离体 从内侧前额叶皮层到外嗅皮层的远距离突触传递和可塑性的光遗传学询问

在这里，我们提出了一种协议，描述了具有光遗传学构建体的离散大脑区域的病毒转导，以允许在急性啮齿动物脑切片中进行突触特异性电生理表征。

病毒传递的光遗传学构建体允许对急性脑切片中特定突触的生理和可塑性进行详细的电生理学表征。光遗传学激活突触的主要优点是能够研究远程途径，以及对未在解剖学上分离的轴突的选择性刺激。演示该程序的将是来自我们实验室的研究助理Lisa Kinnavane博士。

首先，将汉密尔顿注射器装入微注射泵中，该注射泵连接到安装在立体定位框架上的可移动臂。然后将五微升等分试样的病毒放入微量离心机中。旋转试管几秒钟，然后将两微升病毒制剂移液到试管的盖子中。

要用病毒制剂填充注射器，请用手术显微镜观察针尖。然后手动将病毒推注放在针尖，并使用泵控制取出注射器柱塞。将泵注射量设置为 300 纳升，将流速设置为 100 纳升/分钟。

运行泵并通过观察针尖处的病毒液滴来确认正常流动。在棉签上吸收病毒，并用70%乙醇清洁针头。接下来，使用立体定位框架上的调节螺钉，将针尖导航到前膛，并记下在框架上的三个游标尺度上观察到的立体定位测量值。

从布雷格玛坐标中增加或减去这些距离。使用安装在立体定位臂上的微型钻头在颅骨表面打一个毛刺孔。将针头插入预定的背腹坐标处的大脑中，并注入预定体积的病毒制剂。

输注后，将针头留在原位 10 分钟，以便推注扩散。然后取下针头，并运行泵以确保针头没有堵塞。病毒注射两周后，对大鼠实施安乐死，迅速解剖整个大脑，并将其转移到蔗糖切割溶液中。

使用金属茶匙，拿起大脑，丢弃多余的溶液，然后将其放在滤纸上。使用手术刀切除小脑，并在冠状平面上切开大脑，大约沿其长度的一半。后半部分是LEC组织块。

将组织块和剩余的大脑返回到蔗糖切割溶液中。接下来，将一滴氰基丙烯酸酯胶水放在振动切片机载物台上，然后将其铺成薄薄的一层。然后用茶匙挑起LEC组织块，并将其转移到胶贴上，使前冠状切口粘附。

将载物台安装到振动切片机组织室中，并快速倒入足够的蔗糖切割溶液以浸没组织。将组织块的腹面朝向叶片后，使用缓慢的叶片前进速度从腹侧到背侧切割 350 微米厚的切片。通常，每个半球可以获得七个切片。

将切片转移到切片收集室。然后将收集室置于34摄氏度的水浴中一小时，然后恢复到室温。将大脑的其余部分放入多聚甲醛中48小时。

对于靶细胞鉴定，将切片放入记录室，并使用切片锚将其固定。在低放大倍率下，使用红外照明，导航到LEC第五层。然后换成高倍率的水浸物镜，并识别锥体神经元。

用胶带标记显示器上单元格的位置。接下来，形成全细胞膜片钳，制造硼硅酸盐玻璃微量移液器，并用细胞内记录溶液填充。将填充的微量移液器放入电极支架中，并通过用力吹入连接到电极支架侧端口的吹嘴来施加正压。

抬起显微镜物镜，使弯月面形成，并将电极插入弯月面，直到可以在显微镜上看到。打开密封测试窗口，确定移液器阻力是否为三到五兆欧。然后用移液器吸头触摸识别的细胞，导致细胞膜上出现压痕。

接下来，通过吸嘴施加负压，增加移液阻力。继续逐渐施加负压，直到细胞膜破裂，导致整个电池电容瞬变。要进入电流钳配置，请使用带有滤光片立方体和适当光学元件的安装在显微镜光路中的 LED，并通过 40X 物镜将光脉冲施加到切片上。

以 5 赫兹、10 赫兹和 20 赫兹提供多个光脉冲序列，以研究突触前释放特性。为了让生物细胞素充满神经元，请在进入整个细胞配置后等待至少15分钟。在电压钳位中，监视膜电容和输入电阻。

然后沿着接近角缓慢地将移液器从细胞的躯体上抽出，观察电容瞬变和膜电流的缓慢消失，表明细胞膜的重新密封并在移液器尖端形成由外的贴片。将切片放入24孔板中的多聚甲醛中并孵育过夜。使用OCT培养基，将组织块连接到低温恒温器标本盘上。

要冷冻组织，请将异戊烷放入适当的容器中并浸没标本盘，确保组织高于异戊烷的水平。然后将异戊烷容器降低到液氮中，并使组织冻结。一旦组织完全冷冻，将组织块留在零下 20 摄氏度的低温恒温室中 30 分钟，以使块的温度平衡。

平衡后，在低温恒温器中切割40微米厚的切片，并用细画笔将切片从刀片上引导。将这些冷冻切片粘附在室温聚-L-赖氨酸涂层玻璃显微镜载玻片上，方法是将载玻片接触切片。向每张载玻片添加 150 微升安装介质后，应用盖玻片，并通过轻轻按压盖玻片去除任何气泡。

盖上载玻片以防止光漂白，并让它们风干 12 小时。然后使用荧光显微镜检查病毒注射部位的位置。对于生物细胞素染色，将切片在PBS中的3%过氧化氢中孵育30分钟，以阻断任何内源性过氧化物酶活性。

然后用PBS清洗脑切片，直到看不到更多的氧气气泡。接下来，将切片在含有0.1%Triton X-100的PBS中的1%亲和素生物素化HRP复合物溶液中孵育3小时。六次PBS洗涤后，将每个切片在DAB溶液中孵育，直到神经元结构的生物细胞素染色变得可见。

通过在冷PBS中转移切片来停止反应。然后用刷子将切片安装到玻璃显微镜载玻片上。去除多余的PBS后，添加安装剂。

如前所述，用盖玻片盖住切片，让它们风干。找到并修补了一个健康的锥体细胞。如果需要突触后细胞鉴定，应使用宽场光学定位表达荧光标记物的细胞。

两毫秒的单光脉冲导致简单的波形光遗传学兴奋性突触后电位。通过施加5、10和20赫兹的光刺激来检查突触的短期可塑性。在研究长期可塑性时，将胆碱能激动剂卡巴酚添加到循环aCSF中10分钟会导致长期抑郁，在去除配体40分钟后仍然明显。

对注射部位的长度进行组织学检查。荧光报告基因mCherry定位于边缘前皮层和边缘下皮层的深层。此外，对充满生物细胞素的细胞进行染色证实了其位置和形态。

该方案的关键步骤是传入大脑区域的准确转导，可以在事后验证，并在准备急性切片时快速解剖大脑。该过程很容易与单个细胞类型的荧光标记相结合，例如特定的中间神经元亚类。为此，我们将使用一种在该特定细胞类型中表达重组酶的转基因动物。

病毒传递的光遗传学构建体使系统和电路神经科学领域取得了快速发展。