原位 急性 离体 胚胎脑切片培养物中轴突生长和生长锥动力学的可视化

轴突如何在复杂的中枢神经系统基质中导航是神经生物学中的一个基本问题。该协议能够通过高分辨率成像研究生理环境中的轴突生长和生长锥动力学。该协议描述了用于在小鼠胚胎大脑中递送DNA的用户友好型端到端管道，高质量有机细胞切片的制备以及用于图像采集和分析的分步指南。

虽然最初设计用于研究胚胎中枢神经系统中的轴突动力学，但该方案可以进行调整，以允许在创伤或病理状况后进行有机细胞培养和轴突可塑性的可视化。协议本身相对简单。然而，实现其第一次标记和保存大脑结构是关键点。

因此，电穿孔、脑解剖和切片步骤需要格外小心。演示该程序将有所帮助，博士生来自Bracket的实验室。麻醉怀孕的雌性小鼠后，用浸泡在温盐水或镊子中的棉签做一个切口，拔出两个子宫角，小心地抓住胚胎之间的空间。

然后将胚胎放在湿纱布上。切开子宫囊后，取出每个胚胎。将胚胎放入含有HBSS的10厘米培养皿中，并在冰上补充葡萄糖。

对于宫外电穿孔，拿起胚胎并将其放入支架中。然后小心地将含有DNA快速绿色混合物的玻璃毛细管通过胚胎头骨插入外心室，并将两至三微升的DNA质粒混合物注入每个心室。接下来，以适当的角度将胚胎的头部保持在铂镊子电极之间，以靶向所需的大脑区域，阴极面向DNA转移的目的区域。

对于子宫电穿孔，如前所述，在拔出子宫角并将胚胎放在湿纱布上后，使用指尖轻轻旋转子宫内的胚胎，直到找到小腿和下垂缝合线。然后小心地将含有DNA快速绿色混合物的玻璃毛细管通过子宫壁和胚胎头骨插入外侧心室，并根据需要将两至三微升的DNA质粒混合物注射到一个或两个心室中，每个心室最多两微升。注射后，以适当的角度将胚胎的头部保持在铂镊子电极之间，以靶向所需的大脑区域，阴极面向DNA转移的区域。

一旦所有必需的胚胎都经过电穿孔，使用盐水浸泡的棉签轻轻地将子宫角放回腹腔内。使用5-0缝合材料缝合肌肉和皮肤切口，然后使用缝合夹固定伤口，并通过喷洒倍他定对伤口进行消毒。将小鼠放回回收笼中，并在手术后使用远红外加热光保持温暖至少20分钟。

在解剖显微镜下固定胚胎的头部。然后沿着中线切除颅骨中的皮肤，从头部底部开始向鼻子切割。横向剥离颅骨中的皮肤，形成足够大的间隙，以便切除大脑。

接下来，为了移除大脑，插入无菌解剖剪刀的闭合尖端，从嗅球下方开始，向脑干移动。然后切掉脑干，修剪大脑周围的许多松散的脑膜。使用穿孔的勺子，拿起大脑，通过将勺子的底部轻拍在干纸巾上来去除多余的液体。

然后将大脑放在冰上的琼脂糖盘中。接下来，使用较小的勺子将琼脂糖混合10秒钟以均匀冷却，然后将大脑操纵到盘子的中间，将其水平放置，背侧朝上，并确保它完全覆盖来自各个方向的琼脂糖。轻轻地从Vibratome工作站上拿起琼脂糖块，并通过轻拍薄纸来干燥底部。

然后将块放在标本支架的胶合区域上，使大脑的喙侧朝上，并将标本支架放在冰上。让胶水干燥一分钟。以15度的角度切成冠状切片的大脑。

然后使用干净的刮刀，收集脑切片并将其放在使用Parrafin固定在35毫米玻璃底培养皿中的PTFE膜上。每层膜最多收集五片脑切片。接下来，使用200微升移液管从膜上切片周围去除多余的HBSS葡萄糖溶液，使切片半干燥，然后将500微升预热切片培养基直接加入膜下的空间中，并在35摄氏度下用5%二氧化碳孵育切片。

对于轴突生长成像，定位具有低至中等细胞密度的皮层区域。而对于生长锥动力学的成像，在皮质的直接区域或室下区域定位生长锥。接下来定义 Z 堆栈大小。

对于大型 Z 堆栈中的轴突生长，将步长设置为 2 微米;对于较小 Z 堆栈中的生长锥，将步长设置为 1 微米。对于数据分析，请在斐济打开图像文件，方法是单击文件，然后打开并选择图像。通过单击图像，然后单击堆栈，Z投影和最大强度投影，获得时间流逝的最大强度投影。

通过时间流逝并找到一个不断增长的轴突。定位后，在不断增长的轴突上画一条线，从第一帧中轴突的尖端开始，并在整个时间流逝中跟随轴突。接下来，唱插件kymo重新切片宽。

通过转到图像，然后转到属性来设置kymograph的比例。设置距离（以微米为单位）、像素宽度和时间（以秒或分）以及像素高度后，转到分析并单击”测量”。要测量生长锥的体积，请在图像分析软件中打开图像文件，方法是单击文件，打开并选择感兴趣的文件。

然后，在步骤 1 中选择添加新曲面向导，在算法设置下，仅选择分割感兴趣的区域，然后在步骤 2 中裁剪帧以适合所有帧中的整个生长锥。接下来在步骤三中，将阈值保持在绝对强度，在第四步中，确保整个生长锥区域被阈值。然后在步骤五中，在过滤器类型下选择LMG的体素数为1。

选择执行按钮以执行所有创建步骤并终止”添加新曲面”向导。最后，在向导窗口顶部的统计选项卡中，选择详细选项卡下的特定值和交易量。通常，成功培养的源自子宫内或宫外电穿孔的脑切片显示正常的细胞分布和具有顶端导向的毛孔接触过程的有组织的桡骨神经胶质细胞阵列。

偶尔观察到宫外电穿孔，在桡骨胶质支架和培养的脑切片中观察到紊乱，因此可以推荐这种对照染色。这里显示了表达Lyn-mNeonGreen的代表性锥体皮质投射神经元及其生长锥体的动态行为。此外，使用表达质粒的肌动蛋白探针标记神经元，以原位分析轴突生长锥的肌动蛋白动力学。

还使用表达质粒设计的双cre dre荧光团进行原位实验，其中tRFP或ZsGreen荧光团可以分别由dre或cre重组酶特异性和单独地激活，在相邻神经元中。从Kymographs中，可以轻松获得动态生长参数，例如几个轴突的生长速度和生长锥体积随时间的变化。这可用于评估肌动蛋白跑步机的速度以及生长锥探索活动期间丝状体和薄片之间的平衡。

重要的是要保持大脑结构并微调质粒浓度以实现稀疏标记。这对于皮层中轴突和生长锥的准确可视化至关重要。根据所选的血浆和遗传背景，该协议允许用户修改神经元或其生长的环境，从而允许进行广泛的研究。

通过实现对原位神经元的高分辨率访问，该技术使神经科学家能够在形态学和分子水平上询问生长锥与中枢神经系统指标之间的动态相互作用。