从水生栖息地分离、繁殖和鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌种类
December 7th, 2021
我们介绍了从水生栖息地分离，繁殖和表征碳氢化合物降解细菌的过程。该协议概述了细菌分离，通过16S rRNA方法鉴定以及测试其碳氢化合物降解潜力。本文将帮助研究人员表征环境样本中的微生物生物多样性，特别是筛选具有生物修复潜力的微生物。
该协议概述了从生态栖息地中分离，培养和鉴定碳氢化合物降解微生物。这种方法不需要复杂的仪器，并且可以在标准实验室设置中轻松执行。它也可以很容易地适应研究其他基质。
这种技术可以很容易地转化为各种生态位，并且可以评估不同基质的降解。演示该程序的将是Deepa Sethi，来自Richa Priyadarshini博士实验室的博士生。首先，将500毫升水样收集在来自不同水体部位的五个无菌玻璃瓶中，并测量每个样品的pH值和温度。
然后在无菌条件下通过0.22微米孔径的滤片以100毫升的批次过滤样品。并将纸张放在不同的营养培养基板上，每个盘子放置一张纸。两个小时后，用无菌镊子将纸剥开。
接下来，通过将 100 微升收集的水样加入 900 微升无菌双蒸馏水中来稀释未过滤的水样。继续十倍稀释，直到达到 1 比 1， 000， 000 的稀释比例。通过移液混合，并确保每次稀释的最终体积为一毫升。
将100微升稀释的水样品分别铺在所有生长培养基板上，一式三份。将平板在 30 摄氏度下孵育 24 至 48 小时，具体取决于菌落的生长。要获得分离的菌落，请使用无菌牙签或移液器吸头选择一个菌落。
进行象限条纹，并将平板孵育过夜。第二天，根据菌落的形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘和海拔）筛选菌落。重新划线菌落以获得纯培养物。
对每种纯培养物进行革兰氏染色后，通过在三毫升适当的生长培养基中接种单个菌落并在30摄氏度下孵育来制备甘油原液。第二天，在冷冻瓶中加入700微升过夜培养物和300微升100%甘油。将小瓶冷冻在零下80摄氏度下长期储存。
从新鲜的盘子中，挑选一个菌落并将其接种在五毫升三联体大豆汤或营养肉汤中。在30摄氏度下培养培养过夜，以200RPM振荡，直到吸光度达到约2。第二天，沉淀细胞。
弃去上清液，用两毫升高压灭菌的盐水洗涤沉淀两次。再次旋转细胞，然后将沉淀重新悬浮在两毫升液态无碳基础培养基或LCFBM中，并测量吸光度。接下来，将两个无菌150毫升锥形瓶标记为A和B，分别用于对照组和实验组。
在烧瓶A中，加入40毫升LCFBM，然后加入终浓度为5毫摩尔的苯乙烯。在烧瓶B中，加入35毫升LCFBM和苯乙烯。然后加入最终吸光度约为0.1的细胞悬液。
用LCFBM将烧瓶B中的体积提高到40毫升后，将两个烧瓶在30摄氏度下以200RPM振荡孵育30天。每五天测量一次每个烧瓶的吸光度，并绘制生长曲线。如果细菌可以利用苯乙烯，则将孵育时间增加多达 45 天。
吸光度的增加表明细菌可以代谢苯乙烯。要从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA，请选择单个菌落并将其接种在无菌试管中的新鲜生长培养基中。在振荡培养箱中孵育过夜后，沉淀1.5毫升生长的培养物。
除去上清液并将沉淀重悬于200微升裂解缓冲液中。然后加入66微升五摩尔氯化钠溶液，搅拌均匀。离心所得混合物后，将透明仰卧移液到新鲜的微量离心管中，并加入等体积的氯仿。
通过多次倒置来混合溶液，直到观察到乳白色溶液。再次旋转试管，并将上清液转移到干净的小瓶中。接下来，加入一毫升冰冷的100%乙醇，倒置混合，直到白色DNA链沉淀出来。
离心沉淀的DNA。弃去上清液。并用一毫升70%乙醇洗涤颗粒。
丢弃洗涤液后，让DNA沉淀在室温下干燥五分钟。干燥后，将沉淀重新悬浮在100微升Tris-EDTA缓冲液中。使用分光光度计测量DNA浓度，并在1%琼脂糖凝胶上运行DNA以评估其质量。
为了鉴定菌株，通过PCR扩增从纯细菌培养物中分离的DNA，使用针对细菌的16S核糖体RNA序列的通用引物。在冰上制备25微升PCR混合物，加入1微升DNA模板，并设置基因扩增的循环条件。PCR后，将五微升样品与一微升五倍DNA上样染料混合。
并在1%琼脂糖凝胶上运行以验证扩增。对于16S核糖体，rNA基因测序，建立与前面描述相同的反应，但体积更大。然后，为了纯化用于Sanger测序的扩增子，将整个样品与DNA上样染料混合，并将其上样到琼脂糖凝胶上以执行凝胶提取方法。
测序完成后，将结果文件转换为更快的格式，并使用NCBI上的BLAST工具检查序列相似性。图中显示了从印度达德里湿地的水样中分离出的细菌菌落。分离的细菌在各自的培养基中单独生长，液体苯乙烯作为碳的唯一来源。
使用儿茶酚降解测定法评估细菌分离株的碳氢化合物降解潜力。此处显示了其中一种分离株的代表性测定。通过在琼脂糖凝胶上可视化小DNA样品来确认基因组DNA的完整性。
16S核糖体rNA基因使用通用引物扩增。构建了一棵系统发育树，以描述从湿地分离的exiguobacterium菌株与已知exiguobacterium物种的相关性。该方案的一个关键步骤是检查被测基板的利用率。
根据生长特性，微生物可能无法立即适应利用被测试的底物，并且可能需要富集过程。该方法侧重于环境样品中可培养的细菌种群。研究人员可以进一步进行实验，例如细菌全基因组测序和代谢分析，这可以为参与碳氢化合物降解的基因和途径提供有价值的见解。
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概述
本文介绍了一种从水生栖息地中分离、繁殖和鉴定烃降解菌的协议。该方法简单直接，可以在标准实验室设置中进行，使对微生物生物多样性和生物修复感兴趣的研究人员能够轻松使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 环境科学
- 生物修复
背景
- 烃降解菌在环境清理中扮演着至关重要的角色。
- 了解微生物多样性对于有效的生物修复策略至关重要。
- 标准实验室技术可以促进这些微生物的研究。
- 该协议可以适应各种生态位和基质。
研究目的
- 从水生环境中分离并鉴定烃降解菌。
- 评估这些细菌在生物修复应用中的潜力。
- 提供一个可以在不同实验室环境中轻松实施的协议。
使用的方法
- 从各种水生栖息地收集水样。
- 测量每个样本的pH值和温度。
- 使用标准微生物学技术分离和培养细菌。
- 通过16S rRNA方法鉴定细菌。
主要结果
- 成功从收集的样本中分离出烃降解菌。
- 鉴定具有潜在生物修复能力的细菌物种。
- 展示了该协议对不同基质的适应性。
- 建立了一种可以在各种生态研究中使用的方法。
结论
- 该协议提供了一种研究烃降解菌的可靠方法。
- 研究结果有助于理解微生物在环境修复中的作用。
- 研究可以扩展到包括其他基质和生态背景。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient identification and propagation of hydrocarbon-metabolizing bacteria from aquatic habitats addresses a critical need for scalable bioremediation solutions in biopharma and environmental biotechnology. This protocol enables early-stage discovery of microbial candidates with unique metabolic pathways, supporting predictive confidence in biocatalyst selection and portfolio triage for industrial biodegradation initiatives. The approach facilitates rapid screening and functional validation of environmental isolates, directly impacting translational pipeline continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of microbial metabolic diversity for hydrocarbon degradation.
- Supports functional validation of candidate strains through substrate utilization assays.
- Facilitates biological de-risking by confirming metabolic activity in defined conditions.
- Provides a foundation for predictive confidence in downstream bioprocess development.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible workflows for isolating and propagating environmental bacteria.
- Standardizes quantitative assessment of hydrocarbon metabolism using absorbance-based growth curves.
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening of biodegradation potential.
- Enables reliable comparison of strain performance across substrates and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial isolate selection with translational bioremediation objectives.
- Supports continuity from environmental sampling to preclinical evaluation of metabolic pathways.
- Provides mechanistic insights for risk-adjusted advancement of microbial candidates.
- Facilitates integration of genomic and metabolic profiling for biomarker discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions microbial isolation and functional screening at the interface of early discovery and lead identification for bioremediation pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial hydrocarbon metabolism and pathway elucidation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible assays for quantitative evaluation of substrate utilization.
- Analytics: Provides absorbance-based growth curves and genetic identification via 16S rRNA sequencing.
- Translational Research: Enables continuity from environmental isolate to preclinical metabolic profiling.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow for diverse ecological and substrate contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial candidate selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in microbial screening workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in bioremediation R&D portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial strains for industrial application.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, molecular biology, and environmental sampling.
- Utilizes standard laboratory instrumentation and basic analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and assay reproducibility.
- Adaptable to various aquatic and substrate-specific model systems.
- Focuses on cultivable populations, with enrichment steps needed for some substrates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Sample Collection, Processing, and Analysis
3:12
Degradation of Hydrocarbons
5:04
Genomic DNA Isolation of the Pure Culture
6:49
16S rRNA Sequencing
8:07
Results: Isolation and Characterization of Hydrocarbon Degrading Bacteria from Aquatic Habitats
9:11
Conclusion
