Caenorhabditis elegans 作为发现抗多聚谷氨酰胺介导神经毒性的生物活性化合物的模型系统

秀丽隐杆线虫（C.elegans）作为一种强大的动物模型，广泛应用于神经退行性疾病和行为学研究，可利用亨廷顿病样模型高效筛选和评估针对多聚谷氨酰胺神经毒性的毒性化合物。该技术的主要优势在于能够对不同秀丽隐杆线虫模型中的多种表型进行特征分析和整合。本方法中实际使用的也正是秀丽隐杆线虫模型。

该方法为其他神经退行性疾病乃至其他疾病治疗候选物的筛选和研究提供了尺寸依据。请注意秀丽隐杆线虫（C.elegans）生长过程中所使用的温度，并在正确的发育阶段进行实验。演示该实验步骤的将是三位研究生：Jiang Yiyi、Xioa Yue 和 Wang Qiangqiang。

首先，将300至500条同步化的AM141线虫L1幼虫转移至含有500微升S培养基的48孔板的每个孔中，S培养基中包含大肠杆菌OP50菌株及5毫克/毫升的黄芪多糖。用封口膜密封培养板，在20摄氏度、120转/分钟条件下振荡培养所需时间。将线虫转移至无菌的1.5毫升微量离心管中，用M9缓冲液通过离心洗涤三次，以去除残留的OP50菌体。

然后，将AM141线虫重悬于M9缓冲液中。接着，将10至15条线虫转移至384孔板的每个孔中，每种处理设置10个重复孔，并向每孔加入10微升200毫摩尔的叠氮化钠，使线虫麻痹并沉降至孔底。将该孔板置于高内涵成像系统中，以获取荧光图像。

打开图像采集软件，并根据文稿中提到的参数进行设置。通过打开数据审阅板窗口并选择用于图像分析的检测板来分析图像数据。双击一个检测孔以显示其图像。

然后选择“计数细胞核”作为分析方法，并点击“配置设置”按钮。定义来自FITC通道的源图像，并选择标准算法。根据文本稿件中描述的图像分析参数进行设置，并进行测试以优化分析方法。

保存设置并对所有孔进行分析。将总细胞核数导出为每孔中Q40:YFP聚集体的总数。计数每孔中的线虫数量，并计算每组中每条线虫Q40:YFP聚集体的平均数量。

然后，计算抑制指数。为进行多聚谷氨酰胺（polyQ）神经毒性检测，将300至500条同步化的HA759线虫L1幼虫转移至48孔板的每个孔中，每孔加入500微升含有大肠杆菌OP50菌株和5毫克/毫升黄芪多糖的S培养基。密封培养板后，按照之前所述方法进行培养、收集，并将线虫重悬于M9缓冲液中。

现在，通过将两克琼脂糖加入100毫升M9缓冲液中制备琼脂糖垫，并将溶液放入微波炉加热至接近沸腾。取0.5毫升熔化的琼脂糖，滴加到置于两块2毫米厚玻璃板之间的1毫米厚显微镜玻片中央，再垂直覆盖另一块玻片。待琼脂糖冷却凝固后，轻轻移除顶部的玻片。

开始ASH神经元存活率检测时，先在琼脂垫上加入一滴20毫摩尔的叠氮化钠，然后将15至20条HA759线虫转移至液滴中以使其固定。轻轻盖上盖玻片。随后，将载玻片置于配有数字相机的荧光显微镜下观察。

选择40倍物镜和FITC滤光片，以检测线虫头部区域表达GFP阳性的ASH神经元。每组随机选取50只以上的线虫，统计头部区域具有GFP标记的双侧ASH神经元的线虫数量，然后计算ASH神经元的存活率。对于渗透压回避实验，通过在培养皿中央划一条8摩尔的甘油线，将无食物的NGM平板划分为正常区和陷阱区。

然后，在距离甘油线约一厘米处铺设一条200毫摩尔的叠氮化钠线，以麻痹穿过甘油屏障进入捕获区的线虫。每组取约200条线虫，分别转移至三个重复培养皿的正常区域。随后，在捕获区加入一滴1%丁二酮，以吸引线虫。

立即盖上培养皿盖，在23摄氏度下孵育90分钟。在显微镜下对两个区域的线虫数量进行计数，并计算回避指数。转基因多聚谷氨酰胺菌株AM141在其体壁肌细胞中强烈表达Q40:YFP融合蛋白，通过该自动化成像与分析方案可识别；astragalan处理抑制了该蛋白表达量的增加，表明其具有保护潜力。

线虫头部区域GFP荧光的消失以及双侧ASH神经元的缺失表明ASH神经元发生死亡。该ASH神经元存活检测可用于直观评估待测化合物对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）神经元的神经保护作用。通过化学感受回避实验，可检测待测样品对由多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集介导的ASH神经元功能丧失的影响。

在15摄氏度下用黄芪多糖处理三天的HA759线虫，其避害指数增加至0.6以上，表明该多糖对行为缺陷具有神经保护作用。为评估待测化合物的整体神经保护能力，将各项单独实验的数据进行整合，并以雷达图形式呈现，显示黄芪多糖处理组构成的三角形面积大于对照组，提示该多糖具有抗多聚谷氨酰胺（polyQ）效应。请注意，食物、温度和湿度可能影响秀丽隐杆线虫（C.elegans）的行为。