Name: 离体 从内侧前额叶皮层到外嗅皮层的远距离突触传递和可塑性的光遗传学询问 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解光遗传学技术在急性脑切片中研究特定突触传递和可塑性的方法。该技术利用病毒转导实现精确的光控刺激，帮助神经科学家深入解析长程神经环路的电生理特性及其功能机制。

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本工作由Wellcome基金（资助号：206401/Z/17/Z）支持。我们感谢Zafar Bashir提供的专业指导，以及Clair Booth博士在技术方面给予的协助和对稿件提出的修改意见。

所有动物实验均按照英国《1986年动物科学程序法案》及相关指南以及当地机构指南进行。
1. 立体定位病毒注射
注意：本实验方案需要解剖学上的特异性，但不需要突触后细胞类型的特异性。
<ol>
	<li>选择合适的动物。本方案使用雄性野生型Lister hooded大鼠（300–350 g，约3月龄）。</li>
	<li>选择合适的病毒载体。需考虑多个因素（参见 讨论）。本实验方案采用病毒表达光遗传学通道 ChETATC12，用于转导兴奋性神经元（AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry；滴度：3.3 x 1013 病毒基因组/mL</li>
	<li>使用注射坐标和体积的确定方法&#160;如先前所述的脑图谱35.</li>
	<li>病毒制剂的立体定位注射 
	注意：应遵循所有相关的国家和机构关于动物使用与护理的指南。病毒载体的立体定位注射操作参照先前所述方法进行。13 并作如下修改。
	<ol>
		<li>在动物麻醉和准备期间，将病毒制剂置于冰上保存。</li>
		<li>在麻醉诱导室中使用4%异氟烷诱导麻醉。通过呼吸频率减慢且规律（1 Hz）以及足底反射和角膜反射消失来监测麻醉深度（分别通过捏脚趾和轻触眼角进行测试；应无反应）。</li>
		<li>在侵入性操作前至少30分钟给予术前镇痛药，如美洛昔康。</li>
		<li>当动物完全麻醉后，使用电推剪去除头皮部位的毛发。将异氟烷气流切换至立体定位仪的鼻罩，并将大鼠固定在立体定位仪上。在眼睛表面涂抹润滑性眼用凝胶，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
		<li>手术应在无菌条件下进行。整个操作过程中使用无菌手套和器械。在用4%（w/v）氯己定溶液对头皮进行消毒前，先涂抹利多卡因软膏（5% w/w），然后用无菌洞巾覆盖身体。使用手术刀在头皮上做一条长约15 mm的纵向切口，以暴露前囟。</li>
		<li>将 Hamilton 注射器装入固定在立体定位仪上的可移动臂连接的微量注射泵中。</li>
		<li>将5 µL病毒样品加入0.2 mL离心管中，短暂离心数秒，使液体全部沉至管底。用移液器吸取2 µL病毒悬液，加入管盖中。</li>
		<li>使用手术显微镜观察针尖，然后手动将病毒液滴置于针尖处，通过泵的控制装置回抽注射器活塞，将病毒制剂吸入注射器中。</li>
		<li>将泵的注射体积设为 300 nL，流速设为 100 nL/min。启动泵，并通过观察针尖处病毒液滴确认正常流动。用棉签吸取病毒液，再用 70% 乙醇轻轻清洁针头。</li>
		<li>使用立体定位仪框架上的调节螺钉，将针尖移动至前囟（颅骨上冠状缝与矢状缝交汇的点），并记录立体定位仪框架上三个游标刻度显示的测量值。大鼠内侧前额叶皮层（mPFC）相对于前囟的坐标为：前后方向 +3.1 mm，内外侧方向 ±0.7 mm，背腹方向 -4.5 mm；根据指示将这些距离从前囟坐标加减后，将针尖移至相应的前后和内外侧坐标位置，并轻轻将针尖下降至颅骨表面。 
		注意：上述 mPFC 坐标适用于体重为 300–350 g 的雄性 Lister hooded 大鼠；大鼠品系、体型的差异可能需要对这些坐标进行调整（参见 讨论).</li>
		<li>将针头抬离颅骨表面，并用细头永久性记号笔标记该位置。使用固定在立体定位臂上的微型钻在此处钻出一个骨孔。</li>
		<li>将针头插入大脑预设的背腹向坐标位置，并注入预定体积的液体（mPFC：300 nL）。保留针头 原位 10 分钟，以使团注物质充分扩散。拔出针头后，运行泵以确保针头未被堵塞。 
		注意：插入和拔出针头时应缓慢进行（约 3 mm/min），以尽量减少对脑组织的损伤以及病毒沿针道回流。</li>
		<li>皮下注射2.5 mL温热的氯化钠（0.9% w/v）和葡萄糖（5% w/v）溶液，以维持水合状态。</li>
		<li>对第二个半球重复步骤 1.4.12。</li>
		<li>缝合头皮切口，手术结束后，给予2.5 mL氯化钠葡萄糖溶液以及机构推荐的适当镇痛剂用于疼痛管理，例如丁丙诺啡或美洛昔康。动物未完全清醒期间不得无人看护。将大鼠置于加热的恢复箱中，直至其完全恢复意识。仅在完全恢复后方可放回与其他动物共用的饲养笼中。</li>
		<li>遵循机构关于病毒转染啮齿类动物术后护理和饲养的操作规范。在开始实验前，至少等待2周，以确保视蛋白转基因得到充分表达。 
		&#8203;注意：转导所需时间取决于突触前与突触后区域之间连接的距离和强度。从内侧前额叶皮层（mPFC）到外侧内嗅皮层（LEC）的转导需要4至6周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 急性脑切片的制备
注意：本文介绍一种制备脑切片的简单方法，该方法在我们的实验中已足以从成年小鼠和大鼠中获得高质量的皮层、海马和丘脑切片。
<ol>
	<li>准备解剖所需溶液。
	<ol>
		<li>取一个 250 mL 烧杯，加入约 200 mL 冰冷的蔗糖切割液（189 mM 蔗糖、26 mM NaHCO3、10 mM D-葡萄糖、5 mM MgSO4、3 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4 和 0.2 mM CaCl2，用超纯水（UPW，25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）配制），或加入足够体积以填满振动切片机的组织室。用碳氧混合气（95% O2、5% CO2）持续通气，并将溶液置于冰上保存。</li>
		<li>在切片收集室中加入室温的人工脑脊液（aCSF；124 mM NaCl、26 mM NaHCO3、10 mM D-葡萄糖、3 mM KCl、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4 和 1 mM MgSO4，用超纯水配制），并用碳氧混合气持续通气。切片收集室14为定制装置，由一个粘附在尼龙网片上的微量离心管架构成，将其放入烧杯中并浸没于 aCSF 中（图 2A）。</li>
		<li>取一个 50 mL 离心管，加入 4% 多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PB；75.4 mM Na2HPO4·7H2O 和 24.6 mM NaH2PO4·H2O）。 
		注意：PFA 具有毒性，应在通风橱中操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织解剖。
	<ol>
		<li>将大鼠置于诱导麻醉室中，使用 5% 异氟烷进行麻醉，直至其呼吸缓慢且规律（约 1 Hz）。为确保麻醉深度充分，需检测足底反射和角膜反射是否消失。</li>
		<li>使用断头器将动物断头。</li>
		<li>迅速完整取出脑组织，方法如前所述15&#160;，并立即转移至蔗糖切割液中。为保证切片质量和全细胞记录的成功率，断头后应在 90 秒内完成此步骤。</li>
		<li>使用金属小勺取出脑组织，去除多余切割液，将其放置于实验台面上的滤纸上。</li>
		<li>使用解剖刀或剃须刀片快速去除小脑，并沿脑长轴约中点处在冠状面上切开大脑半球；后半部分即为外侧内嗅皮层（LEC）组织块。在切割时应额外保留部分周边组织，以满足后续步骤的需要。将该组织块及剩余脑组织均重新放回蔗糖切割液中。</li>
		<li>在振动切片机的组织载物台上滴加一滴氰基丙烯酸酯胶水，并用工具将其涂抹成一层薄层，面积略大于上一步获得的组织块。</li>
		<li>使用小勺取出 LEC 组织块，去除多余液体后，将其转移至胶水区域，使前部的冠状切面紧贴胶水并牢固粘附。</li>
		<li>将载物台安装至振动切片机的组织室中，并迅速倒入足量蔗糖切割液以完全浸没组织；用碳氧混合气持续通气。调整 LEC 组织块方向，使其腹侧朝向刀片。尽管环境室内光照不足以激活视蛋白，但仍应避免使用切片机上可能存在的额外光源。</li>
		<li>使用高刀片振荡频率（100 Hz）和慢进刀速度（0.06 mm/s），从腹侧向背侧切割厚度为 350 µm 的脑片。通常每个半球可获得约七片 LEC 切片。</li>
		<li>将切片转移至切片收集室中。完成所有切片收集后，将收集室置于 34 °C 水浴中孵育 1 小时，随后恢复至室温。持续用碳氧混合气通气。切片在至少 6 小时内均保持良好状态，适用于电生理记录。</li>
		<li>将剩余脑组织置于 PFA 中固定 48 小时，用于后续注射位点的组织学验证（见第 4 节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电生理学与光遗传学刺激
<ol>
	<li>靶细胞的鉴定
	<ol>
		<li>将脑片置于34 °C的浸没式记录舱中，通过蠕动泵以2 mL/min的流速持续灌注aCSF。使用脑片固定器固定脑片。</li>
		<li>在宽场显微镜下使用斜射红外照明，选择低倍物镜（4x），定位至LEC第5层。测量从软脑膜表面到目标层的距离。 
		注意：斜向红外照明是通过将一个近红外LED置于记录室盖玻片下方约3 mm处，并使其与盖玻片平面成约55°角来实现的（图2B微分干涉相差是一种用于脑片电生理学的替代性且常用的成像技术。</li>
		<li>更换为高倍水浸物镜（40倍），识别锥体神经元。用胶带在计算机显示器上标记该细胞的位置。 
		注意：锥体神经元具有近似三角形的形态，其显著的顶端树突朝向脑片的软脑膜表面延伸。图3A）。可通过观察细胞核是否无明显凝聚以及细胞质膜是否光滑来评估细胞健康状态。使用宽场荧光显微镜时，通常难以清晰观察到视蛋白-荧光染料融合蛋白对轴突的荧光标记。为可视化轴突投射，可在实验后进行免疫组织化学染色，使用针对视蛋白所连荧光染料的一抗，并用偶联了相同或相似波长荧光染料的二抗进行信号放大。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞膜片钳的形成
	<ol>
		<li>使用拉针仪制备硼硅酸盐玻璃微电极，并用过滤后的细胞内记录液（120 mM K-葡萄糖酸盐，40 mM HEPES，10 mM KCl，2 mM NaCl，2 mM MgATP，1 mM MgCl₂，0.3 mM NaGTP，0.2 mM EGTA，以及用超纯水配制的0.25% 生物胞素，pH 7.25，285–300 mOsm）灌注。将灌注好的微电极置于膜片钳放大器头stage的电极夹持器中，确保电极丝与细胞内溶液接触良好。</li>
		<li>通过连接在电极夹侧端口的管路，向与之相连的吹嘴（例如去掉活塞的1 mL注射器）用力吹气，以产生正压，并通过关闭管路上的三通阀维持压力。升高显微镜物镜，使液面形成弯月面，将电极插入弯月面中，直至在显微镜下可见。</li>
		<li>打开 密封性测试 WinLTP 中的窗口16 （或其他采集软件/示波器）并将放大器置于电压钳模式，施加一个5 mV的方波脉冲，以确定移液电极电阻是否在3-6 MΩ之间。</li>
		<li>用移液管尖端接近并接触已识别的细胞；这应在细胞膜上产生压痕（图3A；右侧面板以及移液管电阻的轻微增加（0.1 MΩ）。</li>
		<li>释放正压，通过在吹嘴处施加适度吸力来施加负压；这应导致移液管阻力显著增加&#62;1000 MΩ）。此时可保持压力中性。施加负压，并逐步增加压力梯度，直至细胞膜破裂，出现全细胞电容瞬变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录光遗传学诱发的突触事件。
	<ol>
		<li>进入电流钳制模式。 
		注意：大多数情况下，长程突触传递为谷氨酸能性质，因此在接近氯离子反转电位的膜电位下进行记录，可最佳地分离AMPA受体（AMPAR）介导的传递，并最小化前馈抑制（FFI）成分的检测。氯离子反转电位取决于细胞内记录液和人工脑脊液（aCSF）的组成，可通过Goldman-Hodgkin-Katz方程计算；对于上述溶液，该值为-61.3 mV。第5层LEC锥体神经元的平均静息膜电位为-62 mV，必要时可通过持续电流注入将细胞维持在此电位。 Alternatively, cells can be voltage clamped to the desired potential. To record long-range inhibitory projections16 或记录FFI，在阳离子反转电位下进行电压钳制以分离GABA能氯离子电导。当在高于动作电位阈值的膜电位下对神经元进行电压钳制时，使用含电压门控钠通道阻断剂的铯基细胞内溶液，以改善电压钳制效果并防止动作电位的产生（130 mM CsMeSO₃）4，10 mM HEPES，8 mM NaCl，5 mM QX 314 氯化物，4 mM MgATP，0.5 mM EGTA，0.3 mM NaGTP，0.25% 生物胞素（biocytin）溶于超纯水（UPW），pH 7.25，285–300 mOsm。</li>
		<li>使用数据采集软件，向LED驱动器发送晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号，以激活安装的470 nm LED。通过滤光片组和适当的光学元件，将安装的LED导入显微镜光路中图2B) 向脑片施加光脉冲 通过 使用40倍物镜诱发光遗传兴奋性突触后电位（oEPSPs）。 
		注意：光脉冲可施加于胞体周围或树突区域，这将导致轴突及突触前终扣中的视蛋白被激活；研究者也可将物镜移至记录细胞以外的轴突区域，以避免对终扣的过度刺激（参见 讨论最大oEPSP幅度取决于突触投射的强度、病毒注射的效率以及所使用的视蛋白。通过调整光照强度和/或持续时间，可将oEPSP调节至所需的幅度18；改变光脉冲持续时间（典型持续时间为0.2–5 ms，LED最大输出功率下光密度为4.4 mW/mm）19) 比调节LED的输出功率能获得更稳定的oEPSP振幅。</li>
		<li>通过递送具有不同刺激间隔的多脉冲光刺激序列，研究突触前释放特性（电压变化）图 3E）；在解释光遗传学诱发的传递时应谨慎（参见 讨论).</li>
		<li>通过重复诱发 oEPSPs 来研究长时程可塑性19 或配体的应用。在诱导可塑性之前，监测 oEPSP 振幅 5-10 分钟以确保其稳定性，然后持续监测直至振幅达到稳定状态（通常为 30-40 分钟）。 
		注意：目前大多数视蛋白无法在高频刺激下可靠地诱发多个动作电位，例如通常用于诱导长时程增强（LTP）的100次100 Hz刺激。</li>
		<li>为确认oEPSP为单突触反应，可将物镜置于树突分支上方，对转导通路进行轴突终末上方刺激，同时在含有0.5 µM河豚毒素（tetrodotoxin）和100 µM氨基吡啶（aminopyridine）的环境中进行记录。若反应依赖动作电位，则河豚毒素可完全阻断信号传递；若oEPSP为单突触产生，则随后加入氨基吡啶可部分恢复信号传递。19,20.</li>
		<li>为使生物胞素充分填充神经元，在建立全细胞记录模式后，至少等待15分钟。在电压钳模式下，监测膜电容和输入电阻。</li>
		<li>缓慢沿进针角度将移液管从细胞胞体处撤出，观察电容瞬变和膜电流的逐渐消失，这表明细胞膜正在重新封闭，并在移液管尖端形成外向外出小片膜。注意记录脑片的方向以及细胞在脑片内的位置。将脑片放入24孔板中的多聚甲醛（PFA）中，4 °C过夜孵育，随后转移至0.1 M磷酸缓冲液（PB）。 
		&#8203;注意：切片可储存长达一周。若需更长时间储存，请定期更换磷酸缓冲液，或使用含叠氮化钠的磷酸缓冲液（叠氮化钠浓度为0.02%–0.2%）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织学
<ol>
	<li>切片注射位点
	<ol>
		<li>固定完成后，将组织置于含30%蔗糖（w/v）的磷酸缓冲液（PB）中进行冷冻保护，直至组织沉底（初始时组织会漂浮在蔗糖溶液上），通常在室温下过夜，或在4 °C下放置24–48小时。</li>
		<li>使用最佳切割温度（OCT）包埋介质，将组织块固定于冷冻切片机的样品盘上。按照步骤4.1.3至4.1.4操作，冷冻组织块。</li>
		<li>将异戊烷置于合适的容器中，仅将样品盘浸入异戊烷内，确保组织位于异戊烷液面之上。将盛有异戊烷的容器放入液氮（或干冰）中，使组织迅速冷冻。</li>
		<li>待组织完全冻结（整个组织块变为浅色且坚硬）后，将组织块置于冷冻切片机腔室中，在-20 °C下静置30分钟，使其温度达到平衡。</li>
		<li>在-20 °C条件下，使用冷冻切片机切出厚度为40 µm的切片。用细毛笔将切片从刀片上轻轻引导下来。通过将室温下的多聚-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片轻触切片，使冷冻切片牢固粘附于载玻片上。</li>
		<li>每张载玻片上加入约150 µL封片剂，并加盖盖玻片；轻轻按压盖玻片以去除气泡。将载玻片遮盖，避免光漂白，并在室温下自然干燥至少12小时（或过夜）。使用荧光显微镜观察病毒注射位点的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物胞素染色方案 
	注意：本方案适用于厚切片；切片无需重新切片。
	<ol>
		<li>用磷酸盐缓冲盐水（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，和1.8 mM KH2PO4）清洗脑切片，每次10分钟，共清洗六次。每步操作后使用移液管吸除孔内液体。</li>
		<li>将切片在含3% H2O2（w/v）&#160;的PBS中孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。此过程会产生氧气气泡。</li>
		<li>用PBS清洗脑切片六次，每次10分钟，或直至无可见氧气气泡产生。将脑切片在含0.1%（v/v）Triton X-100的PBS中，与1%（v/v）亲和素-生物素化HRP复合物（ABC）溶液在室温下孵育3小时。</li>
		<li>用PBS清洗脑切片六次，每次10分钟。</li>
		<li>将每张切片置于3,3′-二氨基联苯胺（DAB）溶液中孵育数分钟，直至神经元结构的生物胞素染色可见（约需5–10分钟）。 
		警告：DAB具有毒性，应在通风橱中操作。 
		注意：DAB孵育时间可能难以预测，需密切观察组织显色过程。</li>
		<li>将切片转移至冷（4 °C）PBS中以终止反应。用PBS清洗脑切片六次，每次10分钟。使用毛笔将脑切片转移并贴附于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片上。</li>
		<li>用干净的纸巾吸除多余的PBS。每张切片上覆盖约200 µL封片剂，加盖盖玻片，并轻轻按压以排除气泡。在室温下自然干燥至少12小时（或过夜）。使用光学显微镜观察细胞的位置及其形态学细节。 
		注意：生物胞素也可使用荧光素标记的链霉亲和素进行可视化；但成像可能需要重新切片或使用共聚焦显微镜21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+7th+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact.+5th+edn%22">Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn</a>. , Academic Press. (2019).</li>
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<li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案介绍了一种结合立体定位手术递送编码光遗传学元件的腺相关病毒（AAV）与急性脑切片电生理记录的方法，用于研究高度特异性的长距离突触投射（图1）。这些技术相结合，可在传统非特异性电刺激难以触及的长距离且解剖分布弥散的神经通路中，以高精度表征脑环路的生理特性与可塑性。结合细胞特异性分子标记，可进一步实现对从某一脑区投射至另一脑区不同明确定义的细胞群的投射通路进行特征分析23。
为了充分利用该技术的高度精确性，必须验证通路特异性。这需要通过多个步骤完成：在记录过程中，确保所研究的突触为单突触连接（步骤 3.3.5）。随后，通过组织学方法检查注射位点，以确认病毒局限于预期的突触前目标区域，并评估经生物胞素标记的突触后细胞的位置与形态，确保其符合预期。
病毒选择与实现细胞特异性 
该技术具有高度可适配性，适用于小鼠和大鼠。需要解剖学特异性的实验可使用野生型啮齿类动物进行。若需要...

理解突触的生理学特性及其可塑性变化机制，是理解健康大脑中脑网络功能的基础1，以及它们在脑部疾病中功能障碍的机制。急性脑切片 离体 脑切片技术能够利用全细胞膜片钳记录，以高信噪比记录单个神经元突触的电活动。通过控制膜电位并进行简便的药理学干预，可实现对受体亚型的分离。这些记录具有极高的特异性，可用于鉴定突触后神经元，包括其皮层层级和亚区域定位2细胞形态学3，分子标志物的存在4，其传入投射5，或者它最近是否曾处于活跃状态6.
然而，实现突触前输入的特异性具有一定的挑战性。传统方法采用刺激电极来激活特定层内的轴突。一个典型的例子是海马体，其中在辐射层（stratum radiatum）进行局部刺激，可激活从CA3区投射到CA1区的突触7。在此情况下，突触前特异性得以实现，因为CA3输入是位于辐射层内、投射至CA1锥体细胞的唯一兴奋性输入8。尽管如此，这种通过传统电刺激方法在CA3-CA1轴突上实现的高度输入特异性仅属特例，也正因如此，该突触才成为被广泛深入研究的对象。在其他脑区，来自多个传入通路的轴突共存于同一层内，例如新皮层的第一层（layer 1）9，因此使用传统的刺激电极无法实现输入特异性的突触前刺激。这一问题尤为突出，因为不同的突触输入可能具有截然不同的生理特性；若同时刺激这些输入，可能导致对突触生理特性的错误表征。
光遗传学技术的出现——即通过基因编码表达光敏感膜蛋白（如通道视紫红质-2，ChR2）——极大地拓展了研究脑区间孤立突触投射的可能性10,11。本文介绍了一种具有普适性且低成本的研究长程突触生理学与可塑性的方法。利用病毒载体可高度特异性地递送光遗传学元件，从而实现对目标突触前区域的精确控制。传出投射纤维将表达光敏通道，使得这些纤维在目标区域中能够被光激活。因此，那些因解剖结构弥散、无法通过传统非特异性电刺激独立激活的长程通路，现在得以被专门研究。
以中内侧前额叶皮层（mPFC）转导表达兴奋性阳离子通道视蛋白的腺相关病毒（AAVs）为例，我们描述了该通路的操作方法。随后，我们介绍了来自外侧内嗅皮层（LEC）的急性脑片制备、对第5层LEC锥体神经元进行膜片钳记录，以及光诱导激活谷氨酸能mPFC-LEC投射（图1）。此外，我们还描述了对注射位点进行组织学评估，以确认突触前目标区域的位置，并鉴定突触后细胞的形态特征。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>三通鲁尔阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-二氨基联苯胺（DAB）底物</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40倍物镜</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-氨基吡啶</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>4倍物镜</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>病毒滴度：3.3×10&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; GC/ml</td></tr><tr><td>消色差透镜</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>聚焦可见光谱和近红外光</td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>牙钻头</td><td>Fine science tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>相机 - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>卡巴胆碱</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>氯己定外科清洗剂</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>动物毛发剪</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2速可拆卸刀头剪毛器</td></tr><tr><td>准直聚光透镜</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>数据采集设备</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>500 nm 长通二向色镜</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>600 nm 长通二向色镜</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜立方体</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>带侧端口的电极夹持器</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>眼用凝胶</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>细毛刷</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>断头器</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>运动学荧光滤光立方体</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>LED 驱动器</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因软膏</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>微型钻机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>定制规格：33号，长度15 mm，尖端类型4 - 12&amp;deg;</td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>安装式蓝色LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>安装式绿色LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4.&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td>SFH4550</td><td>用于切片的折射红外成像，微分干涉差（DIC）光学是另一种常用方法</td></tr><tr><td>OCT 包埋介质</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>最佳切割温度介质</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸包被的载玻片</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>切片固定器</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td></td></tr><tr><td>微钻立体定位夹持器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>细胞内记录液用注射器滤器</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>河豚毒素柠檬酸盐</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>直立式荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td><td>Version 2.32</td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖切割液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞内液？</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

研究大脑中特定突触的生理特性及其可塑性变化机制，是现代神经科学面临的关键挑战。传统方法 体外 电生理技术利用电刺激来诱发突触传递。该方法的主要缺点在于其非特异性：刺激电极所在区域内的所有轴突都会被激活，从而难以将观察到的效应归因于特定的传入连接。这一问题可通过用光遗传学刺激替代电刺激来克服。本文描述了一种将光遗传学与 体外 膜片钳记录。这是一种研究精确解剖定位的突触连接的基础突触传递及突触可塑性的强大工具，几乎适用于脑内任何神经通路。本文描述了编码通道视紫红质蛋白的病毒载体的制备与处理方法，用于将其手术注射至啮齿类动物脑内特定的突触前区域（内侧前额叶皮层），以及制备下游靶区（外侧内嗅皮层）的急性脑片。同时提供了将膜片钳记录与光刺激诱导突触激活相结合，以研究短时程和长时程突触可塑性的详细实验流程。我们还讨论了通过结合光遗传学与Cre依赖性细胞标记实现通路特异性和细胞特异性研究的实验范例。最后，介绍了对突触前目标区域进行组织学验证的方法，以及对突触后细胞进行生物胞素标记，以便进一步确定其精确定位和细胞类型。

在本实验方案中，我们描述了如何通过病毒递送光遗传学工具来研究长距离突触的生理学特性及可塑性。该方案可轻松适用于研究大脑中几乎任何长距离神经连接。作为示例，我们介绍了将编码视蛋白的腺相关病毒（AAV）注射至大鼠内侧前额叶皮层（mPFC），从外侧 entorhinal 皮层（LEC）制备急性脑片，对 LEC 第5层锥体神经元进行膜片钳记录，以及在 LEC 中通过光刺激激活来自 mPFC 的神经末梢（图1）。
一个健康的锥体细胞被定位并进行了膜片钳记录（例如， 图3A）。在当前的mPFC至LEC示例中，突触后细胞未被标记；如果需要鉴定突触后细胞，应使用宽场光学成像定位表达荧光标记的细胞（例如， 图3B）。在实验前应通过红外光学评估细胞的健康状态。为激活内侧前额叶皮层（mPFC）在外侧 entorhinal 皮层（LEC）中的轴突，将发光二极管（LED）直接置于第5层细胞胞体及其近端树突上方 通过</em...

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。

研究大脑中特定突触的生理特性及其可塑性变化机制，是现代神经科学面临的关键挑战。

通过病毒递送的光遗传学工具可实现对急性脑片中特定突触的生理学特性及可塑性进行详细的电生理表征。光遗传学激活突触的主要优势在于能够研究长程神经通路，以及刺激在解剖结构上未分离的轴突。本实验操作将由本实验室的研究助理 Dr.Lisa Kinnavane 演示。首先，将 Hamilton 注射器装入固定在立体定位仪可移动臂上的显微注射泵。然后取 5 µL 病毒样品置于微量离心管中。短暂离心数秒后，用移液器吸取 2 µL 病毒悬液至管盖内。使用手术显微镜观察针尖，将病毒制剂的液滴手动置于针尖处，然后通过泵的控制装置回抽注射器活塞。将泵的注射体积设为 300 纳升，流速设为 100 纳升每分钟。启动泵并观察针尖处病毒液滴，以确认流速正常。用棉签吸取病毒液，并用70%乙醇清洁针头。接着，使用立体定位仪框架上的调节螺钉，将针尖移至前囟，记录框架上三个游标尺显示的立体定位读数。将这些距离加到或从bregma坐标中减去。使用安装在立体定位仪臂上的微型钻头在颅骨表面钻出一个孔。将针头插入脑内预定的背腹向坐标位置，并注入预定体积的病毒制剂。输注后，将针头留置10分钟，以使推注液充分扩散。随后拔出针头，并启动泵以确认针头未堵塞。病毒注射两周后，处死大鼠，迅速分离全脑，并将其转移至蔗糖切片液中。使用金属茶匙取出脑组织，弃去多余的溶液，将其放置在滤纸上。使用解剖刀切除小脑，并沿大脑长度方向约中点处冠状切开大脑。后半部分即为LEC组织块。将组织块和剩余的脑组织放回蔗糖切片液中。接着，在振动切片机载物台上滴一滴氰基丙烯酸酯胶水，并将其铺成一层薄层。然后用小勺取下 LEC 组织块，转移到胶水区域，使前部冠状切面粘附在胶水上。将样本台安装到振动切片机的组织室中，并迅速倒入足够的蔗糖切割液以浸没组织。将组织块的腹侧朝向刀片定位后，以较慢的刀片推进速度从腹侧向背侧切割350微米厚的切片。通常每个半脑可获得七片切片。将脑片转移至脑片收集室，随后将收集室置于34摄氏度水浴中孵育1小时，之后恢复至室温。将剩余脑组织置于多聚甲醛中固定48小时。为了识别靶细胞，将脑片放入记录室中，并使用脑片固定器将其固定。在低倍镜下，利用红外照明，移动至外侧内嗅皮层第五层。然后切换至高倍水浸物镜，识别锥体神经元。用胶带在显示器上标记细胞的位置。接下来，为形成全细胞膜片钳，制备一根硼硅酸盐玻璃微电极，并用细胞内记录液填充。将填充好的微电极放入电极夹持器中，并通过向连接至电极夹持器侧端口的吹管用力吹气，施加正压。调高显微镜物镜，使形成弯月面，并将电极插入弯月面直至在显微镜下可见。打开封接测试窗口，确认移液管电阻是否为3至5兆欧。然后用移液管尖端接触已识别的细胞，使细胞膜产生压痕。接下来，通过在吹嘴处施加负压吸引，增加移液管的电阻。持续逐渐施加负压，直至细胞膜破裂，形成全细胞电容瞬变。要进入电流钳模式，使用安装好的LED，将其光线通过滤光镜组和适当的光学元件导入显微镜光路，并通过40倍物镜向脑片施加光脉冲。以5赫兹、10赫兹和20赫兹的频率递送多光脉冲序列，以研究突触前释放特性。为使生物胞素充分填充神经元，在建立全细胞记录模式后，至少等待15分钟。在电压钳模式下，监测细胞膜电容和输入电阻。然后沿进针角度缓慢将移液管从细胞胞体处撤出，观察电容瞬变信号和膜电流的逐渐消失，这表明细胞膜正在重新封闭，并在移液管尖端形成外向朝外的膜片。将脑片放入含有多聚甲醛的24孔板中，4℃孵育过夜。使用OCT包埋介质将组织块固定于冷冻切片机的样品盘上。为冷冻组织，将异戊烷放入合适的容器中，并将标本盘浸入其中，确保组织位于异戊烷液面以上。然后将盛有异戊烷的容器放入液氮中，使组织冷冻。待组织完全冻结后，将组织块置于冷冻切片机舱内，于零下20摄氏度放置30分钟，使组织块温度达到平衡。平衡后，在冷冻切片机中切出40微米厚的切片，并使用细毛刷将切片从刀片上轻轻引导下来。通过将载玻片接触切片，使这些冷冻切片贴附于室温下的聚-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片上。每张载玻片上加入150 µL封片剂后，盖上盖玻片，并通过轻轻按压盖玻片去除任何气泡。用盖玻片覆盖以防止荧光淬灭，并让其风干 12 小时。然后使用荧光显微镜观察病毒注射部位的位置。对于生物胞素染色，将脑片在含 3% 过氧化氢的 PBS 溶液中孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。然后用 PBS 清洗脑切片，直至无进一步的氧气气泡出现。接着，在含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 中，将切片在 1% 亲和素-生物素化 HRP 复合物溶液中孵育三小时。经过六次 PBS 洗涤后，将每片切片置于 DAB 溶液中孵育，直至神经元结构的生物胞素染色可见。通过将切片转移至冷的 PBS 中终止反应。然后使用毛笔将切片置于玻璃载玻片上。去除多余的 PBS 后，加入封片剂。用盖玻片覆盖切片，并使其自然风干，操作方法如前所述。找到一个健康的锥体细胞并进行膜片钳记录。如果需要鉴定突触后细胞，应使用宽场光学显微镜定位表达荧光标记物的细胞。持续两毫秒的单次光脉冲可诱导出简单的波形光遗传兴奋性突触后电位。通过施加5、10和20赫兹的光刺激串刺激，可检测突触的短期可塑性。在研究长时程可塑性时，将胆碱能激动剂卡巴胆碱加入循环的aCSF中持续10分钟，可诱导出长时程抑制效应，该效应在去除配体后40分钟仍清晰可见。通过组织学方法检测了注射位点的长度。荧光报告基因mCherry定位于前边缘皮层和下边缘皮层的深层区域。此外，对生物胞素标记的细胞进行染色，进一步确认了其位置和形态。本方案的关键步骤包括对传入脑区进行准确的转导（可在事后验证）以及在制备急性脑片时快速解剖脑组织。该操作可轻松结合对特定细胞类型的荧光标记，例如某一类中间神经元亚型。为此，我们将使用一种转基因动物，该动物在特定细胞类型中表达重组酶。病毒递送的光遗传学工具使得系统神经科学和神经环路研究领域取得了快速进展。

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