Name: 使用比率指标对原代神经元中的线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习使用共聚焦活细胞显微技术实时监测原代海马和皮层神经元中的线粒体谷胱甘肽氧化还原状态。该方法可评估NMDA诱导的氧化应激及保护性治疗策略的效果。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号：BA 3679/5-1；FOR 2289：BA 3679/4-2）资助。A.K. 获得伊拉斯谟+（ERASMUS+）奖学金支持。我们感谢 Iris Bünzli-Ehret、Rita Rosner 和 Andrea Schlicksupp 在原代神经元制备方面提供的帮助。我们感谢 Tobias Dick 博士提供质粒 pLPCX-mito-Grx1-roGFP2。图 4 所示实验在海德堡大学尼康影像中心完成。图 2 使用 BioRender.com 制作。

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<li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li>
<li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
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<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+a+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
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<li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li>
<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
<li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li>
<li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li>
<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
<li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

对线粒体氧化还原状态进行定量和动态测量，可提供有关线粒体和细胞生理的重要信息。目前已有多种荧光探针可用于检测活性氧、&#34;氧化还原应激&#34;或&#34;氧化应激&#34;。然而，后两个术语定义不明确，且常缺乏特异性9,17,18。与化学染料相比，Grx1-roGFP2具有多项优势9,19：（i）作为一种激发光比率型传感器，它可对传感器表达水平、绝对荧光强度以及细胞或细胞器密度进行内在归一化；（ii）作为一种基因编码探针，可将其靶向定位至细胞器或特定亚细胞区域，如突触前末梢或突触后树突棘；（iii）传感器的基因表达避免了染料加载步骤，而化学染料的加载可能对原代神经元造成应激；（iv）与普通的氧化还原敏感性化学染料相比，Grx1-roGFP2对谷胱甘肽氧化还原电位具有高度特异性；（v）该传感器的氧化与还原过程可逆，因而能够检测瞬时的...

多种重要的线粒体酶和信号分子受到巯基氧化还原调节1。此外，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，并且对氧化损伤具有选择性易感性2。因此，线粒体的氧化还原电位直接影响生物能量学、细胞信号传导、线粒体功能以及最终的细胞存活能力3,4。线粒体基质中含有高浓度（1–15 mM）的巯基-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽（GSH），以维持氧化还原稳态并发挥抗氧化防御作用5,6。GSH可通过共价结合靶蛋白（S-谷胱甘肽化）来调控其氧化还原状态和活性，并被多种解毒酶利用以还原被氧化的蛋白质。因此，在研究线粒体功能与病理生理过程时，线粒体谷胱甘肽氧化还原电位是一个极具信息价值的参数。
roGFP2 是 GFP 的一种变体，通过引入两个暴露于表面的半胱氨酸，形成一个人工的二硫醇-二硫键对，从而使其对氧化还原状态敏感7,8。它在约 510 nm 处有一个单一发射峰，在约 400 nm 和 490 nm 处有两个激发峰。重要的是，这两个激发峰的相对强度取决于 roGFP2 的氧化还原状态（图 1），因此该蛋白可作为一种比率型传感器。在 Grx1-roGFP2 传感器中，人源谷氧还蛋白-1（Grx1）被融合至 roGFP2 的 N 末端9,10。将 Grx1 酶共价连接到 roGFP2 上带来了两个主要改进：一是使传感器对 GSH/GSSG 谷胱甘肽氧化还原对具有特异性（图 1），二是使 GSSG 与 roGFP2 之间的平衡速率加快至少 100,000 倍9。因此，Grx1-roGFP2 能够实现对细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的特异性与动态成像。
Grx1-roGFP2 成像可在多种显微镜上进行，包括宽场荧光显微镜、转盘共聚焦显微镜和激光扫描共聚焦显微镜。该传感器在原代神经元中的表达可通过多种方法实现，包括脂质体转染11、DNA/磷酸钙共沉淀12、病毒介导的基因转移，或使用转基因动物作为细胞来源（图2）。本文实验采用包含 AAV1 与 AAV2 衣壳蛋白 1:1 比例的假型重组腺相关病毒（rAAV）13,14。使用该载体时，传感器表达水平通常在感染后 4–5 天达到峰值，并至少稳定维持两周。我们已成功在小鼠和大鼠的原代海马神经元及皮层神经元中应用 Grx1-roGFP2。
本文利用重组腺相关病毒（rAAV）介导的线粒体靶向Grx1-roGFP2在原代大鼠海马和皮层神经元中的表达，评估线粒体基础谷胱甘肽氧化还原状态及其急性扰动。提供了一套共聚焦活细胞成像实验方案，包含详细操作步骤：（i）优化激光扫描共聚焦显微镜设置，（ii）开展活细胞成像实验，以及（iii）使用FIJI软件进行数据分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>二胺 (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖 (2.5 M 储存液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M 储存液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (0.1 M 储存液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸四甲基罗丹明乙酯 (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成像室</td><td>Life Imaging Services (巴塞尔，瑞士)</td><td>10920</td><td>适用于 &amp;Oslash;12 mm 盖玻片的 Ludin Chamber Type 3</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜，显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜，扫描单元</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>VWR</td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜，相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜，培养系统</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜，显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜，扫描单元</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>StackReg 插件</td><td></td><td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td><td></td></tr><tr><td>TurboReg 插件</td><td></td><td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td></tr></tbody></table>

利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

线粒体氧化还原稳态对神经元的存活和功能至关重要。尽管线粒体包含多种氧化还原系统，但含量丰富的硫醇-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽被认为是抗氧化防御的核心组分。因此，测量线粒体谷胱甘肽氧化还原电位可为线粒体氧化还原状态和氧化应激提供有价值的信息。谷氧还蛋白1-红色氧化还原敏感绿色荧光蛋白2（Grx1-roGFP2）是一种基因编码的、基于绿色荧光蛋白（GFP）的比率型谷胱甘肽氧化还原电位指示探针，其在400 nm和490 nm处有两个氧化还原状态敏感的激发峰，在510 nm处有一个单一发射峰。本文介绍了如何对靶向定位于线粒体的Grx1-roGFP2在原代海马和皮层神经元中进行共聚焦活细胞显微成像。文中描述了如何评估稳态下的线粒体谷胱甘肽氧化还原电位（例如用于比较不同疾病状态或长期处理），以及如何测量急性处理引起的氧化还原变化（以兴奋性毒性药物N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）为例）。此外，本文还展示了Grx1-roGFP2与线粒体膜电位指示剂四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的共成像，以说明Grx1-roGFP2如何与其他探针联用，实现多参数分析。本实验方案详细说明了（i）优化共聚焦激光扫描显微镜设置，（ii）施加刺激药物后使用二酰胺（diamide）和二硫苏糖醇（dithiothreitol）对传感器进行校准，以及（iii）使用ImageJ/FIJI软件进行数据分析的具体步骤。

生长因子撤除后稳态线粒体氧化还原状态差异的定量分析 
为展示线粒体氧化还原状态稳态差异的定量分析，将标准培养基中培养的原代神经元与培养48小时后撤除生长因子的神经元进行比较。撤除生长因子72小时后可导致神经元发生凋亡性细胞死亡。16细胞在培养48小时后进行成像，以检测线粒体氧化还原状态的变化是否先于该过程。原代大鼠皮层神经元接种于聚-L-鸟氨酸包被的盖玻片上，并在第几天感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2病毒 体外 6（DIV6）并在DIV12进行成像。根据本方案第4节，在配备40x/1.10水镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜上，于室温下进行活细胞成像。共聚焦参数设置为：针孔7个艾里单位，像素大小568.7 nm（512 × 512像素），扫描速度600 Hz，405 nm激光功率3%，488 nm激光功率1%，发射波长范围505–550 nm，帧平均4次。两种条件下原始的405:488 nm比值之间无显著差异图3B）。数据归一化后，在撤除生长因子组中可检测到一部...

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。

线粒体氧化还原稳态对神经元的存活和功能至关重要。尽管线粒体内含有多种氧化还原系统，其中丰度较高的……

该方法可用于研究在病理生理条件下线粒体氧化还原状态如何受到影响。它也可用于评估旨在保护线粒体的治疗策略的有效性。该技术的主要优势在于，能够对器官内特定区域的线粒体氧化还原状态进行动态追踪，并实时观察其变化。该方法可与其他指示剂联合使用，以同时记录线粒体膜电位或钙离子浓度等指标，此外还可检测氧化还原状态。本方案适用于培养细胞、组织外植体以及脑片培养。首先优化共聚焦显微镜的扫描设置。为此，请将检测器设置为 12 位或 16 位，启用顺序扫描模式，并添加第二个序列/轨道。对于两个通道，选择一种伪彩色查找表以显示过曝和欠曝的像素，然后选择适合目标对象的物镜。将带有细胞的盖玻片安装到成像室中。加入一毫升成像缓冲液，将样品室置于显微镜上。使用目镜和透射光对细胞进行聚焦。以不同的像素格式和针孔尺寸采集图像。然后使用不同的激光强度拍摄图像，并相应调整检测器的增益和阈值。最后，以不同的扫描速度和不同的帧平均次数采集图像。对于活细胞成像，将时间间隔设为30秒，持续时间设为25分钟。然后封片，将样本腔室置于显微镜上，并如前所述对细胞进行聚焦。切换至扫描模式，在实时预览中使用488纳米通道对细胞进行聚焦并定位以进行成像。可选地，为增加每次实验记录的细胞数量，可使用多点功能对每张盖玻片上的两到三个视野进行成像。启动延时成像采集，记录五张图像作为两分钟的基线记录。向腔室中加入500 µL的3倍浓度NMDA溶液，使终浓度达到30 µM，并继续记录20张图像，作为10分钟的NMDA反应记录。随后，向腔室中加入500 µL的4倍浓度DA溶液，并再记录六张图像。吸去成像室中的缓冲液，并加入一毫升 DTT 溶液。再记录 10 张图像后，结束记录并保存图像序列。为将数据导入图像分析软件，点击插件，选择 bio formats，然后选择 bio formats 导入器。在对话框中，选择“以超堆栈方式查看堆栈”，将颜色模式设置为默认，并选择自动缩放。通过点击图像，选择“类型”，然后在选项中选择 32 位，将图像格式更改为 32 位。要将颜色通道拆分为单独的窗口，请点击图像，进入“颜色”菜单，然后选择“拆分通道”。通过点击图像，选择“调整”和“阈值”，调节阈值以选择用于分析的线粒体。在对话框中，选择默认的红色暗背景和堆叠直方图。当选定的像素显示为红色时，点击“应用”。然后选择将背景像素设置为 NAN，以处理所有图像，并对第二通道执行相同的步骤。为了可视化 405 至 488 纳米的比值，点击“处理”和“图像计算器”以创建比值图像。在对话框中，选择图像一中的第一通道作为分子，运算符选择除法，第二图像中的第二通道作为分母。然后选择创建新窗口并处理所有图像。通过单击图像、选择查找表，然后选择 fire，将比率图像的查找表更改为伪彩色。为分析图像，在比率图像上围绕单个细胞或线粒体绘制感兴趣区域（ROI）。要将感兴趣区域（ROI）添加到ROI管理器，请转到“分析”菜单，点击“工具”，选择“ROI管理器”，点击“添加”并选择“显示全部”。为测量单个细胞的405至488纳米荧光比值，请打开ROI管理器，按Ctrl+A选择所有ROI，进入“更多”选项并选择“多点测量”。在弹出的对话框中，选择“测量所有切片”和“每切片一行”。将测量结果导出至电子表格软件后，选择 405 纳米图像，测量所有 ROI 的强度，并再次将测量结果导出至电子表格软件。同样地，测量 488 纳米图像的 ROI 强度。为保存 ROI 以供将来参考，请按 Control A 选中所有 ROI，进入“更多”选项并选择保存。这些来自延时记录的代表性快照显示了神经元在NMDA处理前、处理后以及使用DA和DTT进行最大/最小校准后的比值图像。用30微摩尔NMDA处理神经元可在数分钟内诱导线粒体氧化。对单个荧光通道的分析表明，NMDA诱导的线粒体酸中毒导致在405和488纳米激发光下GFP荧光均下降。在对照实验中，DA 预处理阻断了 NMDA 引起的线粒体进一步氧化。相应地，尽管氧化还原敏感型 GFP2 荧光强度显著淬灭，405 与 488 纳米的荧光比值并未发生变化。该实验证实，405 与 488 纳米的荧光比值不受 pH 变化的影响。在另一项实验中，线粒体膜电位、氧化还原状态和形态被平行评估。用 60 微摩尔 NMDA 处理神经元后，四甲基罗丹明（TMRE）信号丢失，405 与 488 纳米 rho GFP 荧光比值升高，并伴随线粒体出现一定程度的延迟性变圆。开始使用该方法时，务必花费时间仔细优化显微镜设置。这将有助于在实验过程中保持神经元的健康。同时，严格遵守激光安全规则也极为重要。在活体记录期间添加药物干扰时，务必避免暴露于激光辐射下。

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来源：Katsalifis, A., 等。利用比率型指示剂对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像。J. Vis. Exp.

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Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中PKC转位的活体成像

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