离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

通过病毒递送的光遗传学工具可实现对急性脑片中特定突触的生理学特性及可塑性进行详细的电生理表征。光遗传学激活突触的主要优势在于能够研究长程神经通路，以及刺激在解剖结构上未分离的轴突。本实验操作将由本实验室的研究助理 Dr.Lisa Kinnavane 演示。

首先，将 Hamilton 注射器装入固定在立体定位仪可移动臂上的显微注射泵。然后取 5 µL 病毒样品置于微量离心管中。短暂离心数秒后，用移液器吸取 2 µL 病毒悬液至管盖内。

使用手术显微镜观察针尖，将病毒制剂的液滴手动置于针尖处，然后通过泵的控制装置回抽注射器活塞。将泵的注射体积设为 300 纳升，流速设为 100 纳升每分钟。

启动泵并观察针尖处病毒液滴，以确认流速正常。用棉签吸取病毒液，并用70%乙醇清洁针头。接着，使用立体定位仪框架上的调节螺钉，将针尖移至前囟，记录框架上三个游标尺显示的立体定位读数。

将这些距离加到或从bregma坐标中减去。使用安装在立体定位仪臂上的微型钻头在颅骨表面钻出一个孔。将针头插入脑内预定的背腹向坐标位置，并注入预定体积的病毒制剂。

输注后，将针头留置10分钟，以使推注液充分扩散。随后拔出针头，并启动泵以确认针头未堵塞。病毒注射两周后，处死大鼠，迅速分离全脑，并将其转移至蔗糖切片液中。

使用金属茶匙取出脑组织，弃去多余的溶液，将其放置在滤纸上。使用解剖刀切除小脑，并沿大脑长度方向约中点处冠状切开大脑。后半部分即为LEC组织块。

将组织块和剩余的脑组织放回蔗糖切片液中。接着，在振动切片机载物台上滴一滴氰基丙烯酸酯胶水，并将其铺成一层薄层。然后用小勺取下 LEC 组织块，转移到胶水区域，使前部冠状切面粘附在胶水上。

将样本台安装到振动切片机的组织室中，并迅速倒入足够的蔗糖切割液以浸没组织。将组织块的腹侧朝向刀片定位后，以较慢的刀片推进速度从腹侧向背侧切割350微米厚的切片。通常每个半脑可获得七片切片。

将脑片转移至脑片收集室，随后将收集室置于34摄氏度水浴中孵育1小时，之后恢复至室温。将剩余脑组织置于多聚甲醛中固定48小时。

为了识别靶细胞，将脑片放入记录室中，并使用脑片固定器将其固定。在低倍镜下，利用红外照明，移动至外侧内嗅皮层第五层。然后切换至高倍水浸物镜，识别锥体神经元。

用胶带在显示器上标记细胞的位置。接下来，为形成全细胞膜片钳，制备一根硼硅酸盐玻璃微电极，并用细胞内记录液填充。将填充好的微电极放入电极夹持器中，并通过向连接至电极夹持器侧端口的吹管用力吹气，施加正压。

调高显微镜物镜，使形成弯月面，并将电极插入弯月面直至在显微镜下可见。打开封接测试窗口，确认移液管电阻是否为3至5兆欧。然后用移液管尖端接触已识别的细胞，使细胞膜产生压痕。

接下来，通过在吹嘴处施加负压吸引，增加移液管的电阻。持续逐渐施加负压，直至细胞膜破裂，形成全细胞电容瞬变。要进入电流钳模式，使用安装好的LED，将其光线通过滤光镜组和适当的光学元件导入显微镜光路，并通过40倍物镜向脑片施加光脉冲。

以5赫兹、10赫兹和20赫兹的频率递送多光脉冲序列，以研究突触前释放特性。为使生物胞素充分填充神经元，在建立全细胞记录模式后，至少等待15分钟。在电压钳模式下，监测细胞膜电容和输入电阻。

然后沿进针角度缓慢将移液管从细胞胞体处撤出，观察电容瞬变信号和膜电流的逐渐消失，这表明细胞膜正在重新封闭，并在移液管尖端形成外向朝外的膜片。将脑片放入含有多聚甲醛的24孔板中，4℃孵育过夜。使用OCT包埋介质将组织块固定于冷冻切片机的样品盘上。

为冷冻组织，将异戊烷放入合适的容器中，并将标本盘浸入其中，确保组织位于异戊烷液面以上。然后将盛有异戊烷的容器放入液氮中，使组织冷冻。待组织完全冻结后，将组织块置于冷冻切片机舱内，于零下20摄氏度放置30分钟，使组织块温度达到平衡。

平衡后，在冷冻切片机中切出40微米厚的切片，并使用细毛刷将切片从刀片上轻轻引导下来。通过将载玻片接触切片，使这些冷冻切片贴附于室温下的聚-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片上。每张载玻片上加入150 µL封片剂后，盖上盖玻片，并通过轻轻按压盖玻片去除任何气泡。

用盖玻片覆盖以防止荧光淬灭，并让其风干 12 小时。然后使用荧光显微镜观察病毒注射部位的位置。对于生物胞素染色，将脑片在含 3% 过氧化氢的 PBS 溶液中孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。

然后用 PBS 清洗脑切片，直至无进一步的氧气气泡出现。接着，在含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 中，将切片在 1% 亲和素-生物素化 HRP 复合物溶液中孵育三小时。经过六次 PBS 洗涤后，将每片切片置于 DAB 溶液中孵育，直至神经元结构的生物胞素染色可见。

通过将切片转移至冷的 PBS 中终止反应。然后使用毛笔将切片置于玻璃载玻片上。去除多余的 PBS 后，加入封片剂。

用盖玻片覆盖切片，并使其自然风干，操作方法如前所述。找到一个健康的锥体细胞并进行膜片钳记录。如果需要鉴定突触后细胞，应使用宽场光学显微镜定位表达荧光标记物的细胞。

持续两毫秒的单次光脉冲可诱导出简单的波形光遗传兴奋性突触后电位。通过施加5、10和20赫兹的光刺激串刺激，可检测突触的短期可塑性。在研究长时程可塑性时，将胆碱能激动剂卡巴胆碱加入循环的aCSF中持续10分钟，可诱导出长时程抑制效应，该效应在去除配体后40分钟仍清晰可见。

通过组织学方法检测了注射位点的长度。荧光报告基因mCherry定位于前边缘皮层和下边缘皮层的深层区域。此外，对生物胞素标记的细胞进行染色，进一步确认了其位置和形态。

本方案的关键步骤包括对传入脑区进行准确的转导（可在事后验证）以及在制备急性脑片时快速解剖脑组织。该操作可轻松结合对特定细胞类型的荧光标记，例如某一类中间神经元亚型。为此，我们将使用一种转基因动物，该动物在特定细胞类型中表达重组酶。

病毒递送的光遗传学工具使得系统神经科学和神经环路研究领域取得了快速进展。