趣区域，随机选取至少五张图像。从步骤4.3获得的所有细胞图像中，通过测量细胞铺展面积和长宽比来定量分析细胞形态。统计每张图像区域中的细胞数量。

在直接和间接接触条件下，以单位面积的细胞数量计算细胞黏附密度。对培养后的培养基和样品进行分析。在自行固定前，收集培养后的培养基。

使用预先校准的pH计，在收集后立即测量每个孔中培养后培养基的pH值。在完成上述pH值测量步骤后，收集培养基并根据所需的稀释倍数进行稀释，以获得最佳的离子浓度测定效果。使用电感耦合等离子体-光学发射光谱仪（简称ICP-OES）测量培养后培养基中目标离子的浓度。

体外细胞实验后，可生物降解样品的尺寸、质量、表面形貌、微观结构和成分可能发生改变。对培养后样品进行分析有助于理解样品的降解机制。细胞培养结束后，拍摄样品照片以显示样品在尺寸、颜色、形貌及其他可见特征方面的可能变化。

将培养后的样品进行干燥或脱水处理，并测量样品的质量、尺寸和体积，以量化其在质量、尺寸和体积方面的变化。使用扫描电子显微镜对样品的微观结构和形貌进行表征。采用能量色散X射线光谱和X射线衍射技术对样品上降解产物的成分和相态进行表征。

使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）或衰减全反射（ATR）检测样品表面的化学键合。代表性结果。此处图示为采用不同培养方法时，骨髓来源干细胞在直接接触和间接接触条件下的代表性荧光图像。

该图展示了定量细胞黏附密度的示例数据。如图A所示，在24小时直接暴露培养中，与ZC21直接接触的BMSCs其细胞黏附密度显著高于其他任何组。如图B所示，在直接暴露培养的间接接触条件下，ZC21组的BMSC黏附密度显著高于镁组。

然而，与T64组和仅细胞对照组相比，差异无统计学意义。图A显示了直接暴露培养和直接培养后培养基的pH值。在直接暴露培养中，所有样本的培养基pH值范围为8.3至8.4。

在直接培养中，各组培养基的 pH 值范围为 7.9 至 8。图 B 显示了培养后培养基中的镁离子浓度。在直接暴露培养和直接培养中，ZC21 组和镁组的镁离子浓度均显著高于其他任何对照组。

该图显示了ZSr41和纯镁在三天暴露培养后的XRD图谱。观察到不同物相的晶体结构，如镁、氧化锌和羟基磷灰石。其中，图A展示了氧化镁涂层镁、镁基底对照组以及玻璃对照组在与骨髓间充质干细胞直接共培养24小时后的表面元素组成的SEM图像与EDX图谱叠加结果。

图B显示了样品表面的定量表面元素组成，表明在细胞培养过程中形成了不同的沉积物。结论：在本视频中，我们介绍了三种不同的体外方法，用于评估基于不同实验设计和预期应用的可生物降解植入材料的细胞相容性。通过直接培养法、直接接触培养法和暴露培养法，可以研究材料与各类细胞之间的相互作用。

本视频介绍了用于研究可生物降解材料及其降解产物对多种医用植入物应用中细胞行为影响的关键体外方法。