胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型
2021年10月28日
本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。
本方案描述了建立携带原发性骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型的技术。通过将骨肉瘤细胞注射至胫骨内，该模型能够最大程度地模拟肿瘤性骨肉瘤的临床发展特征。使用微量注射器将精确数量的骨肉瘤细胞直接注入胫骨，可实现一致的肿瘤形成率和肿瘤体积。
在注射骨肉瘤细胞当天，用 PBS 清洗细胞两次。加入 1.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，然后加入 6 毫升含 10% 血清的 MEM 培养基。
将细胞收集到15毫升离心管中。吸取20微升细胞悬液至细胞计数板的计数室中，使用自动细胞计数仪计算细胞浓度。在室温下以800 × g离心5分钟。
用移液器吸去上清液，将细胞沉淀重悬于8.5毫克/毫升的基底膜基质中，并置于冰上。将小鼠置于仰卧位。用拇指和食指固定小鼠踝部，用70%乙醇棉片消毒胫骨注射部位。
将每只小鼠的踝关节向外旋转，以移动胫骨和腓骨，并将膝关节弯曲至合适位置，直至通过皮肤可见近端胫骨平台。将针头连接至1毫升注射器上，针尖朝向注射部位，与胫骨轴线平行。经皮插入针头，沿胫骨平台向胫骨远端钻孔。
将先前置于冰上的骨肉瘤细胞悬液吸入微量注射器中，并用装载骨肉瘤细胞的微量注射器替换胫骨中的一毫升注射器。在不施加较大压力的情况下，缓慢向每只裸鼠的胫骨内注射约10微升骨肉瘤细胞悬液。然后将微量注射器从注射部位取出，并用棉签按压注射部位约30秒。
将小鼠放回清洁的笼子中，观察其恢复情况10分钟。该图显示了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞建立的原位骨肉瘤小鼠模型及其分离后的形态。每周均可观察到肿瘤体积逐渐增加。
注射荧光素酶标记的骨肉瘤细胞后第一至第六周获得的X射线图像显示，肿瘤体积逐渐增加。此外，向小鼠胫骨注射后获得的图像显示了原位骨肉瘤在体内的生长情况。通过胫骨内注射骨肉瘤细胞所导致的肺转移，成功利用活体生物发光成像系统在体内进行了追踪。
体视显微镜下观察显示，分离的肺组织中存在转移性克隆。石蜡包埋肺组织的苏木精-伊红染色显示转移性病灶。应通过髌韧带将针头经皮插入关节囊，并通过旋转注射器在胫骨平台钻孔，直至达足部胫骨。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案描述了构建携带原发性骨肉瘤及肺转移病灶小鼠模型的技术。通过将骨肉瘤细胞注射至胫骨内，该模型能够最大程度地模拟肿瘤性骨肉瘤的临床发展特征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 动物模型
背景
- 骨肉瘤是儿童和青少年中常见的骨癌。
- 了解其转移机制对于开发有效的治疗方法至关重要。
- 动物模型对于研究肿瘤行为和治疗反应必不可少。
- 胫骨内注射可实现局部肿瘤生长及转移研究。
研究目的
- 建立可靠的骨肉瘤研究小鼠模型。
- 研究原发肿瘤及其转移灶的特征。
- 在受控环境中促进治疗策略的测试。
使用的方法
- 使用微量注射器将成骨肉瘤细胞注入胫骨内。
- 注射前用 PBS 清洗细胞。
- 用胰蛋白酶消化细胞以准备注射。
- 注射后监测肿瘤形成率及肿瘤体积。
主要结果
- 在不同模型中均实现了稳定的肿瘤形成率。
- 观察到一致的肿瘤体积，表明实验具有可重复性。
- 模型中成功建立了肺转移灶。
- 该模型反映了骨肉瘤进展的临床特征。
结论
- 胫内注射法对骨肉瘤建模有效。
- 该模型可用于未来的治疗学研究。
- 研究结果有助于深入理解骨肉瘤的生物学特性及治疗策略。
常见问题
行业重要性概述
通过胫骨内注射建立的原位骨肉瘤模型可实现可重复的肿瘤形成和肺转移，为靶点验证和治疗效果测试提供了一个具有临床相关性的系统。该方法通过在免疫缺陷小鼠中模拟人类疾病的进展过程，支持对原发性和转移性肿瘤负荷进行纵向监测，从而实现机制层面的风险评估。该模型对生物发光和X射线成像具有高敏感性，可提供定量检测结果，对于肿瘤学研发管线中的临床前“推进/终止”决策至关重要。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在模拟人类骨肉瘤发生及肺转移的疾病相关体系中，验证治疗假设。
- 操作价值：提供稳定的肿瘤成瘤率和可测量的生长动力学，适用于可靠的靶点结合与信号通路调控研究。
- 预测价值：通过反映临床转移模式，支持临床前模型的选择，提高靶点优先排序的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成标准化的原位肿瘤，适用于制备经验证的生物系统，用于下游药物筛选。
- 操作价值：通过影像学手段实现对肿瘤体积和转移负荷的可重复定量，支持不同研究间检测方法的标准化。
- 可扩展性：较短的孵育期和快速的肿瘤生长特性使得化合物能够及时评估，并可在先导化合物筛选项目中重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 转化连续性： 模拟临床骨肉瘤进展过程，以肺转移为主要致死表型，与患者临床结局一致。
- 机制去风险化： 可在具有生理相关背景的模型中评估肿瘤微环境相互作用及转移驱动机制。
- 治疗评估： 支持候选药物的体内疗效测试，原发肿瘤和转移病灶可分离，便于终点分析。
流程与工作流整合
该模型适用于从靶点验证到先导化合物筛选直至临床前药效评估的整个发现流程，尤其适用于嗜骨性及转移调控类药物。
- 发现生物学：利用原位移植、免疫缺陷宿主系统，支持对骨肉瘤驱动因子和转移抑制因子的假设验证。
- 筛选：提供基于成像的定量输出结果（生物发光、X射线），可实现对肿瘤生长和扩散治疗效应的比较。
- 分析：提供关于肿瘤负荷和转移发生率的纵向可量化指标，有助于跨职能的数据解读。
- 转化研究：通过临床相关的转移模式，将早期机制性发现与临床前验证相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的骨肉瘤肿瘤学研究平台，减少各项目间模型的重复开发。
运营与企业影响
- 科学价值：通过建模骨肉瘤进展的全过程（包括向肺部的转移扩散），提高预测的可信度。
- 操作价值：通过标准化的细胞制备、注射技术以及基于影像学的监测，确保实验的可重复性。
- 战略价值：利用对转移敏感的终点指标，实现对无效候选药物的早期识别，从而提高资金使用效率。
- 项目组合影响：通过提供关于肿瘤-基质相互作用及转移潜能的机制性见解，支持基于风险评估的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备原位注射技术以及免疫缺陷小鼠模型操作的专业知识。
- 依赖于微体积注射器、基底膜基质材料以及生物发光/X射线成像系统的可及性。
- 为获得可重复的结果，需在不同团队间对细胞制备、注射体积和实验终点标准进行统一。
- 若改用其他骨肉瘤细胞系，可能需要优化基质浓度和注射体积。
- 实际限制因素包括因注射精度导致的模型变异，以及需要符合IACUC规定的肿瘤大小终点指标。
