Name: Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习使用低成本开源实验室机器人自动化进行Shotgun蛋白质组学样品处理，包括去污剂去除、蛋白质酶解和肽段脱盐步骤。该方法可提高通量、降低变异性，使更多实验室能够开展高效蛋白质组学研究。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目的支持，包括授予YH的F32-HL149191项目；授予EL的R00-HL144829项目；以及授予MPL的R21-HL150456、R00-HL127302和R1-HL141278项目。图&#160;1、图2、图3是借助基于网络的科学绘图工具BioRender.com制作的。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

方案中的关键步骤 
为了获得最佳性能，应使用经 Opentrons 验证且与 OT-2 兼容的实验耗材、模块和消耗品&#160;。自定义实验耗材可根据参考文献14中 Opentrons 的说明进行创建。首次使用时，务必对 OT-2 的工作台、移液器和实验耗材进行校准。同时，必须遵循 SP3 磁珠生产商的指南，以制备用于多肽和蛋白质纯化的磁珠。值得注意的是，在磁珠与多肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需 ≥95%，磁珠浓度需 ≥0.1 µg/µL。多肽浓度应保持在 10 µg/mL–5 mg/mL 范围内。根据本多肽纯化脚本中优化的参数，乙腈体积比为 95%，磁珠浓度为 0.37 µg/µL，多肽浓度范围为 14–37 µg/mL。根据我们的经验，100 µL 消化反应中的多肽质量估计为 40–100 µg。对于 SP3 蛋白质纯化，每 1 µg 蛋白质使用 5–10 µg 磁珠，并确保在蛋白质结合过程中磁珠最低浓度为 0.5 µg/µL。推荐的蛋白质浓度范围为 10 µg/mL–5 mg/mL。在所提供脚本的默认参数下，每 100 µg 蛋白...

基于质谱的鸟枪法蛋白质组学是一种强大的工具，可同时测量生物样本中多种蛋白质的丰度。结合生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于鉴定生物标志物，并发现支撑病理机制的相关生物复合物和通路。由于其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪法蛋白质组学在研究机构和诊断实验室的临床样本分析中也具有广阔的应用前景，且无需依赖抗体1,2。
为了准备用于鸟枪法蛋白质组学分析的蛋白质样品，通常需要首先对从生物样本（例如细胞和组织）中提取的蛋白质进行处理，处理过程包括测定样品的蛋白质浓度、蛋白质还原与烷基化，以及将蛋白质酶解为肽段。此外，使用含去垢剂的常用裂解缓冲液提取的蛋白质在分析前通常还需要额外的缓冲液置换或去垢剂去除步骤，因为去垢剂会干扰胰蛋白酶消化，并显著降低后续液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的性能3。在酶解完成后，肽段通常还需进一步脱盐、干燥，并重新溶解于适合LC-MS/MS分析的溶剂中。这些蛋白质生化操作步骤往往耗时且劳动密集，因此持续限制了蛋白质组学工作流程的通量，并增加了所获得数据的变异性4,5。人为误差和偏差已被认为是影响数据变异性和可重复性的关键因素6,7。为了最大限度减少质谱样品制备过程中的人为误差，已采用自动移液机器人系统来提高鸟枪法蛋白质组学和靶向质谱分析中蛋白质鉴定与定量的通量和可重复性；这些进展被认为对于推动蛋白质组学技术在重要科研和临床环境中的广泛应用至关重要8,9,10,11,12,13。然而，大多数现有方案所使用的机器人液体处理平台需要较高的资金投入和专业培训，这限制了其在许多学术机构或其他预算有限的实验室中的应用。
本文介绍了一种利用低成本、开源的机器人液体处理系统 OT-2 来半自动化典型鸟枪法蛋白质组学样品制备流程的实验方案。OT-2 的成本低于许多其他机器人液体处理系统，在撰写本文时，其价格约为 5,000 美元。若计入不同模块和实验耗材的费用，本方案在撰写本文时的实验搭建总成本约为 10,000 美元，相较于更昂贵的替代方案，使更广泛的实验室能够负担。OT-2 支持通过 Python 脚本进行开源编程，用户可高度灵活地自定义 DIY 协议设计。利用三个自主开发的脚本，以下方案涵盖了在 OT-2 平台上使用典型蛋白质标准品（牛血清白蛋白；BSA）和正常人心脏裂解液的复杂蛋白质样品执行典型鸟枪法蛋白质组学样品制备流程（图 1）。BSA 样品和复杂心脏裂解液样品的处理步骤分别在方案第 1、2、5、6 节和第 3、4、5、6 节中详细描述。采用 Sera-Mag 羧基修饰的磁珠进行单管固相增强样品制备（SP3），以去除蛋白质和肽段样品中的去垢剂和盐。来自牛血清白蛋白和人心脏蛋白的胰蛋白酶消化产物进一步通过 SP3 磁珠纯化，随后进行 LC-MS/MS 分析。质谱数据使用 MaxQuant 软件进行肽段和蛋白质的鉴定分析。我们获得的代表性结果表明，该方案在节省实验操作时间的同时，实现了优异的技术重复性变异系数（CV），且性能不逊于手工消化方法。

<table><tbody><tr><td>300 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四合一试管架套装</td><td>Opentrons</td><td></td><td>每套包含 2 个底座和 4 个管架顶部，适用于 1.5 mL、2 mL、15 mL + 50 mL、15 mL 和 50 mL 试管。本研究中使用了 2 mL 和 15 mL + 50 mL 的管架顶部。</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>#164568</td><td>3 &amp;mu;m 粒径；100 &amp;Aring; 孔径；75 &amp;mu;m × 150 mm</td></tr><tr><td>色谱-质谱级乙腈</td><td>VWR</td><td>#JT9829</td><td></td></tr><tr><td>铝块套装</td><td>Opentrons</td><td></td><td>该套装包含 3 个顶部，分别兼容 96 孔板、2.0 mL 管和用于 OT-2 温控模块的 PCR 条板。本文中使用了 2.0 mL 管架。</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># A6141</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白标准品，2 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23210</td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85190</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5545</td><td></td></tr><tr><td>EASY-Spray HPLC 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>#ES800A</td><td></td></tr><tr><td>EasynLC 1200 纳流液相色谱系统</td><td>Thermo Scientific</td><td>#LC140</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯度 195-200 证明</td><td>Fisher</td><td>#04-355-720</td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级甲酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85178</td><td></td></tr><tr><td>人心脏裂解液</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB820-59217</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I1149</td><td></td></tr><tr><td>磁力管架</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MR02</td><td></td></tr><tr><td>MAXQuant v.1.6.10.43</td><td></td><td></td><td>Tyanova 等，2016（https://www.maxquant.org/）</td></tr><tr><td>mySPIN 6 微型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>#75004061</td><td>台式微型离心机，用于快速离心</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96 孔深孔板，V 型底</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OT-2 磁力模块</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>OT-2 P300 单通道移液器</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>OT-2 P50 单通道移液器</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>OT-2 移液机器人</td><td>Opentrons</td><td>OT-2</td><td></td></tr><tr><td>OT-2 温控模块</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>Pierce 定量比色肽测定试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23275</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL 蛋白管</td><td>Eppendorf</td><td>#022431102</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质序列数据库</td><td>UniProt/SwissProt</td><td></td><td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%&lt;br/&gt; 20reviewed:yes</td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead 羧基修饰磁性颗粒，疏水型</td><td>Cytiva</td><td>#65152105050250</td><td></td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead 羧基修饰磁性颗粒，亲水型</td><td>Cytiva</td><td>#45152105050250</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>真空浓缩仪</td></tr><tr><td>Thermo Q Exactive HF 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td></td></tr><tr><td>质谱级胰蛋白酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>#90057</td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级水</td><td>VWR</td><td>#BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

由开源实验室机器人自动完成的霰弹枪蛋白质组学样品处理

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

基于质谱的鸟枪法蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括蛋白质的酶解和纯化，这些步骤可能耗费大量实验人员工时，并导致批间变异。使用移液机器人进行实验室自动化可减少人工操作，最大化通量，并提高研究的可重复性。然而，标准自动化工作站高昂的初始成本使得许多学术实验室难以负担。本文介绍了一种利用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）进行蛋白质组学样品制备的工作流程，包括设置半自动化蛋白质还原、烷基化、酶解和纯化步骤的操作说明，以及配套的开源 Python 脚本，用于通过其应用程序编程接口对 OT-2 系统进行编程。

提供了三个与 OT-2 机器人兼容的 Python 脚本，用于质谱蛋白质组学的样品制备，分别针对单一蛋白质标准品牛血清白蛋白（技术重复 n = 5 次消化）和含去垢剂的人心组织裂解液样品（n = 5 次消化）。每种消化产物被分为两个肽段纯化反应。BSA 样品和心脏样品每次运行中鉴定出的肽段-谱图匹配数（PSMs）、肽段数和蛋白质数分别如图4和图5所示。BSA 样品中，共鉴定出中位数为 728 个 PSMs 和 65 个肽段，变异系数（CV）分别为 5.2% 和 3.2%。在复杂的心脏样品中，10 次运行中共鉴定出中位数为 9,526 个 PSMs、7,558 个肽段和 1,336 个蛋白质，其变异系数分别为 7.6%、5.9% 和 3.6%。通过对心脏样品进行 10 次运行，共鉴定出 1,935 个蛋白质，其中 1,677 个蛋白质在两次或以上运行中被鉴定到。为评估肽段定量的变异性，计算了映射至唯一蛋白质的 10 个肽段的提取离子色谱（XIC）强度的 CV（表2）。进一步通过三种蛋白质...

提供详细的实验方案和三个Python脚本，用于操作开源的机器人液体处理系统，以进行质谱实验的半自动化蛋白质样品制备，涵盖去污剂去除、蛋白质消化和肽段脱盐步骤。

基于质谱的鸟枪法蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括酶解蛋白质消化和纯化……

本方案采用自动化技术在质谱实验前进行蛋白质生化制备，从而提高蛋白质组学研究的通量并降低变异度。本方案使用一种低成本、可编程的液体处理系统，价格适中，可供更多实验室采用。我们提供了可修改的开源 Python 脚本，以便进一步开发。本实验操作将由本实验室的硕士研究生 Milton Amaya 进行演示。首先，在文本编辑器中打开 noSP3_Digestion.py 脚本，并根据实验的具体要求，在“仅在此处自定义”（CUSTOMIZE HERE ONLY）部分设置相应的实验变量。然后，打开 Opentrons 应用程序，将脚本上传至 Opentrons 应用程序中的“协议”（Protocol）选项卡。接下来，按照 Python 脚本中指定的位置，将所需的实验耗材和移液器放置到 OT2 平台的相应位置。随后，将碳酸氢铵溶液置于四合一管架的 A1 孔中，该管架顶部为 15 毫升加 50 毫升试管架盖；将蛋白质样品置于另一个四合一管架的 A1 孔中，该管架顶部为 2 毫升试管架盖。将2毫升的低吸附蛋白管手动放入置于温控模块上方铝块孔中，从A1孔开始，垂直向下依次放置。然后，将DTT溶液放入四联管架的A6孔中，管架顶部配有2毫升管架盖。观察机器人将适量的碳酸氢铵缓冲液转移至铝块中的样品管内。然后，手动确认机器人程序已暂停，并显示以下消息：“在继续执行方案之前，请确保已将DTT加入位于4号槽位的2毫升离心管架的A6位置。” 在确认DTT管的位置并打开管盖后，点击Opentrons应用程序中的“继续”按钮以继续操作。确保机器人将10 µL的DTT溶液转移至每个样本孔中，随后进行五次混合操作。接下来，确认机器人程序已暂停，并显示消息：“确保关闭样本管的管盖”。然后，手动关闭各管的管盖，点击“继续”以恢复运行。等待机器人温控模块开始加热铝块，直至温度达到 55 摄氏度，随后孵育 5 分钟，使样本温度升至 55 摄氏度。机器人将在此温度下保持30分钟，以使DTT充分还原蛋白质。在孵育期间，准备碘乙酰胺溶液，并用手动方式用铝箔包裹，避免暴露于光线下。孵育结束后，当机器人程序暂停并显示警告信息时，请务必打开样品管的管盖，脱去样品管的盖子，然后点击“继续”以恢复程序运行。接下来，手动确认机器人程序是否已暂停，并显示警告信息：“在继续执行方案前，请确保已将碘乙酰胺加入位于4号槽位的2毫升离心管架的B6位置”。确认碘乙酰胺管所在管架位置并打开管盖后，点击“继续（Resume）”，并确保机器人将10 µL碘乙酰胺溶液转移至每个样品管中，随后进行五轮混匀。当机器人程序暂停并显示信息“关闭样品管管盖”时，请盖上样品管管盖，并用铝箔覆盖管盖，然后用一张干净的铝箔覆盖整个铝块，再点击“继续（Resume）”以继续运行程序。等待样本在22摄氏度下孵育30分钟，并确保机器人温控模块在碘乙酰胺孵育完成后自动关闭。当机器人程序暂停并显示警告信息“确保胰蛋白酶已加入位于4号位点的2毫升离心管架的C6位置，然后继续实验流程”时，将胰蛋白酶溶液加入2毫升离心管架的C6孔中，管盖保持打开状态，然后点击“继续”以恢复程序。随后，当机器人程序再次暂停并显示警告信息“打开温控模块上样本管的管盖”时，打开样本管的管盖，然后点击“继续”以恢复程序。等待机器人将10 µL胰蛋白酶转移至每个样品管中，随后进行五轮混匀。胰蛋白酶消化过夜后，使用台式微量离心机短暂离心样品，并将样品置于磁力管架上。两分钟后，用移液器小心转移上清液至一组新的蛋白质低吸附微量离心管中，并将样品保存在冰箱中。接下来，在文本编辑器中打开 SP3_peptide_cleanup.py Python 脚本，并根据需要在“仅在此处自定义”部分指定实验变量。然后，将该脚本上传到 Opentrons 应用程序的“协议”选项卡中。将所需的实验耗材和移液器放置在 Python 脚本中指定的 OT2 仪器平台相应位置，并确保磁力模块已通电并连接至机器人。将一个新的 2 毫升 96 孔深孔板放置在磁力模块上方。接下来，从 A1 孔开始，沿垂直方向依次将消化后的样品放入 2 毫升管架中。然后，确保机器人将55微升消化后的样品转移至磁力模块上深孔板的各孔中。确认机器人程序已暂停，并显示以下提示信息：在继续执行程序之前，请确保已将准备好的磁珠加入位于4号位置的2毫升离心管架A6孔中。随后，在微型台式离心机中涡旋振荡SP3磁珠并短暂离心，然后将其放入2毫升离心管架的A6孔中，管盖保持打开状态。确认机器人程序已暂停，并显示以下消息：在继续执行方案之前，请确保已在位于5号槽位的15毫升加50毫升离心管架的A4位置中加入80%乙醇。随后，将80%乙醇溶液加入管架的A4孔中，然后点击“继续”以继续操作。观察机器人将移液速度调整为慢速，从每个孔中吸取上清液，并将其排入废液管的过程。等待机器人将移液速度恢复至默认值并释放磁力模块。当机器人程序暂停并显示消息“打开碳酸氢铵管盖”时，打开碳酸氢铵溶液管盖，然后单击“继续”以恢复程序。在此期间请保持待命，机器人将释放磁力模块，向每个孔中转移250 µL碳酸氢铵缓冲液，并立即混合10次。然后观察机器人将移液速度调至缓慢，并将每孔中的上清液转移至废液管中。等待机器人向每孔加入 100 µL 碳酸氢铵缓冲液，并立即混合 10 次。确认机器人程序已暂停，并显示以下信息：在继续执行实验方案前，请确保已在 2 mL 铝块中放置新的收集管。然后，在铝块中最初放置的最后一个样本管之后，立即放入一组新的低蛋白吸附微量离心管，点击“继续”以恢复运行。等待机器人将每个样本从碳酸氢铵缓冲液转移至新的2毫升离心管中。当机器人程序暂停并显示提示信息“在继续实验流程前，请确保胰蛋白酶已加入位于4号槽位的2毫升离心管架C6位置”时，将胰蛋白酶溶液加入2毫升离心管架的C6孔中（管盖保持打开状态），然后点击“继续”以恢复程序。程序运行结束后，用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移至温控混匀仪中，在 37 °C 条件下以 1,000 RPM 震荡孵育 16 至 20 小时。对于 BSA 样品，共鉴定出中位数为 728 个肽段谱图匹配和 65 个肽段，其变异系数分别为 5.2% 和 3.2%。对于复杂的心脏组织样品，在 10 次重复实验中鉴定出中位数为 9,526 个肽段谱图匹配、7,558 个肽段和 1,336 个蛋白质，其变异系数分别为 7.6%、5.9% 和 3.6%。为了确定肽段定量的变异性，计算了对应于唯一蛋白质的10个肽段的提取离子色谱强度的变异系数。进一步将人工与机器人实验在测定蛋白质浓度时的结果变异性与BCA法进行比较，结果显示，机器人BCA法的平均变异系数低于人工手动BCA法。该方案减少了每个样本处理所需的实验台操作时间。这为我们探索多种药物处理下一系列细胞系之间的蛋白质组学差异铺平了道路。

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数字微流控技术是一种通过施加电场，在电极阵列上操控离散液滴（约纳升至毫升级）的方法。该技术非常适合进行快速、连续、微型化的自动化生化分析。本文报道了一种能够自动化完成多个蛋白质组学处理步骤的平台。...

用于自动化蛋白质组学处理的数字微流控技术

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关键词：DNA 提取，RNA 提取，临床样本，高通量，自动化，TruTip 技术，液体处理机器人

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利用荧光显微镜通过竞争性滴定法高灵敏度测定转录因子-DNA结合亲和力

本文介绍了一种用于基于质谱的定量蛋白质组学分析的自动化血浆蛋白质消化方法。在本方案中，蛋白质变性、还原、烷基化及胰蛋白酶消化反应中的液体转移和孵育步骤得到了简化并实现自动化。制备一块具有理想精密度的96孔板大约需要五小时。...

使用自动化工作站进行质谱分析的血浆样本制备

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

基于核磁共振的片段筛选是一种快速鉴定小分子与生物大分子（DNA、RNA 或蛋白质）结合的有效方法。本视频介绍了基于自动化样品制备和核磁共振实验的实验方案 &amp;#38; 采集条件和分析流程进行了介绍。该技术可实现对两者的最佳利用 1H 和 19用于检测的 F...

以最少样品和最大程度自动化模式进行基于核磁共振的片段筛选

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

学习使用低成本开源实验室机器人自动化进行Shotgun蛋白质组学样品处理，包括去污剂去除、蛋白质酶解和肽段脱盐步骤。该方法可提高通量、降低变异性，使更多实验室能够开展高效蛋白质组学研究。

由开源实验室机器人自动完成的霰弹枪蛋白质组学样品处理

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