具有透化检测功能的连续流动微电穿孔系统的制造和操作

该方法使研究人员能够确定所需细胞类型的最佳电穿孔脉冲条件，同时最大限度地减少对传统经验实验方法的需求。该方法利用微电穿孔技术制造可扩展的微流体驱动装置，该装置能够在整个电穿孔过程中电监测细胞膜透化的程度。演示该程序的将是我实验室的硕士生Kishankumar Busha。

首先，使用旋涂机的真空系统将硅晶片固定到晶圆旋涂布机的卡盘上。然后对微调器进行编程。接下来，将四毫升SU-8 2010光刻胶分配到硅晶圆的中心并运行程序。

系统停止后，关闭真空吸尘器。然后将具有2D微流体通道设计的光掩模固定在掩模支架上，并将带有SU-8涂层朝上的硅晶片插入晶圆卡盘上。将曝光设置设置为每平方厘米 150 毫焦耳并运行机器。

紫外线照射后，将硅晶片浸入SU-8显影溶液中，轻轻搅拌三到四分钟。然后从溶液中取出晶片并用异丙醇冲洗表面。接下来，将硅晶片放入 150 摄氏度的烤箱中 30 分钟进行硬烤。

然后让它冷却到室温，然后使用测针轮廓测量法测量通道侧壁的确切高度和坡度。接下来，将一毫升光刻胶分配到载玻片的表面上，然后再次运行该程序。系统停止后，关闭真空并取出载玻片。

将带有2D电极设计的光掩模固定到掩模支架上后，将带有S-1818涂层的玻璃晶圆朝上插入晶圆卡盘并对齐。将曝光设置设置为每平方厘米215毫焦耳并运行机器。曝光后，将载玻片浸入MF-319显影液中两分钟，轻轻搅拌。

然后取出玻璃晶圆并用去离子水冲洗其表面。最后，将载玻片放入 150 摄氏度的烤箱中进行硬烤，确保感兴趣的基材表面朝上。30 分钟后，将载玻片从烤箱中取出并避光。

要蚀刻载玻片，请将其浸入聚四氟乙烯容器中的10:1缓冲氢氟酸溶液中一分钟。然后将载玻片在去离子水中转移并清洗三次。接下来，使用物理气相沉积系统以每分钟 100 埃的速度溅射钛 8 分钟，以每分钟 200 埃的速度溅射铂 10 分钟。

然后要取下光刻胶，将金属涂层载玻片浸入丙酮浴中10分钟，并对浴进行超声处理以引入搅拌。如有必要，请使用丙酮浸湿的湿巾去除任何残留物。接下来用于聚二甲基硅氧烷的复制成型使PDMS弹性体基料与固化剂以10:1的重量比放置在放置在电子天平顶部的一次性容器中。

然后，将PDMS溶液倒在硅晶片上，并将混合物置于真空下以去除气泡。在 65 摄氏度下固化混合物至少四个小时后，使用剃须刀片的尖端切出模制的 PDMS 并将其从硅晶片上剥离。然后使用锋利的活检打孔器，从设备的入口和出口中取出PDMS。

接下来，对等离子发生器进行编程，用于PDMS键合。然后将PDMS和电极玻璃载玻片放入系统中，特征朝上并运行程序。程序完成后，取出设备并使用立体镜快速将通道特征与电极对齐。

从PDMS的中心向侧面牢固施加压力，以去除粘合界面处任何不需要的气泡。收获HEK293细胞，离心，并以每毫升约500万个细胞的速度将沉淀重悬于电穿孔缓冲液中。接下来，加入编码GFP的血浆DNA至终浓度为每毫升20微克并轻轻混合。

然后将血浆-DNA细胞悬液转移到一立方厘米的注射器中进行实验。通过载玻片支架将微型设备放在显微镜载物台上。然后打开充电耦合器件CCD相机，并聚焦微流体通道。

接下来对于单细胞电穿孔，将注射泵的流速设置为每分钟0.1至0.3微升，以确保单细胞流过电极组。然后设置初始和最低电能电穿孔脉冲的脉冲参数。遵循每个脉冲应用的预定数量的细胞检测。

在每个测试条件结束时，从微设备出口吸出细胞并用恢复培养基补充出口。迭代到下一个电穿孔脉冲条件并重复，直到测试完所有电穿孔脉冲条件。然后，确定基于群体的高通量反馈的电穿孔脉冲参数。

对于基于群体的反馈控制电穿孔，将注射泵流速设置为每分钟一到三微升，并将脉冲幅度设置为优化条件。然后关闭触发模式并设置脉冲宽度以匹配细胞传输时间。电穿孔所需数量的细胞后，关闭注射泵和函数发生器。

然后将细胞从出口储液槽转移到装有预热回收培养基的适当大小的细胞培养瓶或平板中，并将培养瓶或板转移到培养箱中。对于数据分析，将数据加载到分析软件中，并为每个脉冲条件生成电流与时间的关系图。然后确定细胞膜透化程度，生成所有测试脉冲条件下的细胞膜透化图，并验证最佳脉冲条件。

孵育后，使用FITC和远红滤光片捕获落射荧光图像，并手动或通过算法分析图像集。本文重点介绍了单脉冲幅度的单电池水平透化检测的工作原理。在每个电穿孔脉冲参数之后，测试下一个最高能量的电穿孔脉冲。

HEK293细胞的细胞膜透化图显示外加电能与细胞膜透化程度之间存在明显的相关性。在该实验中，确定每厘米1.8千伏的电场强度和670微秒脉冲为最佳。在这些值下，电转染效率达到70%。

与每厘米0.4千伏的电场强度和3毫秒的脉冲持续时间相比，24小时的电转染效率低于5%术语配方，通常用于描述微制造过程的具体细节插入遵循或优化每个步骤以成功制造功能设备的重要性。这种电穿孔技术可用于其他生物医学研究项目，例如CAR-T细胞的生成和测试或CRISPR-Cas9基因编辑技术的优化和测试。这种微电穿孔技术允许对不同细胞类型的反应进行电询问，以应用电脉冲条件并将该信息与临床相关分子货物的递送相关联。