儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测

弥漫性中线胶质瘤是一种高度侵袭性的脑肿瘤。该方法有助于实时研究弥漫性中线胶质瘤（DMG）细胞在三维环境中的迁移与侵袭行为，并可深入探究关键黏附分子的潜在作用。通过使用标记试剂和特异性抗CD44抗体，我们可利用活细胞成像技术，在三维迁移和侵袭过程中研究DMG细胞质膜上CD44的表达情况。

该技术的应用凸显了CD44在这些细胞运动能力中的潜在作用，提示其可能成为一个有价值的侵袭性分子靶点。首先，通过加入100 µL无菌水重新水化ALR，并用移液器吹打混合溶液。将抗体与ALR在TSM培养基中于圆底多孔板或棕色管中混合，并避光保存。

配制足够量的培养基，以每孔25微升的量分装，使其终浓度为检测终浓度的三倍，然后在室温下孵育15分钟。将BSR用TSM培养基稀释至1.5毫摩尔浓度，以确保在检测结束时终浓度为0.5毫摩尔。随后，轻柔缓慢地从每孔中移除75微升培养基，避免触碰含有NS的孔底，并通过肉眼检查NS的存在情况。

轻轻向每个孔中加入 25 µL 的 BSR 和 ALR 抗体复合物，使 ALR 抗体复合物与培养基混合 2 至 3 分钟。使用倒置显微镜，确保每个 NS 位于孔底部中央。用针头去除气泡，避免气泡产生。

将培养板置于冰上5分钟，使培养板底部变冷。使用预冷的P200吸头，将其靠在孔的内壁上，每孔加入75 µL BMM，避免产生气泡并避免接触孔底。将培养板继续置于冰上5分钟，使BMM与培养基充分混合。

使用倒置显微镜检查NS的位置。若其未位于中央，则在4摄氏度条件下以180 × g离心5分钟。随后将培养板转移至置于培养箱内的活细胞分析仪中，培养箱条件设置为37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度。当孔板被BMM包被后，剪切一个P200吸头。

从每个选定的孔中取 50 µL 细胞培养基和纳米传感器（NS），并转移至包被的平底孔中。通过肉眼观察每个孔中纳米传感器的存在情况及其位置。轻轻向每个孔中加入 50 µL 稀释后的 BSR 和 ALR 抗体，等待 2 至 3 分钟，使试剂充分混合。

使用倒置显微镜观察，确保大部分重复的 NS 位于孔的中央位置。确认无气泡后，轻柔地将培养板转移至活细胞分析仪器中，操作方法如前所述。在活细胞分析仪器的软件中，选择“计划采集”选项，然后点击加号标签，选择“定时扫描”，以按照文本稿件中所述的时间间隔对培养板进行扫描。

在软件窗口中，创建或恢复容器，然后点击“新建”选项。选择类球体扫描类型，侵袭实验选择相差加明场、绿色通道图像，物镜选择 4X。迁移实验选择稀释克隆扫描类型，物镜选择 4X，并选择相差和绿色通道。

选择板型，并通过在板图上高亮显示来定义需要扫描的孔，然后设置扫描频率。点击“添加到计划”并开始扫描。选择“创建新的分析定义”标签。

然后在选项卡上分别选择“类球体侵袭”或“基础分析”应用程序，用于侵袭和迁移分析。在图像通道中选择适用于侵袭和迁移的通道。从三到四个孔中选择几张具有代表性的图像，用于预览并优化分析设置。

对于侵袭实验，在分析定义选项卡中，根据文本稿件中提到的设置，调整明场和绿色荧光通道的应用参数，以实现类球体与侵袭细胞之间的精确分割。对于迁移实验，根据文本稿件中提到的设置，调整相位和绿色荧光通道的应用参数，以实现汇合区域与绿色荧光标记细胞之间的精确分割。通过随机选择多个孔，检查NS的分析设置是否正确。

选择要分析的孔和时间点。保存分析定义，然后单击完成。原代弥漫性中线胶质瘤（DMG）患者来源细胞中CD44表达的代表性免疫荧光共聚焦图像揭示了CD44在细胞迁移和侵袭中的作用。

活细胞三维免疫化学染色可实现CD44表达的可视化。迁移和侵袭过程的时间延时代表性图像显示，同一细胞在随时间观察时绿色荧光信号的出现与消失，提示在细胞迁移和侵袭过程中CD44的表达呈动态“开启”与“关闭”状态。迁移和侵袭过程持续观察96小时，结果显示QCTB-R059细胞具有高水平的CD44表达。

通过与迁移和侵袭相关的ALR整体绿色荧光信号，测量CD44表达量及其随时间的增加情况。当在活细胞上使用抗CD44抗体时，会影响细胞形态，诱导细胞从类间充质样侵袭转变为类阿米巴样侵袭，并降低这些细胞的侵袭和迁移能力。该方法最关键的步骤包括：将标记试剂与抗体混合，将混合物加入Matrigel和培养基，以及使用活细胞成像仪器。

通过使用两种或多种不同的标记试剂和抗体，可进一步实施本方法，以研究由直接细胞及细胞接触介导的弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DMG）细胞相互作用。本方法为在三维环境中研究DMG迁移与侵袭的细胞和分子机制提供了新工具，并为抑制其浸润性表型提供了新的研究方向。