间期荧光 原位 多发性骨髓瘤骨髓涂片杂交

荧光原位杂交（FISH）在多发性骨髓瘤遗传学风险分层中的应用至关重要。FISH检测报告的关键在于并非所有有核细胞，而是特异性纯化或通过抗CD138磁珠分选、或利用胞质κ或λ轻链免疫球蛋白标记所鉴定出的克隆性浆细胞，后者结合FISH检测称为cIg FISH。由于骨髓中浆细胞所占比例相对较低，浆细胞分选后的间期FISH或cIg FISH在多发性骨髓瘤的诊断中具有重要意义。

然而，这些方法存在一些不足之处，包括操作流程复杂、对标本需求量大以及实验成本较高。浆细胞可在骨髓涂片中快速定位。基于这一特点，我们采用骨髓涂片荧光原位杂交（FISH）技术来检测多发性骨髓瘤细胞。

本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并经武汉大学中南医院伦理委员会批准。样本采集自中国武汉大学中南医院血液科的一名多发性骨髓瘤患者。取最初的0.2毫升骨髓液置于洁净的一次性玻璃载玻片上，通过快速推片法将骨髓涂片推至均匀厚度并形成尖尾，随后自然晾干。

在室温下，将一毫升 Wright-Giemsa 溶液覆盖于骨髓涂片上，作用约 10 秒。向载玻片上加入一毫升磷酸盐缓冲液，注意防止染液干燥或从载玻片上流失。轻轻混匀染液，并在室温下维持 15 分钟。

用洁净水冲洗载玻片，并在室温下空气中干燥。使用正置光学显微镜检测恶性浆细胞，浆细胞应分散良好。现在我们在视野中看到的浆细胞分布较为均匀。

这是一种典型的双核核浆细胞。用固定液覆盖杂交区域，作用10分钟，以脱色并固定浆细胞。用去离子水冲洗载玻片，并在室温下空气中自然干燥。

将含有2倍SSC缓冲液的容器在水浴中预热至56摄氏度。将制备好的骨髓涂片放入预热的2倍SSC缓冲液中洗涤10分钟，随后浸入室温去离子水中。依次在70%、85%和100%乙醇中进行梯度脱水，每种浓度乙醇中各浸泡1分钟。

将涂片在空气中干燥10分钟。首先将TP53与17号染色体着丝粒探针混合物加至杂交区域，盖上盖玻片，用尖头镊子轻轻按压以去除盖玻片下的气泡。用橡胶胶水密封盖玻片的所有边缘，以确保良好的密封性。

橡胶水泥凝固后，将载玻片置于自动FISH仪中，在78摄氏度下变性5分钟，随后在37摄氏度下杂交过夜。从FISH仪中取出载玻片，使用尖头镊子轻轻去除橡胶水泥。

将载玻片浸入2倍SSC溶液中，室温下孵育约一至两分钟，以洗去盖玻片。随后将载玻片置于68 °C预热的缓冲液中，于水浴中洗涤两分钟。再将载玻片放入2倍SSC溶液中，在37 °C水浴中洗涤一分钟。

在暗处放置，使载片完全干燥，持续10分钟；在杂交区域加入10 µL DAPI，盖上盖玻片。使用荧光显微镜配备适当的滤光片组观察杂交后的载片，采用单色蓝色荧光染料光学滤光片观察细胞核的荧光强度。在DAPI滤光片组下拍摄细胞核图像。

CEP17 被标记为绿色荧光。使用光谱绿色荧光素光学滤光片观察 CEP17 的位置。在绿色滤光片组下拍摄 CEP17 信号图像。

TP53基因以橙色荧光标记。使用光谱橙色荧光素光学滤光片观察TP53，在设定条件下拍摄TP53信号图像，将这三幅图像合并为一幅整体图像，并检测是否存在数目异常。在正常的间期细胞中，可在显示蓝色荧光的细胞核内观察到两个橙色信号和两个绿色信号，代表一对正常的17号染色体。

结果显示了多发性骨髓瘤患者骨髓的形态学和遗传学特征。图A显示，在骨髓涂片中发现15%的浆细胞较正常细胞具有更大且着色更深的细胞核，以及更大量的细胞质。图B显示了骨髓涂片中一个有核浆细胞的代表性灰度图像。

图C显示一个浆细胞间期细胞核中有四个橙色信号和四个绿色信号，提示该细胞核中存在四条17号染色体。图D显示该患者的异常染色体核型图证实一个细胞核中含有两对17号染色体。骨髓涂片比抗凝骨髓标本更容易获取，因为获取抗凝骨髓需要复杂的操作步骤才能获得细胞核。

因此，我们建立了一种可靠的骨髓涂片FISH方法，用于检测多发性骨髓瘤细胞。