Name: 原位 急性 离体 胚胎脑切片培养物中轴突生长和生长锥动力学的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解小鼠胚胎脑切片中轴突生长和生长锥动力学的高分辨率成像方法。该方案通过电穿孔递送DNA，结合器官型切片制备，为研究中枢神经系统轴突导航机制提供可靠的实验框架。

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我们感谢 Maria Eugenia Bernis 为实验操作拍摄照片。同时感谢 Emily Burnside、Emily Handley、Thorben Pietralla、Max Schelski 和 Sina Stern 对稿件的阅读与讨论。我们衷心感谢出色的技术助理 Jessica Gonyer、Blanca Randel 和 Anh-Tuan Pham。感谢德国神经退行性疾病中心（DZNE）光学显微镜平台和动物实验设施提供的宝贵支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG）、国际截瘫研究基金会（IRP）以及 Wings for Life（资助对象：F.B.）提供资助。F.B. 是卓越集群 ImmunoSensation2、SFBs 1089 和 1158 的成员，并获得 Roger De Spoelberch 奖。

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
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<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
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<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
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<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
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<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
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<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生长锥如何感知其周围环境并作出反应，以协调轴突的同步延伸与导向，目前仍存在争议3,18在二维基质上的开创性研究揭示了轴突形成、生长和导向过程中驱动生长锥动态变化的力所产生的基本分子机制2,10,11,12,19. 最近在三维基质中的研究表明，第三个维度对生长锥的行为以及轴突生长具有多大的影响8,9然而，指导生长锥动态的复杂机制 体内 仍有待深入研究。
制备IUE或EUE脑组织的器官型脑片培养已被广泛使用并有充分文献记录。该技术已成为研究活体脑组织中神经元发育与行为的金标准20,21。事实上，该方法已成功结合多种高分辨率成像技术，用于原位可视化特定的分子过程和形态学事件in situ。此类研究包括但不限于轴突的形成与延伸19,22、皮层神经元迁移19,22,23,24、中心体动态25,26、微管动态27，以及突触前和突触后区室的功能动态28,29。
该方案填补了实验神经生物学领域的一项空白，实现了对发育中皮层神经元生长锥动态的可视化观察 原位，在 离体 急性脑切片培养，以及用于分析所获数据的工具。
急性脑切片培养被用于建立本方案，因为它们（1）经过一定练习后易于制备；（2）提供了一个便于研究嵌入于组织中的生长锥的可及性系统 准-完全地-生理环境，同时具有足够的透明度以实现高分辨率的活细胞成像；（3）可扩展用于多种转基因小鼠品系；（4）结合宫内电转染（IUE）或胚胎外电转染（EUE），几乎可无限拓展分子工具的递送能力，用于评估生长锥和轴突的功能表现 体内 在功能缺失/获得条件下，结合荧光报告基因和细胞骨架探针。
该方法学在电穿孔胚胎脑室（EUE）和宫内电穿孔（IUE）两种背景下均有描述。尽管EUE仍是一种高度可靠的方法，但与采用IUE作为递送方式相比，使用EUE导致获得的脑切片中放射状胶质细胞（RG）网络紊乱的发生率升高（图4C）。RG结构排列的紊乱会显著影响神经元迁移以及轴突延伸的模式30,31。这些是预测在特定时间点何处可找到用于分析的轴突、以及轴突所处微环境类型的关键参数。RG网络显著受损的脑切片通常表现出皮层神经元层状结构形成障碍，进而导致轴突走向混乱。因此，强烈建议对RG网络的结构完整性进行评估和控制。值得注意的是，结构完整性较差与胚胎脑组织年龄增加相关。事实上，在较年轻的E12.5-E13.5胚胎中通常未观察到此类效应19。
本方案详尽且易于操作。然而，为获得最佳结果，有几个关键步骤必须格外谨慎并加以注意。这些步骤已在方案中明确指出，包括：（1）调整电穿孔时所用DNA的用量以实现稀疏标记；（2）在脑组织提取过程中避免损伤；（3）控制包埋脑组织时琼脂糖的温度；（4）针对特定年龄的脑组织调试最适琼脂糖浓度；以及（5）荧光染料的选择，相关经验如下所述。在方案优化过程中，对多种荧光染料在活细胞中的性能进行了评估 原位 成像测试中，本方案选用单体GFP变体EGFP和NeonGreen用于制备LifeAct标记和Lyn标记的质粒（图 5A，B）。此外，还测试了RFP变体mScarlet，发现其在此实验体系中非常适用（数据未显示）。多聚体tRFP（二聚体）和ZsGreen（四聚体）（图5C 和 补充视频 1， 右侧）也进行了测试。当方法要求在DNA递送后快速产生荧光信号时，推荐使用这些快速折叠且超亮的荧光蛋白。
在使用脑片培养时，常见的做法是利用来自不同大脑的脑片来测试对照和实验条件，这会带来固有的、不必要的变异性。本文采用了一种表达系统，可对相邻神经元进行独立修饰，并通过报告基因表达实现细胞识别。需要注意的是，在本示例中（图5C），表达两种不同荧光蛋白的神经元之间并无差异。然而，举例而言，将此类质粒混合物与携带Cre敏感基因的转基因小鼠品系结合使用时，tRFP（Dre敏感）将标记保持为野生型的神经元，而ZsGreen（同样为Cre敏感）则标记发生基因重组的神经元。因此，可在同一脑片内同时并列研究两种不同基因型（以及可能的不同表型）的生长锥。
用于分析的轴突和生长锥的定位是一个重要考虑因素。皮层神经元在从脑室区（VZ）向皮层板（CP）进行放射状迁移的过程中发生极化。在此过程中，神经元形成一个前端突起（未来的树突）和一个将发育为轴突的尾端突起，最终这些尾端突起会加入中间区（IZ）中的先锋轴突，建立轴突束32。因此，为了捕获轴突生长锥，成像操作在IZ区的轴突纤维上进行，包括从CP区延伸出的轴突以及早期生成且已与轴突束相关联的轴突；或者最终，在横穿IZ区并延伸至其下方的纤维中进行（图7）。
本方案使得在器官型脑片中对神经元进行超分辨率成像成为可能。传统上，对较厚样本成像时，光散射是一个显著问题。在过去的二十年中，光学技术取得了广泛进展，使得对厚样本的成像成为可能。本研究中使用了长工作距离物镜，以更好地观察生长锥等较小结构。不可避免的是，本方案无法捕捉到逆行性肌动蛋白流或微管动力学等更精细的事件。长工作距离物镜需要较低的数值孔径（NA），但能够保留来自厚切片的信息。然而，该方案也可适配于工作距离较短的物镜。这需要将脑片平稳转移至玻璃底培养皿中，以保持结构完整性。但采用此方法会导致存活时间缩短——约15小时——这是由于气体交换丧失所致（数据未显示）。与二维培养不同，三维环境中的生长锥占据更大的体积，且需要在z轴方向进行运动伪影校正。为了增强对精细事件的成像能力，必须采用现代共聚焦技术。因此，建议使用快速扫描的z轴堆栈电机，例如高灵敏度共聚焦显微镜上配备的z-Galvo系统33。
值得注意的是，本方案存在三个主要局限性。首先，通常难以控制任何给定质粒的表达水平/表达细胞数量 体内这会导致即使在保持相同质粒浓度的情况下，所有切片之间仍存在变异性。因此，必须预先谨慎选择所用表达载体中的调控元件。其次，目前尚无法利用膜插件对精细事件进行成像。这一限制可通过前一段中提出的方法学改进加以克服。最后，生长锥对光极为敏感，容易迅速发生光漂白。因此，使用激光扫描显微镜对生长锥进行频繁成像，即使仅持续5分钟，也常常导致生长锥塌陷。在这方面，可采用基于光片显微技术的新型成像设备，以实现对脑切片的长期成像34.
此类方案有望开辟新的研究途径，使人们能够更深入地理解生长锥识别并响应复杂信号所需的关键因素 在体 环境，更重要的是，揭示这种复杂相互作用的机制。

神经元是高度极化的细胞，构成了神经系统的基本计算单元。它们接收和传递信息，这一过程依赖于输入和输出区域的区室化：分别为树突和轴突1。在发育过程中，轴突在延伸的同时需穿越极为复杂的环境以到达其目标位置。轴突的导航由生长锥引导，生长锥是位于发育中轴突末端的一种感觉结构。生长锥能够感知外界环境信号，并将其转化为细胞骨架的动态空间重组2,3。由此产生的形态-力学反应指示生长锥朝向或远离刺激信号延伸或回缩，从而引导轴突执行特定的运动行为。
目前对轴突延伸和生长锥动态的理解主要源于在二维（2D）基底上评估轴突生长的研究2,4,5,6,7这些开创性研究揭示了生长锥与生长基质之间复杂的相互作用，并发现这种相互作用会因基质特性（如黏附性和刚度）的不同而表现出显著差异。8,9基于这些发现，研究人员认为细胞外环境信号可决定轴突生长，而生长锥细胞骨架则执行这一生长过程。2,10,11,12值得注意的是，神经元可以在非黏附性基质（如多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸）上延伸轴突。13此外，基质刚度可独立于细胞黏附复合物影响轴突生长速率8因此，仅在二维基质上研究生长锥动态无法准确模拟轴突生长锥与生理相关的三维（3D）环境相互作用时所产生的力的平衡，例如在体内所存在的那些环境 体内.
为了克服二维检测方法的局限性，已有研究在三维基质中探讨轴突生长及生长锥动态8,9。这些基质提供了更接近生理状态的环境，同时仍允许研究轴突生长的细胞内在机制。该方法能够在多种条件下以单细胞方式观察生长锥，并适用于药理学干预9。在此类三维环境中，轴突表现出独特的细胞骨架动态，并且生长速度较二维培养的神经元更快9。这些精巧的研究揭示了额外空间维度对生长锥细胞骨架重排及其行为的影响。
尽管三维基质在支持类似天然的神经元发育和轴突生长方面相较于二维表面具有明显优势，但其仍是一种简化的合成支架，无法反映中枢神经系统（CNS）组织中所观察到的动态复杂性。此处通过递送报告质粒 子宫外 和 在子宫内 电穿孔与脑组织器官型切片培养相结合，并 原位 活细胞超分辨率成像以在生理环境下分析生长锥动态。该方法可在轴突发育过程中呈现其三维结构特征的可视化效果。 体内 环境及其理化组成的复杂性。最后，介绍了使用常见授权且公开可获取的软件来测量轴突生长和生长锥动态的用户友好型操作流程。

<table><tbody><tr><td>Adson 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>山羊抗小鼠</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>山羊抗小鼠</td></tr><tr><td>抗波形蛋白抗体</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>V2258-.2ML</td><td>单克隆小鼠，克隆株 LN-6，腹水液</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP 琼脂糖</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol，喷雾剂&amp;uuml;hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（Temgesic）</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ 通用电极拉制仪</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>安第斯山脉</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2速型号</td></tr><tr><td>恩诺沙星（Baytril）</td><td>拜耳</td><td>3543238</td><td>2.5%（wt/vol）</td></tr><tr><td>Eppendorf 微量移液器加载吸头</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>染料含量 &amp;ge; 85 %</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/直刃/9厘米</td></tr><tr><td>FluoroDish 细胞培养皿</td><td>世界精密仪器公司</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片介质</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>钙，镁，无酚红</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>等渗盐水溶液</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S 振动切片机</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 配备 Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>美达佳</td><td>Venusberg 药房</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>微型阿德森镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器储存罐</td><td>世界精密仪器公司</td><td>E210</td><td>&amp;nbsp;16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/zh-cn/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养小室</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&amp;nbsp;毫米，亲水性聚四氟乙烯，0.4&amp;nbsp;&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Moria 穿孔勺</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基（不含酚红）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 补充剂</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar持针器配剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-α-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-α-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-α-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>世界精密仪器公司</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>铂金镊子电极</td><td>哈佛仪器</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>反射性伤口闭合夹</td><td>世界精密仪器公司</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Pattex 迷你三件装瞬间胶</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>方波电穿孔系统 ECM830</td><td>哈佛仪器</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>无菌润滑眼膏</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 外科丝线缝合线</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-8 孔玻璃底板</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

在神经元发育过程中，轴突在皮层环境中穿行，以到达其最终目标位置并建立突触连接。这一过程由位于发育中轴突远端的感知结构——生长锥——来执行。研究生长锥的结构与动态对于理解轴突发育及其与周围中枢神经系统（CNS）的相互作用至关重要，这些相互作用使神经元能够形成神经回路。在基础研究和临床前研究中，若需设计方法使损伤后的轴突重新整合入神经回路，此类研究尤为关键。迄今为止，对生长锥动态的普遍认知主要基于在二维（2D）培养条件下培养的神经元研究。尽管2D培养研究无疑为当前关于生长锥结构动态及其对刺激反应的知识奠定了基础，但其无法真实再现完整中枢神经系统组织中生长锥所处的生理三维（3D）环境。近年来，研究人员采用胶原凝胶以部分克服这些局限性，实现了在3D环境中对神经元发育的探究。然而，无论是合成的2D还是3D培养环境，均缺乏中枢神经系统组织内引导发育中轴突延伸与路径选择的信号分子。本实验方案提供了一种利用脑组织切片研究轴突与生长锥的方法，在该模型中，发育中的轴突可接触到生理相关的物理与化学信号。通过精细调控 在子宫内 和 子宫外 通过电穿孔技术稀疏递送荧光报告分子，并结合超分辨率显微镜，本方案提供了一种用于可视化轴突及生长锥动态的方法学流程 原位此外，还包括对长期和活细胞成像数据进行分析的详细工具包说明。

采用所述方法流程获得的代表性结果如图所示。本演示中使用了E15.5小鼠，但该方案可轻松适用于从E11至E17晚期的几乎所有胚胎发育阶段。在本方案中，可选择使用 子宫外 电穿孔（EUE； 图 2A, 2C-I）或 在子宫内 电穿孔IUE； 图 2B，C，和 2J-Q) 用于将质粒递送至侧脑室壁的前体神经元。这些前体细胞是未来皮层投射神经元（CPN）的来源。15,16质粒混合物用于驱动稀疏神经元特异性表达膜靶向（Lyn）-mNeonGreen图1A）或 LifeAct 增强型 (E)GFP（图1B) 分别用于评估生长锥的整体行为和肌动蛋白动态。此外，使用质粒混合物对单个神经元进行标记，标记物为 turbo(t)-RFP 或 zoanthus sp. (Zs) 绿色荧光蛋白（ZsGreen）图1C）被纳入观察，这有助于监测独立邻近神经元的生长锥行为。
从电转染胚胎中解剖脑组织是获得高质量脑切片、保持脑组织天然结构的关键步骤，需谨慎操作。解剖器械和振动切片机需提前准备，并用乙醇仔细灭菌（图3A，B）。随后，小心解剖电转染胚胎的头部并取出脑组织。此处展示了在E15（图3C-F）和E12.5（图3G-J）进行子宫内电穿孔（EUE）处理的胚胎脑组织代表性解剖过程。脑组织取出后立即包埋于琼脂糖基质中，切片后置于底部为玻璃的培养皿内的聚四氟乙烯（PTFE）膜插入物上进行孵育（图3K-M）。
脑片的健康状态是确保实验结果可靠的关键控制点。每天需进行肉眼检查以排除任何污染。此外，在培养结束后，脑片会被固定并进行免疫组织化学染色。本实验中使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来评估整体细胞排列情况，使用波形蛋白（vimentin）染色来观察胶质细胞的组织结构，特别是放射状胶质细胞（RG）支架的结构。通常情况下，无论是经IUE还是EUE处理后成功培养的脑片，其DAPI染色均显示正常的细胞分布，且放射状胶质细胞排列相对有序，具有朝向顶面并与软脑膜接触的突起结构17（图4A和4B）。然而，偶尔也可在培养的脑片中观察到RG支架明显紊乱的情况，尤其是在经EUE电穿孔处理的样本中（图4C）。RG支架严重紊乱的脑片常表现出神经元迁移障碍和轴突发育缺陷（未展示）。因此，对RG支架结构的检测是一种简便的培养后筛选方法，可用于甄别来自可靠脑片的实验数据。
通过子宫内电穿孔（IUE）或子宫外电穿孔（EUE）将表达Lyn-mNeonGreen质粒混合物导入后获得的脑切片，均可实现相似的稀疏神经元标记。图中展示了一个表达Lyn-mNeonGreen的典型锥体细胞皮层投射神经元及其生长锥动态行为的示例（图 5A 和 补充视频 1， 左上角）。此外，使用表达肌动蛋白探针的质粒标记神经元，以分析轴突生长锥的肌动蛋白动态 原位 (图5B 和 补充视频 1， 左下角 原位 实验还采用了双-Cre/Dre荧光蛋白表达质粒设计（图1C 和 补充视频 1，右侧）。该质粒中的 tRFP 或 ZsGreen 荧光蛋白可分别被邻近神经元中的 Dre 或 Cre 重组酶特异性且独立地激活（图 5C）。这种实验设计能够对对照神经元与邻近的经修饰神经元（特定的功能获得或功能缺失）的生长锥进行并列分析，从而避免因使用不同脑片来测试对照与实验条件所导致的变异性。
从录制的视频生成的明场显微图像序列（kymograph）可进行分析，从而轻松获得诸如随时间变化的突出活动和生长长度等动态生长参数（图6A）。需要注意的是，通过简单调整延时成像的时间分辨率，即可测量轴突延伸速度，持续时间为2 h（图6A）。此外，生长锥体积随时间的变化——作为评估生长锥总体动态活性的一个指标——也可便捷获取，本实验中使用了授权软件进行分析（图6B 和 图6E、F）。该参数可用于评估肌动蛋白踏车运动的速度以及生长锥探索过程中丝状伪足与片状伪足之间的动态平衡。
<img alt="基因编辑示意图；Cre/Dre 重组酶方法；真核启动子功能；GFP 表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：本实验方案中所用质粒的示意图。 （A）pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen。（B）p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP。（C）pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA。质粒组件及荧光蛋白来源的相关信息见图中框注部分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="电穿孔实验装置：离体和体内技术，包括设备与实验步骤" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：工作流程 子宫外 和 在子宫内 E15.5小鼠的电穿孔 (A手术站的设置 子宫外 电穿孔。B手术站的设置 在子宫内 电穿孔。C) 将麻醉小鼠的子宫角拉出腹腔外。D从子宫囊中提取胚胎。E通过完全性脊髓横断进行胚胎处死 通过 一条斜切口；注意避免了断头。F将胚胎置于固定装置中，并将DNA/快绿混合物注射到左侧侧脑室。G,H) 将胚胎头部置于铂金镊电极之间，阴极（红色箭头）位于大脑皮层上方 60° 角度。 (I) 将胚胎的臂部（黑色箭头）置于固定器外侧，以防止操作过程中胚胎滑动。J) 胚胎在子宫囊内旋转以暴露头部。K,L通过子宫壁将DNA/快绿混合物注射到胚胎的侧脑室中。M将胚胎头部置于铂镊电极之间，使阴极（红色箭头）位于大脑皮层上方 60° 角度。N缝合的肌肉切口 通过 连续锁边缝合。O缝合的皮肤切口 通过 间断缝合。P使用外科伤口夹固定伤口，并用聚维酮碘进行消毒。Q) 将小鼠放置于恢复笼中，并使用远红外加热灯保暖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="脑组织提取与器官型培养设置；显微图像显示胚胎脑解剖过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：E15.5 和 E12.5 胚胎脑的提取及器官型脑片培养流程。（A）用于脑组织提取的工具。（B）器官型培养工作站的设置。（C–F）E15.5 胚胎脑的提取过程。（G–J）E12.5 胚胎脑的提取过程。虚线标示切口位置，红色箭头指示镊子牵拉方向。（K）将脑组织包埋于含有 3% 低熔点琼脂糖的 3 cm 培养皿中，使脑下方保留 1–2 mm 的琼脂糖间隙。（L）收集厚度为 150 µm 的脑片。（M）将脑片转移至聚四氟乙烯（PTFE）膜插件上，该插件由石蜡膜（蓝色箭头）固定于 35 mm 培养皿中。红色星号标记表示由振动切片机获得的脑片（L）及其转移至 PTFE 膜的过程（M）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电穿孔方法比较；波形蛋白，DAPI染色；显微镜示意图；神经元分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：健康器官型脑片中保守的放射状胶质细胞结构。 E17.5 胚胎脑切片的共聚焦图像，显示经颅内电穿孔（IUE）（A）和胚胎外电穿孔（EUE）（B,C）后放射状胶质细胞排列（波形蛋白，绿色）及整体细胞结构（DAPI，品红色）。注意EUE偶尔可能引起放射状胶质细胞排列的明显紊乱（C）。放大区域对应主图中红色虚线框所示部分：比例尺，10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="荧光显微镜观察神经元，tRFP/ZsGreen标记，显示细胞骨架结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5: 原位 急性器官型脑片中生长锥动态的可视化 (A，B神经元及其相应的生长锥分别以 Lyn-mNeonGreen 和 LifeAct-GFP 标记。红色星号标记表达 Lyn-mNeonGreen 的神经元的生长锥。蓝色星号标记表达 LifeAct-GFP 的神经元的生长锥。C) 利用包含 tRFP（品红色）和 ZsGreen（绿色）的双质粒系统标记的邻近神经元及其相应的生长锥。右侧所示的生长锥图像位于左侧捕获视野之外，图像采集时间紧随生长锥延时成像之后；比例尺， 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Lyn-mNeonGreen 轴突生长分析；荧光显微镜、生长速度图、体积图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：轴突生长速度与生长锥体积的分析。 （A）表达 Lyn-mNeonGreen 的神经元上的轴突追踪（上图）及其使用 ImageJ 生成的相应线扫图（下图）。（B）使用图像分析软件对生长锥的 z 层叠视频进行重建（上图），以及使用表面测量工具高亮显示的同一生长锥（下图）。（C）显示多根轴突随时间变化的生长速度曲线图。（D）图（C）中轴突的平均生长速度的量化结果。（E）显示生长锥体积随时间变化的曲线图。（F）图（E）中生长锥平均体积的量化结果；比例尺，5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元迁移示意图；从VZ到CP；大脑发育过程；神经元定位；研究工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 7"> 
图7：锥体皮层神经元的放射状迁移与神经元极化。 示意图展示正在发育的锥体皮层神经元（粉色）从生发性脑室区（VZ）沿放射状胶质细胞突起（灰色）向软脑膜表面进行放射状迁移。迁移过程中，具有极性的神经元形成前端突起（未来的树突）和尾端突起（未来的轴突），并持续向中间带（IZ）延伸。红色虚线框表示成像所观察的皮层区域，具体位于中间带（IZ）、脑室下区（SVZ）或轴突束汇合处（绿色）。该插图使用基于网络的绘图工具 BioRender.com 制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质粒</td>
			<td>浓度 (µg/µL)</td>
			<td>预期用途</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">标记膜定位蛋白（Lyn）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>生长锥中丝状肌动蛋白（F-actin）标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">对相邻的两群神经元进行独立标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中使用质粒的列表。 各质粒的名称、浓度及其预期用途。
补充视频 1：急性器官型脑片中生长锥动态的原位可视化。 使用 Lyn-mNeonGreen（左上）和 LifeAct-GFP（左下）标记的生长锥动态。相邻的生长锥通过包含 tRFP（品红色；右上）和 ZsGreen（绿色；右下）的双质粒系统进行差异标记。成像时间间隔为 2.5 秒。比例尺为 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体 生理学相关的急性脑切片，并提供用户友好的分析流程。

在神经元发育过程中，轴突在皮层环境中迁移，以到达其最终目标位置并建立突触连接。生长锥……

轴突如何在复杂的中枢神经系统基质中导航，是神经生物学中的一个基本问题。本方案能够在生理环境中通过高分辨率成像研究轴突生长及生长锥动态。本方案描述了一种操作简便、从头到尾的完整流程，用于向小鼠胚胎脑内递送DNA，制备高质量的器官型脑片，并提供了图像采集与分析的逐步操作指南。尽管该方案最初旨在研究胚胎中枢神经系统中的轴突动态，但也可经过调整，用于在创伤性或病理性条件下进行轴突可塑性的器官型培养与可视化观察。该方案本身相对简单，但实现首次标记及脑结构的保存是其中的关键步骤。因此，电穿孔、脑组织解剖和切片步骤需要格外小心。演示该操作过程将非常有帮助，该博士生来自 Bracket 的实验室。将怀孕雌鼠麻醉后，用浸有温盐水的棉签或镊子切开腹腔并拉出两侧子宫角，小心夹取胚胎之间的间隙。然后将胚胎置于湿润的纱布上。切开子宫囊后，取出每个胚胎，并将其放入含有葡萄糖并置于冰上的HBSS溶液中的10厘米培养皿中。进行离体电穿孔时，取出胚胎并将其放入固定装置中。然后，将含有DNA快绿混合液的玻璃毛细管小心地穿过胚胎颅骨插入侧脑室，并向每个脑室注射两到三微升的DNA质粒混合液。接着，用铂金镊状电极以适当角度夹住胚胎头部，以靶向目标脑区，其中阴极朝向预期进行DNA转移的区域。进行子宫内电穿孔时，参照先前方法取出子宫角并将胚胎置于湿润的纱布上后，用手指轻轻旋转子宫内的胚胎，直至定位到顶枕缝和矢状缝。然后，将含有DNA快绿混合物的玻璃毛细管小心地穿过子宫壁和胚胎颅骨，插入侧脑室，并根据需要向一个或两个脑室注射两到三微升的DNA质粒混合物，每个脑室最多注射两微升。注射后，用铂金镊状电极夹住胚胎头部，调整至适当角度，使阴极朝向预期进行DNA转移的脑区，以精准靶向目标脑区。在完成所有所需胚胎的电转染后，使用浸有生理盐水的棉签轻轻将子宫角放回腹腔内。使用5-0缝合线缝合肌肉和皮肤切口，然后用缝合夹固定伤口，并用碘伏喷洒伤口进行消毒。将小鼠放回恢复笼中，并在术后至少20分钟内使用远红外加热灯保持其体温。在解剖显微镜下固定胚胎头部。然后从头部基部向鼻部沿中线切开，去除颅骨上的皮肤。将颅骨处的皮肤向两侧剥离，形成足够大的开口，以便取出脑组织。接下来，用无菌解剖剪的闭合尖端从嗅球下方开始，朝脑干方向插入，以取出脑组织。然后剪断脑干，并修剪脑周围许多松散的脑膜组织。使用带孔的勺子将脑组织拾起，并通过将勺子底部轻压在干燥的纸巾上，去除多余的液体。然后将脑组织置于冰上的琼脂糖培养皿中。接着，使用较小的勺子轻轻搅拌琼脂糖10秒钟，使其均匀冷却；随后将脑组织移至培养皿中央，使其背侧朝上水平放置，并确保琼脂糖从各个方向完全覆盖脑组织。轻轻从振动切片机工作台上拿起琼脂糖块，用纸巾轻拭底部以吸干水分。然后将组织块放置在样本托的黏合区域，脑部的吻侧朝上，并将样本托置于冰上。静置使胶水干燥一分钟。以15度的角度对脑组织进行冠状切片。然后使用洁净的刮铲收集脑切片，并将其放置在聚四氟乙烯（PTFE）膜上，该膜通过石蜡固定于35毫米玻璃底培养皿中。每张膜上最多放置五片脑切片。接着，使用200微升移液器吸除膜上切片周围多余的HBSS葡萄糖溶液，使切片保持半干燥状态，随后直接向膜下方空间加入500微升预热的切片培养基，并将切片在35摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。进行轴突生长成像时，选择细胞密度较低至中等的皮层区域；而进行生长锥动态成像时，则选择位于皮层邻近区域或室下区的生长锥。接下来定义Z轴扫描范围的大小。对于大范围Z轴堆栈中的轴突生长，设置步长为2微米；对于小范围Z轴堆栈中的生长锥，设置步长为1微米。进行数据分析时，通过点击“文件”，然后选择“打开”，并选中图像，以在Fiji中打开图像文件。通过点击“图像”，接着选择“堆栈”、“Z轴投影”和“最大强度投影”，获得时间序列图像的最大强度投影。浏览时间序列图像，找到一条正在生长的轴突。找到后，在生长的轴突上画一条线，从第一帧中轴突的顶端开始，贯穿整个时间序列图像中的轴突路径。接着，运行插件 kymo re-slice wide。通过进入图像，然后属性来设置图示的比例尺。设置微米距离、像素宽度以及以秒或分钟为单位的时间和像素高度后，进入分析并点击测量。要测量生长锥的体积，通过点击文件、打开，并选择目标文件，在图像分析软件中打开图像文件。然后，在第一步中选择“添加新表面”向导，在算法设置下选择“仅分割感兴趣区域”，在第二步中裁剪帧以使所有帧中的整个生长锥均被包含。接下来在第三步中，将阈值设定为绝对强度，在第四步中，确保整个生长锥区域均被阈值化。然后在第五步中，在滤波器类型下将LMG体素数量设置为1。单击执行按钮以执行所有创建步骤，并结束“添加新表面”向导。最后，在向导窗口顶部的统计选项卡中，于详细选项下选择特定值和体积。通常，通过子宫内或子宫外电穿孔获得的成功培养的脑片显示出正常的细胞分布，以及排列有序、具有顶端朝向并与纤毛接触的放射状胶质细胞。偶尔在离体电穿孔后会观察到放射状胶质细胞支架出现紊乱，并可观察到培养的脑片，因此建议进行此对照染色。此处展示了一个表达Lyn-mNeonGreen的皮层投射锥体神经元及其生长锥动态行为的代表性图像。此外，还使用表达肌动蛋白探针的质粒对神经元进行标记，以原位分析轴突生长锥的肌动蛋白动态。还使用了一种双重组酶（cre/dre）荧光报告质粒设计进行了原位实验，该设计可在相邻神经元中分别由dre或cre重组酶特异性且独立地激活tRFP或ZsGreen荧光蛋白。通过明场图像的时间序列（kymograph），可轻松获得多根轴突的生长速度以及随时间变化的生长锥体积等动态生长参数。这些参数可用于评估肌动蛋白踏车运动的速度，以及生长锥探索活动中丝状伪足与片状伪足之间的动态平衡。维持脑组织结构并精确调整质粒浓度以实现稀疏标记至关重要，这对于准确观察大脑皮层中的轴突和生长锥尤为关键。根据所选的质粒和遗传背景，本实验方案允许研究人员对神经元或其生长环境进行修饰，从而支持多种多样的研究应用。通过实现对原位神经元的高分辨率观察，该技术使神经科学家能够在形态学和分子水平上探究生长锥与中枢神经系统指标之间的动态相互作用。

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在体可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

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