小鼠大脑中人类神经祖细胞的脑内移植和 体内 生物发光跟踪

基于细胞的疗法在大脑再生方面具有巨大的潜力。我们在这里展示的方案是有价值的，因为它允许对小鼠大脑中的移植细胞进行纵向体内成像。该协议对于了解移植物在一段时间内的迁移和存活情况特别有用。

该程序可以应用于移植到小鼠大脑的任何荧光素酶表达细胞系。然而，信号强度可以根据移植的深度或相应细胞系中的荧光素酶表达而变化。演示该程序的将是Rebecca Weber，我们实验室的优秀博士生。

首先从零下150摄氏度的储存中收集一小瓶细胞并将其转移到实验室。将小瓶快速转移到37摄氏度的水浴中，温和两到三分钟，直到冰晶溶解。然后，将小瓶转移到生物安全柜中，并将全部内容物移液到无菌的15毫升锥形管中。

加入九毫升无菌PBS，在室温下以300G离心五分钟。在不干扰沉淀的情况下通过抽吸除去上清液，并在最终旋转之前使用自动细胞计数器计数细胞。将动物从诱导室运输到立体定位框架，使用面罩保持麻醉。

涂抹眼科润滑剂，以防止眼睛干燥。用电动剃须刀剃掉小鼠头皮，并用棉签用5%betadine溶液消毒皮肤。固定鼠标头并将耳杆插入外耳道。

用外科牙钻在颅骨上钻一个直径为两到三毫米的孔。将制备的细胞重悬于管中，并将两微升细胞悬浮液吸入注射器中。将注射器放在目标部位上方，将针头慢慢移动到硬脑膜表面并计算深度坐标。

双击动态图像软件图标，然后从下拉列表中选择一个用户 ID。然后，在出现的"控制面板"中单击"初始化"。在"动态图像"软件中，选中"控制面板"中的"发光"和"照片"框，然后选择"自动曝光"。

选择视野。输入拍摄对象高度，然后选择使用拍摄对象高度焦点选项。手动设置滤波参数，包括大分档、F/Stop、阻塞激励滤波器和开路发射滤波器。

腹腔注射荧光素，五分钟后，用连续的异氟醚供应麻醉动物。使用传统的剃须刀在头部区域剃除镇静动物。将动物置于成像室中，并在注射荧光素15分钟后通过单击控制面板中的"获取"开始成像。

在将神经祖细胞移植到小鼠脑中之前，通过体外表达EGFP测试细胞成功转导。红萤火虫荧光素酶信号的存在证实了移植的成功。在小鼠的右感觉运动皮层移植6， 000至180， 000个细胞后，在所有浓度下均可检测到生物发光信号。

细胞在移植后存活至少五周。移植的细胞在随后的组织学分析中通过EGFP报告基因和抗人细胞核免疫染色成功检测到。仔细计算注射坐标以避免错过目标部位非常重要。

此外，移植后将注射器放在原位至少五分钟，以避免任何反流。在体内生物发光成像后，可以制备脑组织进行组织学分析，也可以使用FACS分离移植的细胞并使用不同或混合技术进行表征。总体而言，该技术提供了对大脑中移植细胞的定量和连续跟踪，并且可以应用于大量的神经系统疾病，包括中风和创伤性脑损伤。