基于显微镜的测定，用于使用SNARE运输研究和分析回收内体
2022年2月12日
回收内体是内体管网络的一部分。在这里，我们提出了一种使用GFP-STX13作为细胞器标记来量化回收内体动力学的方法。
基于显微镜的测定，使用SNARE运输来研究和分析回收内体。这些是皮肤黑素细胞。你在细胞内看到的黑色细胞器被称为黑素体。
黑素体被称为一类称为溶酶体相关细胞器或LRO的细胞器。回收内体是来自所有细胞类型的早期或分类内体的管状囊泡细胞器。这些细胞器在黑色素体的生物发生中起关键作用，黑素体是由黑素细胞产生的溶酶体相关细胞器。
回收内体在形成过程中将黑素细胞特异性货物输送到过早的黑素体。在几种综合征中观察到的循环内体的产生是皮肤，头发和眼睛色素沉着过度的细胞。因此，研究循环内体的动力学有助于了解这些细胞器在正常和疾病条件下的功能。
本研究旨在使用阻止SNARE语法in-13来测量循环内体的动力学。第一步是在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞。将玻璃盖玻片涂在基底膜基质介质的培养皿中。
并在组织培养罩中干燥15分钟。使用前用1X PBS清洗盖玻片一次。在基底膜介质上接种细胞，以50%至60%的能力接种盖玻片。
始终在完整的RPMI培养基中向电镀的细胞悬浮液中加入200纳摩尔的PMA。接种细胞后，将含有细胞的培养皿在CO2培养箱中孵育12至24小时。第二步是用语法蛋白-13质粒转染细胞。
孵育含有DNA和转染试剂的吸头，混合五分钟，无需重复移液。在室温下，每10分钟用手敲击管子30分钟。在孵育期间，用1X PBS洗涤细胞两次，一次用OPTI-MEM洗涤细胞，然后向细胞中加入1密耳的OPTI-MEM。
孵育30分钟后，通过覆盖培养皿以滴滴方式将转染试剂DNA混合物加入细胞中。将细胞在37摄氏度下孵育六个小时。用转染试剂吸出OPTI-MEM培养基，并加入补充200纳摩尔PMA的完整RPMI培养基。
将细胞在37摄氏度下孵育48小时。第三步是细胞的固定。请注意，以下程序在组织培养罩外进行。
转染48小时后，用1X PBS洗涤细胞两次，然后用3%甲醛固定细胞30分钟。固定后，用1X PBS洗涤细胞两次，并将盖玻片储存在1X PBS中直至进一步使用。或者，电池可以安装在玻璃板上或储存在四摄氏度。
第四步是细胞的免疫染色。准备一个潮湿的腔室。将石膏膜切割片放在培养皿中的鼠标滤纸上。
盖上铝箔。制备25微升一抗溶液。以1至200的稀释液加入抗体。
将此溶液作为滴剂添加到潮湿室中的parafilm上。用镊子小心地抬起盖玻片。将其倒置在一抗染色液的滴上，然后盖上潮湿室的盖子。
在室温下孵育30分钟。同样，以1至500的稀释度制备二抗溶液，并将其放在潮湿室盖玻片旁边的副膜上。为了染色细胞核，以120，000至130，000的稀释度向溶液中加入DAPI。
使用镊子，小心地从一抗溶液中取出盖玻片，并将其浸入1X PBS中两次。轻触薄纸上的盖玻片，以清除盖玻片上多余的PBS。将其放在潮湿室中的二抗染色溶液上，并且由于溶液中存在荧光染色抗体，因此不要将其暴露在光线下。
孵育后，小心地从二抗溶液中取出盖玻片，然后将其浸入1X PBS中两次。此外，点击薄纸上的盖玻片以除去盖玻片上多余的PBS。将12微升成像试剂放在载玻片上，并小心地将染色的盖玻片放在安装试剂上。
倒置薄纸上的载玻片，然后轻轻按压。接下来，使用荧光显微镜对盖玻片进行成像，并使用ImageJ分析图像。第六步是定量回收内体局部蛋白质和黑素体之间的重叠。
用黑素体定量语法蛋白-13 delta-129共定位。小鼠野生型黑素细胞中 syntaxin-13 的免疫荧光显微镜检查显示 GFP-syntaxin-13 野生型定位为囊泡和管状结构。GFP-syntaxin-13 delta-129除了细胞表面外，还定位环状结构。
此外，细胞内环状GFP-syntaxin-13 delta-129在明场成像的黑素体中显示出与黑素体蛋白TYRP1的共定位。如前所述，在黑素体中观察到一组过度表达的GFP-syntaxin-13野生型。为了测量GFP-syntaxin-13野生型和GFP-syntaxin-13 delta-129对黑素体的相对定位，使用斐济软件并使用JACOP插件进行了分析。
与具有TYRP1的GFP-syntaxin-13野生型相比，测量的Mander重叠系数（即MOC）与具有TYRP1的GFP-syntaxin-13 wild类型相比高出约1.5倍。有趣的是，与GFP-syntaxin-13 wild类型相比，TYRP1的GFP-syntaxin-13 delta-129的MOC值高出2.9倍。这些数据表明，在稳态下，GFP-syntaxin-13 delta-129黑素体的定位相对高于GFP-syntaxin-13野生型。
定量synan-13野生型定位的回收内体。GFP-syntaxin-13野生型的免疫荧光显微镜检查显示与已知的循环内体蛋白Rab11共定位。与具有GFP-syntaxin-13野生型的mCherry-Rab11相比，具有mCherry-Rab11的GFP-syntaxin-13野生型之间的MOC大约高出1.4倍。
为了测量GFP-syntaxin-13野生型阳性内体小管的数量和长度，使用了斐济软件，如方案部分所述。mCherry-Rab11在实验中使用阳性对照。与表达mCherry-Rab11的细胞相比，转染GFP-syntaxin-13野生型的黑素细胞显示出每个细胞的肾小管数量更多。
然而，当细胞中GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11共表达时，肾小管减少。第七步是定量回收内体的管状数量和长度。当细胞中GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11共表达时，肾小管减少。
有趣的是，GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11的平均肾小管长度在单独或一起表达的细胞中彼此相当。总之，这些数据表明GFP-syntaxin-13野生型定位为与Rab11相似的回收内体。这项研究表明，syntaxin-13突变体的N端递送，即GFP-syntaxin-13 delta-129，定位于黑素体GFP-syntaxin-13 delta-129可以用作从循环内体到细胞表面和LRO的水泡运输的报告。
相比之下，GFP-syntaxin-13野生型定位为与Rab11相似的循环内体。本研究表明，GFP-syntaxin-13野生型也可用于标记黑素细胞中的循环内体。GFP-syntaxin-13野生型可能比Rab11更好地回收内体标记，因为Rab11改变了内体动力学。
总而言之，GFP-syntaxin-13野生型作为潜在的回收内体标记，以研究稳态条件下的动力学。
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概述
本研究利用GFP-STX13作为标记物，探讨皮肤黑素细胞中再循环内体的动力学。研究重点在于再循环内体在黑素体生物发生中的作用、其在正常生理功能中的角色，以及在色素沉着过度等病理状态中的意义。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 内体运输
- 黑素细胞生物学
背景
- 再循环内体在多种细胞类型中对细胞功能至关重要。
- 黑色素体是黑色素细胞中由再循环内体衍生而来的特殊细胞器。
- 了解再循环内体的动态变化对于认识色素沉着障碍具有重要意义。
使用的方法
- 利用免疫荧光显微镜观察内体动态。
- 以小鼠黑素细胞作为生物学模型系统。
- 采用定量成像技术分析蛋白质定位。
主要结果
- 展示了GFP-STX13与黑色素体及循环内体标记物的共定位。
- 揭示了野生型与突变型syntaxin-13在定位动态上的差异。
- 提供了内体相关蛋白之间重叠程度的定量测量结果。
结论
- 该研究展示了黑色素细胞中回收内体的复杂动态过程。
- 研究结果增进了对细胞器在皮肤色素沉着及相关疾病中功能的理解。
常见问题
行业重要性概述
这种基于显微镜的检测方法可实现对黑素细胞中再循环内体动态的定量分析，为研究与色素沉着障碍相关的细胞器运输机制提供了有力工具。该方法利用SNARE蛋白运输作为读出指标，支持溶酶体相关细胞器生物发生通路中的靶点验证。该检测可生成可重复的成像数据，有助于针对内体运输调节剂的早期发现决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可验证SNARE介导的再循环内体向黑色素体运输过程中的膜运输假说。
- 操作价值：提供标准化的成像工作流程，用于评估活细胞模型中蛋白质定位的动态变化。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的共定位指标（Mander 重叠系数），用于比较野生型与突变型 syntaxin-13 的运输模式。
- 操作价值：建立了一种可重复的荧光显微镜实验方案，用于测量内体小管的数量和长度。
转化与临床前研究
- 科学价值：将回收型早期内体功能障碍与Hermansky-Pudlak综合征模型中观察到的色素减退表型联系起来。
- 应用价值：提供了一种与疾病相关的系统，用于评估影响黑素体生成的运输调节因子。
流程与工作流整合
该检测适用于早期发现工作流程，在检测方法开发之前，用于探究内体运输机制以进行靶点验证和通路阐明。
- 发现生物学：支持对SNARE蛋白在细胞器特异性货物运输中作用的假设验证。
- 筛选：提供定量成像结果，可用于比较不同遗传或药物干扰条件下囊泡运输状态。
- 分析：以Mander重叠系数和管状结构形态测量作为可量化的指标，评估运输效率。
- 转化研究：将内体动态变化与黑素体的生物发生过程相联系，该过程与色素相关性疾病密切相关。
- 企业级复用：该成像与定量方法可拓展应用于其他SNARE蛋白或细胞器运输相关研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可视化循环内体与溶酶体相关细胞器之间的物质流，提高靶向内体运输节点的预测可信度。
- 操作价值：标准化固定、免疫染色和成像方案，以实现一致的亚细胞定位分析。
- 战略价值：基于定量共定位和结构变化，支持对运输靶点进行推进或终止决策。
- 项目组合影响：支持对影响细胞器生物发生通路的调节因子进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备免疫荧光显微镜技术以及使用Fiji/JACOP进行定量图像分析的专业知识。
- 依赖于荧光显微镜设备，以及针对SNARE蛋白和细胞器标志物的兼容性抗体试剂。
- 为实现可重复的管状结构定量，需在细胞接种、转染和固定时间等方面进行标准化操作。
- 若应用于其他细胞类型，可能需要优化基底膜包被条件和PMA的添加浓度。
- 实际应用中的局限性包括对过表达系统的依赖，这可能改变内源性囊泡运输的动力学过程。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:06
Introduction
1:04
Seeding of Mouse Melanocytes on Pre-Treated Coverslips
1:42
Transfection of Cells with the STX13 Plasmids
2:39
Fixation of the Cells
3:11
Immunostaining of the Cells
5:05
Results: Quantification of Overlap Between the RE Localized Proteins and Melanosomes
7:25
Results: Quantification of Recycling Endosomes' Tublar Number and Length
7:56
Conclusion
