从水生环境分离、扩增与鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌物种

本方案概述了从生态环境中分离、培养和鉴定降解烃类的微生物的方法。该方法无需复杂的仪器，可在标准的实验室条件下轻松完成。此外，该方法也可轻松调整用于研究其他底物。

该技术可轻松应用于多种生态位，并可用于评估不同底物的降解情况。本次实验操作将由Richa Priyadarshini博士实验室的博士生Deepa Sethi进行演示。首先，从不同水体地点采集五份无菌玻璃瓶中的500毫升水样，并测量每份样品的pH值和温度。

然后在无菌条件下，将样品以每份100毫升分批通过孔径为0.22微米的滤膜进行过滤。将滤膜分别置于不同的营养培养基平板上，每个平板放置一张滤膜。两小时后，用无菌镊子将滤膜揭下。

接下来，将100微升采集的水样加入900微升无菌双蒸水中，对未过滤的水样进行稀释。继续进行10倍梯度稀释，直至达到1比1,000,000的稀释比例。使用移液器吹打混匀，并确保每次稀释后的终体积为1毫升。

将稀释后的水样分别取100微升，每种样品设三个重复，接种至所有培养基平板上。根据菌落生长情况，在30摄氏度下培养24至48小时。为获得单菌落，使用无菌牙签或移液器吸头挑取单个菌落。

进行四区划线接种，并将平板过夜培养。次日，根据菌落的形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘和隆起程度）进行筛选。再次划线接种菌落以获得纯培养物。

对每种纯培养物进行革兰氏染色后，挑取单菌落接种于3毫升合适的生长培养基中，于30°C培养，制备甘油菌种。次日，在冻存管中加入700微升过夜培养物和300微升100%甘油。将冻存管置于-80°C冰箱中冷冻保存，用于长期保藏。

从新鲜划线的平板上挑取一个菌落，接种到5 mL的胰蛋白胨大豆肉汤或营养肉汤中。在30°C、200 RPM振荡条件下培养过夜，直至吸光度达到约2。次日，离心收集菌体。

弃去上清液，用两毫升灭菌生理盐水将沉淀洗涤两次。再次离心细胞，然后将沉淀重悬于两毫升液体无碳基础培养基（LCFBM）中，并测定吸光度。接下来，标记两个无菌的150毫升锥形瓶，分别为A和B，对应对照组和实验组。

在A瓶中加入40毫升LCFBM，然后加入苯乙烯，使其终浓度为5毫摩尔。在B瓶中加入35毫升LCFBM和苯乙烯，随后加入细胞悬液，使其终吸光度约为0.1。

用LCFBM将B瓶中的体积补至40毫升后，将两个烧瓶在30摄氏度下以200 RPM振荡培养30天。每隔五天测定每个烧瓶的吸光度，并绘制生长曲线。如果细菌能够利用苯乙烯，可将培养时间延长至最多45天。

吸光度的增加表明该细菌能够代谢苯乙烯。为了从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA，挑取单个菌落并将其接种于无菌试管中的新鲜培养基中。在摇床培养箱中过夜培养后，离心收集1.5毫升培养物。

弃去上清液，将沉淀重悬于200微升裂解缓冲液中。然后加入66微升5摩尔的氯化钠溶液，充分混匀。将所得混合物离心后，用移液器将澄清的上清液转移至新的微量离心管中，并加入等体积的氯仿。

反复倒置溶液多次，直至观察到乳白色溶液。再次离心试管，将上清液转移至干净的小管中。接着加入一毫升预冷的100%乙醇，倒置混匀，直至析出白色丝状DNA沉淀。

离心沉淀DNA，弃去上清液，然后用1毫升70%乙醇洗涤沉淀。

弃去洗涤液后，将DNA沉淀在室温下干燥5分钟。干燥后，用100 µL Tris-EDTA缓冲液重新悬浮沉淀。使用分光光度计测定DNA浓度，并将DNA上样至1%琼脂糖凝胶电泳以评估其质量。

为了鉴定菌株，使用针对细菌16S核糖体RNA序列的通用引物，通过PCR扩增从纯细菌培养物中分离的DNA。在冰上配制25微升PCR反应体系，加入1微升DNA模板，并设置基因扩增的循环条件。PCR反应结束后，将5微升样品与1微升5倍浓度的DNA上样染料混合。

在1%琼脂糖凝胶上电泳以验证扩增结果。对于16S核糖体rRNA基因测序，设置与前述相同的反应体系，但体积更大。随后，为纯化用于Sanger测序的扩增子，将整个样品与DNA上样染料混合，加样至琼脂糖凝胶中，进行胶回收操作。

测序完成后，将结果文件转换为更快的格式，并使用 NCBI 上的 BLAST 工具检查序列相似性。此处展示的是从印度达德里湿地水样中分离得到的细菌菌落。分离出的细菌分别在各自培养基中培养，以液体苯乙烯作为唯一碳源。

通过邻苯二酚降解实验评估了细菌分离株的烃类降解潜力。此处展示的是其中一个分离株的代表性实验结果。通过在琼脂糖凝胶上电泳观察少量DNA样品，确认基因组DNA的完整性。

使用通用引物扩增16S核糖体rRNA基因。构建系统发育树，以展示从湿地分离的短杆菌属菌株与已知短杆菌属物种之间的亲缘关系。该实验方案的关键步骤是检测被测底物的利用情况。

根据微生物的生长特性，其可能不会立即适应利用待测底物，可能需要进行富集培养。该方法侧重于环境样品中可培养的细菌群落。研究人员可进一步开展实验，例如细菌全基因组测序和代谢谱分析，以深入了解参与烃类降解的基因及相关代谢通路。