Name: 具有透化检测功能的连续流动微电穿孔系统的制造和操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习微流控电穿孔技术，利用硅晶圆和SU-8光刻胶制造可扩展的微流控装置，实现单细胞转染和实时膜透化监测。该方法可优化脉冲条件，提高转染效率，适用于HEK293等多种细胞类型的高通量研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 0967598，DBI IDBR 1353918）以及美国教育部精准与个性化医学新兴领域研究生培训项目（P200A150131）为研究生 J.J.S. 提供的资助&#160;。

<ol><li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li>
<li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li>
<li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li>
<li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer%3A+A+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li>
<li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li>
<li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).</li>
<li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li>
<li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%3A+current+trends%2C+applications+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li>
<li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li>
<li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li>
<li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).</li>
<li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li>
<li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li>
<li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li>
<li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li>
<li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMEMS+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li>
<li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li>
<li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li>
<li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li>
<li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li>
<li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li>
<li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%222020+33rd+Ieee+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28Mems+2020%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li>
<li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li>
<li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li>
<li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+electrically-triggered%2C+single+cell-level+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li>
<li>MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021).</li>
<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001).</li>
<li>Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisinenkova%2C+M+%224M+2006+-+Second+International+Conference+on+Multi-Material+Micro+Manufacture%22">4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture</a>. , Elsevier. 91-94 (2006).</li>
<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
<li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中介绍的方法主要聚焦于微流控装置的微加工，随后将其集成到专用的电穿孔实验装置中。在描述微加工过程的具体细节时，常使用“工艺参数”（recipe）这一术语，这暗示了遵循并优化每个步骤对于成功制备功能器件的重要性。然而，若某些关键步骤未经过优化，例如紫外光曝光时间/能量、物理气相沉积（PVD）溅射速率/持续时间以及氧气等离子体发生器的设置，可能会对器件的制备过程以及后续电穿孔实验的成功实施造成问题。微加工过程的故障排查主要通过试错法或更受控的实验设计（Design of Experiments）来完成。此外，还存在其他可替代的微加工技术，例如深反应离子刻蚀（DRIE），可用于替代本方案中的不同步骤（例如，使用DRIE刻蚀的模具结构来执行软光刻工艺）。此外，对于该领域的新手而言，优化工艺参数以及设计和制备器件可能耗时较长。然而，一旦微加工流程被成功建立，工程师或科研人员便可自由设计出满足其特定需求的器件。
为此，本方案中描述的装置是在我们先前研究32的基础上进一步拓展而开发的。该装置延续了单细胞膜通透性电学检测的方法，但实现了更高通量...

当前生物医学研究中的治疗创新，例如嵌合抗原受体工程T细胞（CAR-T）疗法以及利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9进行基因编辑，高度依赖于将外源物质成功且高效地递送至细胞内空间的能力1。在CAR-T疗法中，细胞治疗生产过程中进行基因递送的金标准方法是使用病毒载体2。尽管病毒介导的基因递送是一种高效的递送方式，但也存在若干缺点，包括制造成本高、细胞毒性、免疫原性、潜在的致突变性或致瘤性，以及对所递送基因大小的限制3。这些局限性推动了替代性非病毒递送技术的研究与开发。
电穿孔是一种替代病毒介导基因递送的方法，依赖于施加最佳的电脉冲波形，以实现对细胞的DNA、RNA和蛋白质转染。在外加电场作用后，细胞膜会短暂受损，从而使细胞易于摄取原本无法穿透的外源性物质4。与病毒介导的递送方法相比，电穿孔具有操作安全、易于操作和运行成本低等优势。电穿孔可递送小分子和大分子物质，并且在不同谱系的细胞转染中均能实现高效转染5。为了在电穿孔后获得理想的结果，即良好的细胞存活率和高效的电转染效率，需要共同优化多种实验参数。这些参数包括细胞类型6、细胞密度、分子浓度7、电穿孔缓冲液的性质（如分子组成、导电性和渗透压）8、电极尺寸/几何形状9以及电脉冲波形（波形形状、极性、脉冲次数）10（参见图1示意图）。尽管上述每个参数都可能显著影响电穿孔实验的结果，但脉冲波形尤其受到深入研究，因为所施加脉冲的电能是决定细胞存活率与电转染效率之间内在权衡关系的根本因素8。
通常，电穿孔实验在宏观尺度上进行，即将细胞悬浮于数百微升缓冲液中，置于电穿孔比色皿内一对较大的平行板电极之间。电极通常由铝制成，电极间距为1–4 mm。细胞通过移液手动加入后，将比色皿连接至体积较大的电脉冲发生器，用户可在设备上设定并施加所需的脉冲波形参数，以对细胞悬液进行电穿孔。尽管宏观尺度或批量电穿孔能够处理较高密度的细胞 &gt;106 细胞/mL，当优化电脉冲波形参数时，这一特性可能造成细胞浪费。对于细胞数量有限的原代细胞类型进行电穿孔时，此问题尤为突出。此外，由于电极间距较大，脉冲发生器必须能够提供较高的电压，以达到所需的电场强度 &gt;1kV/cm11这些高电压会导致电解质缓冲液中产生电阻性功率耗散，从而引起焦耳热效应，可能对最终的细胞活力造成不利影响。12最后，在细胞密度较高的悬浮液中进行电穿孔时， invariably 会存在转染效率和细胞存活率固有的变异性。悬浮液中的每个细胞由于周围细胞的影响，可能经历不同的电场强度。根据所经历的电场强度是增强还是减弱，细胞存活率或电转染效率均可能受到负面影响。11这些宏观电穿孔技术的缺点促使人们追求并开发了可在微观尺度上运行、并在单细胞水平上实现更好控制的替代技术。
生物微机电系统（BioMEMS）领域源于微电子行业的技术进步，特别是利用微加工工艺开发用于推动生物医学研究的微型装置。这些进展包括用于体内电生理监测的微电极阵列13、用于原位电穿孔的电容式微电极14、微型化器官芯片装置15、微流控即时诊断设备16、生物传感器17以及药物递送系统18，其中包括纳米级和微米级电穿孔装置19,20,21。由于能够设计和制造与生物细胞尺寸相当的装置，纳米级和微米级电穿孔技术相较于宏观尺度的同类技术具有显著优势22,23。这些电穿孔装置通常集成了间距为数十至数百微米的电极组，从而避免了高电压脉冲的应用需求。这一特性显著降低了电解液中的电流，进而减少了有毒电解产物的积累以及焦耳热效应的影响。微米级通道还可确保在施加脉冲期间向细胞施加更加均匀且可靠的电场，从而获得更一致的实验结果24。此外，微电穿孔装置通常被集成到微流控平台中，有利于未来进一步整合为全自动技术，这在细胞治疗制造中是一项极为理想的能力25。最后，微米级电穿孔还支持对电穿孔事件进行电学检测。例如，可在单细胞水平上实时监测细胞膜通透化的程度26,27。本方法旨在描述一种微流控单细胞微电穿孔装置的微加工工艺、系统操作及分析方法，该装置能够测量细胞膜通透化程度以优化电穿孔方案，同时较以往最先进的技术显著提高了通量。
单细胞水平的电穿孔技术已不再是一种新颖的方法，早在2001年，Rubinsky等人便通过开发静态细胞电穿孔技术首次实现了该方法28。他们的微装置具有创新性，因为他们是首次展示能够通过电信号实时监测电穿孔事件的研究者。这一进展进一步推动了静态单细胞电穿孔技术的发展，使其能够以并行方式电学检测细胞膜通透化的程度，从而提高设备的处理通量。然而，即使采用并行化和批量处理方式，这些设备在单位时间内可处理的细胞总数方面仍存在严重不足29,30。这一局限性促使了流通式装置的发展，这类装置能够在高得多的通量下实现单细胞水平的微电穿孔31。然而，从静态环境向流通式环境的设备转变，限制了在施加电穿孔脉冲后对细胞膜通透化程度进行电学监测的能力。本研究所描述的方法弥合了这两类技术之间的差距，实现了一种可在连续流动、逐个细胞串联模式下，对单个细胞的膜通透化程度进行电学检测、施加脉冲并实时监测的微电穿孔技术。
该技术最近在 Zheng 等人的研究中被描述。在该研究中，通过完成一项参数化研究，介绍了该技术的能力，其中改变了电穿孔脉冲的幅度和持续时间，并探究了反映细胞膜通透化的后续电信号32。结果表明，电穿孔脉冲强度的增加（即施加的电场强度增加或脉冲持续时间延长）会导致测得的细胞膜通透化程度升高。为了进一步验证该系统，向细胞悬液中添加了一种常用的荧光指示剂——碘化丙啶33，并在施加电脉冲后立即采集了荧光图像。光学信号，即细胞内碘化丙啶的荧光强度，与细胞膜通透化程度的电学测量结果高度相关，证实了该电学测量的可靠性。然而，该研究仅考虑了小分子碘化丙啶的递送，其本身几乎没有或不具备可转化的意义。
本研究介绍了一种该技术的新型应用，旨在提高系统通量，同时递送具有生物活性的质粒DNA（pDNA）载体，并评估电穿孔后重新接种并培养的细胞的电转染效率。尽管此前的工作在能够电学测量电穿孔事件的现有微电穿孔技术中表现更优，但当前设备的状态仍需要较长的细胞通过电极组之间的时间（约250 ms），以完成细胞检测、脉冲施加以及细胞膜通透性测量。在单通道条件下，这将通量限制在每秒4个细胞。为克服这一限制，本文提出了一种基于细胞群体的反馈控制电穿孔新概念，用于实现pDNA的电转染。通过使用低生理电导率的电穿孔缓冲液，该系统可在多种电穿孔脉冲条件下对单个细胞进行电学表征。根据细胞的电学响应，确定“最优”电穿孔脉冲参数。随后启用一种“高通量”模式，在该模式下取消细胞膜通透性测定，提高流速，并将电穿孔脉冲的占空比与细胞通过时间相匹配，以确保每个在电极间流动的细胞仅接受一次脉冲。本研究将详细阐述微器件制造过程中的微加工步骤、实验所需材料/设备及其组装方法，以及器件的操作与分析流程，包括其电转染效率（eTE）的评估。
<img alt="电穿孔过程示意图，包含脉冲波形、缓冲液效应及细胞恢复步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：影响电穿孔结果的实验因素。（左侧）细胞悬液——在电穿孔开始前需考虑的重要因素包括：载荷物（本例中为质粒DNA，pDNA）、浓度、细胞密度以及电穿孔缓冲液的性质。需考虑的缓冲液性质包括电导率、渗透压以及影响这些参数的具体分子组成。（中部）脉冲施加——必须优化确切的脉冲类型（方波与指数衰减波）和脉冲波形（单脉冲与脉冲序列），以最大程度提高细胞存活率和电转染效率。电穿孔过程中常用的脉冲序列通常由一系列高压（HV）脉冲，或在高压（HV）与低压（LV）脉冲幅度之间交替的脉冲组成。（右侧）细胞恢复——下游处理步骤，特别是细胞转移后所处的恢复性细胞培养基，也应进行优化。图中未显示（最左侧）其他可实施的上游细胞处理步骤，可用于整体电穿孔过程的优化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>150 毫米直径培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>步骤 6.1.1 用于固定晶圆</td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>步骤 10.3.6 用于接种电穿孔后的细胞</td></tr><tr><td>33220A 波形/函数发生器</td><td>Agilent</td><td></td><td>步骤 9.2.3 电穿孔脉冲发生器</td></tr><tr><td>4 英寸硅晶圆</td><td>University Wafer</td><td></td><td>第 2.1 小节，用于微流控通道的制备</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>步骤 8.1.8 用于接种细胞</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>步骤 2.1.2 用于清洗，&amp;nbsp;以及步骤 5.1 光刻胶剥离</td></tr><tr><td>Allegra X-22R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>步骤 8.1.4、8.3.2 和 8.3.3 用于离心收集细胞</td></tr><tr><td>AutoCAD 2018</td><td>Autodesk</td><td></td><td>第 1.1.1 小节，用于设计透明掩模</td></tr><tr><td>缓冲氧化物刻蚀液 10:1</td><td>VWR</td><td>901621-1L</td><td>第 3.1 小节，用于氢氟酸刻蚀</td></tr><tr><td>CCD 单色显微镜相机</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca 285 C4742-96-12G04</td><td>步骤 11.2.3 用于成像</td></tr><tr><td>CMOS 相机 - Sensicam QE 1.4MP</td><td>PCO</td><td></td><td>第 9.3 小节，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>导电环氧树脂</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>第 7.6 小节，用于导线连接</td></tr><tr><td>锥形离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>步骤 8.1.4，用于细胞离心</td></tr><tr><td>Dektak 3ST 表面轮廓仪</td><td>Veeco (Sloan/Dektak)</td><td></td><td>步骤 2.1.15 和 5.4，用于表面轮廓测量</td></tr><tr><td>一次性活检打孔器，0.75 毫米</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>步骤 6.2.3，用于入口通路</td></tr><tr><td>一次性活检打孔器，3 毫米</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>步骤 6.2.3，用于出口通路</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>步骤 11.2.2，用于活细胞染色</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>步骤 8.1.2，培养基成分的一部分</td></tr><tr><td>E3631A 双极三路直流电源</td><td>Agilent</td><td></td><td>步骤 9.2.1–9.2.2，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U 倒置&amp;nbsp;显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>&amp;nbsp;第 9.3 小节，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>EVG620 紫外光刻系统</td><td>EVG</td><td></td><td>&amp;nbsp;步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于紫外曝光</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Neuromics</td><td>FBS001</td><td>步骤 8.1.2，培养基成分的一部分</td></tr><tr><td>FS20 超声波清洗机</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>第 5.1 小节，用于光刻胶剥离</td></tr><tr><td>带盖玻璃培养基瓶，100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800100</td><td>步骤 8.2.1，用于缓冲液储存</td></tr><tr><td>带盖玻璃培养基瓶，500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800500</td><td>步骤 8.1.2，用于培养基储存</td></tr><tr><td>HEK-293 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>第 8.1 小节，用于细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>步骤 2.2.3，作为附着促进剂</td></tr><tr><td>HF2LI 锁相放大器</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>第 9.2 小节，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>HF2TA 电流放大器</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>第 9.2 小节，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A459-1</td><td>步骤 2.1.2 用于清洗，步骤 2.1.14 用于 SU-8 显影后晶圆的冲洗，以及步骤 6.3.1 用于清洗 PDMS</td></tr><tr><td>IX81 荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>步骤 11.2.3 用于成像</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-20ML</td><td>步骤 8.1.2，培养基成分的一部分</td></tr><tr><td>M16878/1BFA 22 号导线</td><td>AWC</td><td>B22-1</td><td>第 7.5 小节，用于器件制备</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>步骤 8.1.2，电穿孔缓冲液成分的一部分</td></tr><tr><td>MF 319 显影液</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>10018042</td><td>步骤 2.2.9，光刻胶显影液</td></tr><tr><td>Microposit S1818 光刻胶</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>1136925</td><td>步骤 2.2.4，用于电极图案化的正性光刻胶</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，75 × 25 毫米</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>步骤 2.2.1，电极所用的钠钙玻璃基底</td></tr><tr><td>Model 2350 高压放大器</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>步骤 9.2.5，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>National Instruments LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>数据采集</td></tr><tr><td>针头，30G × 1 英寸</td><td>BD Scientific</td><td>305128</td><td>步骤 10.1.1，系统引液的一部分</td></tr><tr><td>PA90 IC OPAMP 电源电路</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>定制电路的一部分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>步骤 8.1.2，培养基成分的一部分</td></tr><tr><td>质粒 pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>步骤 8.3.4，用于细胞内递送</td></tr><tr><td>塑料管，0.010'' × 0.030&quot;</td><td>VWR</td><td>89404-300</td><td>步骤 10.1.2，用于系统引液</td></tr><tr><td>铂靶材</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>第 4.2 小节，用于物理气相沉积</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分</td></tr><tr><td>Pump 11 PicoPlus 微流控注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 70-2213</td><td>步骤 10.1.4，用于系统引液</td></tr><tr><td>PVD75 物理气相沉积系统</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>第 4.1 小节，用于物理气相沉积</td></tr><tr><td>PWM32 旋涂系统</td><td>Headway Research</td><td></td><td>步骤 2.1.6 和 2.2.2，用于基底上的光刻胶涂覆</td></tr><tr><td>PX-250 等离子体处理系统</td><td>March Instruments</td><td></td><td>第 7.2 小节，用于 PDMS 与玻璃基底的键合</td></tr><tr><td>SDG1025 函数/波形发生器</td><td>Siglent</td><td></td><td>步骤 9.2.2，实验装置的一部分</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分</td></tr><tr><td>SU-8 2010 负性光刻胶</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111053</td><td>步骤 2.1.7，用于微流控通道图案化</td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>步骤 2.1.12，用于光刻胶显影</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>步骤 6.2.1&amp;nbsp; PDMS 聚合物与固化剂的 10:1 混合物</td></tr><tr><td>注射器，1 mL</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>步骤 8.3.4，系统引液的一部分</td></tr><tr><td>SZ61 体视显微镜系统</td><td>Olympus</td><td></td><td>第 7.3 小节，用于通道与电极的对准</td></tr><tr><td>组织培养处理 T25 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353108</td><td>步骤 8.1.2，用于细胞培养</td></tr><tr><td>钛靶材</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>第 4.2 小节，用于物理气相沉积</td></tr><tr><td>透明掩模</td><td>CAD/ART Services</td><td></td><td>步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于光刻</td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>步骤 6.1.2，用于晶圆硅烷化</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>步骤 8.1.3 和 8.3.1，用于细胞收获</td></tr></tbody></table>

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

目前的治疗创新，例如CAR-T细胞疗法，高度依赖病毒介导的基因递送。尽管该方法效率较高，但其制造成本高昂，这促使人们关注使用其他替代方法进行基因递送。电穿孔是一种基于电物理原理的非病毒性方法，可用于将基因及其他外源性物质递送至细胞内。当施加电场时，细胞膜会暂时允许分子进入细胞。通常，电穿孔在宏观尺度上进行，以处理大量细胞。然而，这种方法需要大量的经验性实验来优化操作方案，当处理原代细胞或难以转染的细胞类型时，成本尤为高昂。漫长的方案开发过程，加上需要施加高电压以达到足以使细胞膜通透的电场强度，促使了微尺度电穿孔装置的发展。这些微电穿孔装置采用常见的微加工技术制造，能够在保持高通量潜力的同时，实现更精确的实验控制。本研究基于一种可在连续流动条件下以单细胞分辨率检测细胞膜通透化程度的微流控-电穿孔技术。然而，该技术此前仅能以每秒处理4个细胞的速度运行，因此本文提出并展示了一种提高系统通量的新方法。这种新技术被称为基于细胞群体的反馈控制，它通过评估细胞对多种电穿孔脉冲条件的通透化响应，确定最适合待测细胞类型的电穿孔脉冲参数。随后在高通量模式下，将该“最优”脉冲应用于流动中的细胞悬液。本文详细介绍了装置的制备步骤、微流控实验的设置与运行流程，以及结果分析方法。最后，通过将编码绿色荧光蛋白（GFP）的DNA质粒递送至HEK293细胞，验证了该微电穿孔技术的有效性。

图4 展示了在单一脉冲幅度下，单细胞水平膜通透性检测的工作原理。在电穿孔实验启动后，细胞检测算法通过逐点、基于斜率的检测方法确定用于细胞识别的最佳阈值。系统随后持续监测（1）测量电流是否出现显著的负向变化，该变化表明有细胞进入。这是由于生物细胞膜具有绝缘特性，当细胞穿过电极对时，会导致阻抗瞬时升高，从而引起测量电流急剧下降，实现稳定的细胞检测（2），并最终触发切换至计算机控制的脉冲施加（4）。绝缘的细胞会置换电极之间的电解液体积，导致电流下降，其下降幅度与细胞大小成正比。这一电流变化记为 ΔIC（3）。在完成 ΔIC 计算后，系统立即向正在通过的细胞施加预设的电脉冲（4）。这一瞬时能量输入会在系统中引入短暂的检测干扰（灰色区域）。在信号重新锁定，即切换回细胞监测模式后（5），可以明显观察到电穿孔脉冲已使细胞膜发生通透化，因为细胞离开电极区域时，其所引起的电流变化幅度显著减小（6）。细胞在电穿孔脉冲施加前后因阻抗大小不同所导致的两次电流下降之间的差异称为通透化电流，记为 ΔIP</s...

本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。

当前的治疗创新，例如CAR-T细胞疗法，在很大程度上依赖于病毒介导的基因递送。尽管该技术具有高效性，但……

该方法可帮助研究人员确定特定细胞类型所需的最优电穿孔脉冲条件，同时减少对传统经验性实验方法的依赖。该方法利用微电穿孔技术，制造出一种可扩展的微流控驱动装置，能够在整个电穿孔过程中实时电学监测细胞膜通透化的程度。本实验操作将由我实验室的硕士研究生 Kishankumar Busha 进行演示。首先，使用匀胶机的真空系统将硅片固定在匀胶机的卡盘上。然后设定匀胶程序。接着，将4 mL的SU-8 2010光刻胶滴加到硅片中心，运行程序。当系统完全停止后，关闭真空。然后将带有二维微流控通道设计的光掩模固定在掩模支架上，并将涂有 SU-8 光刻胶、涂层面朝上的硅片放置在晶圆卡盘上。设置曝光参数为 150 毫焦每平方厘米，启动设备运行。紫外光照射后，将硅片浸入SU-8显影液中，轻轻搅拌3至4分钟。随后将硅片从溶液中取出，并用异丙醇冲洗表面。接着，将硅片放入150摄氏度的烘箱中烘烤30分钟，进行硬烘。然后让其冷却至室温，再使用触针式轮廓仪测量通道侧壁的精确高度和斜率。接着，将一毫升光刻胶滴加到载玻片表面，并再次运行程序。待系统完全停止后，关闭真空泵并取下载玻片。将带有二维电极设计的光刻掩模固定在掩模 holder 上后，将涂有 S-1818 光刻胶且光刻胶面朝上的玻璃晶圆插入并固定在晶圆卡盘上。设置曝光参数为 215 毫焦耳每平方厘米，运行曝光设备。曝光完成后，将玻璃片浸入 MF-319 显影液中显影两分钟，并轻轻摇动以促进显影。然后移除玻璃晶圆，并用去离子水冲洗其表面。最后，将玻璃载片放入150摄氏度的烘箱中进行坚膜烘烤，确保待测基底表面朝上。30分钟后，从烘箱中取出载片，并避免光照。将玻璃载玻片浸入聚四氟乙烯容器中盛有的10比1缓冲氢氟酸溶液内，蚀刻一分钟。然后将玻璃载玻片转移至去离子水中，清洗三次。接着，使用物理气相沉积系统，以每分钟100埃的速率溅射钛8分钟，再以每分钟200埃的速率溅射铂10分钟。然后，为了去除光刻胶，将镀有金属的玻片浸入丙酮溶液中10分钟，并对溶液进行超声处理以产生搅动。如有必要，可使用浸有丙酮的擦拭布清除任何残留物。接下来，进行聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模塑：在置于电子天平上的一次性容器中，按10:1的质量比将PDMS弹性体基料与固化剂混合。然后，将PDMS溶液倒入硅晶圆上，并将混合物置于真空环境中以去除气泡。在65摄氏度下固化至少四小时后，用剃须刀片的尖端切下成型的PDMS，并从硅晶圆上剥离。接着使用锋利的活检打孔器，去除器件入口和出口处的PDMS。接下来，设置等离子体发生器以进行PDMS键合。然后将PDMS和带有电极的玻璃载片放入系统中，使功能面朝上，并运行程序。程序完成后，取出器件，并使用体视显微镜快速将通道结构与电极对齐。从PDMS中心向两侧均匀施加压力，以去除键合界面处任何不需要的气泡。收集HEK293细胞，离心后将沉淀重悬于电穿孔缓冲液中，浓度约为每毫升五百万个细胞。接着，加入编码GFP的质粒DNA，使其终浓度为20微克每毫升，并轻轻混匀。然后将血浆-DNA细胞悬液转移至一个立方厘米的注射器中用于实验。通过载物片夹将微流控装置放置在显微镜载物台上。接着打开电荷耦合器件（CCD）相机，并将微流控通道调至焦点清晰。接下来进行单细胞电穿孔时，将注射泵的流速设置为每分钟0.1至0.3微升，以确保单个细胞顺利通过电极组。然后设定初始且最低电能电穿孔脉冲的脉冲参数。根据预先确定的每次脉冲应用所对应的细胞检测数量进行操作。每种测试条件结束后，从微装置出口吸取细胞，并用恢复培养基重新填充出口。依次更换电穿孔脉冲条件并重复操作，直至完成所有电穿孔脉冲条件的测试。随后，确定用于高通量基于群体反馈的电穿孔脉冲参数。对于基于群体反馈控制的电穿孔，将注射泵的流速设置为每分钟一至三微升，并将脉冲幅度设置为优化条件。然后关闭触发模式，并将脉冲宽度设置为与细胞通过时间相匹配。在完成所需数量的细胞电穿孔后，关闭注射泵和函数发生器。然后将出口储液槽中的细胞转移至装有预热恢复培养基的适当大小的细胞培养瓶或培养板中，并将培养瓶或培养板放入培养箱。进行数据分析时，将数据导入分析软件，针对每种电脉冲条件生成电流随时间变化的曲线图。随后确定细胞膜通透化的程度，绘制涵盖所有测试脉冲条件的细胞膜通透化图谱，并验证最佳的电脉冲条件。孵育结束后，使用 FITC 和远红滤光片捕获荧光图像，并通过人工或算法分析图像集。此处重点介绍针对单一脉冲幅度的单细胞水平通透性检测的操作原理。每次电穿孔脉冲参数处理后，均测试下一个更高能量的电穿孔脉冲。HEK293细胞的细胞膜通透性图谱显示，施加的电能与细胞膜通透化程度之间存在明显相关性。在本实验中，确定1.8千伏/厘米的电场强度和670微秒的脉冲时长为最佳条件。在这些参数下，实现了70%的电转染效率。与电场强度为每厘米0.4千伏、脉冲持续时间为三毫秒的条件相比，24小时时的电转染效率低于5%。术语“工艺流程”（recipe）常用于描述微加工工艺的具体步骤，强调了遵循或优化每个步骤以成功制备功能器件的重要性。该电穿孔技术可应用于其他生物医学研究项目，例如CAR-T细胞的制备与检测，或CRISPR-Cas9基因编辑技术的优化与验证。这种微电穿孔技术能够通过电学手段检测不同类型细胞对电脉冲条件的响应，并将这些信息与临床相关分子货物的递送效果相关联。

the-fabrication-operation-continuous-flow-micro-electroporation

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

具有透化检测功能的连续流动微电穿孔系统的制造和操作

非接触式介电泳（cDEP）利用颗粒固有的介电特性实现其分选与富集。流体电极通道取代了传统介电泳中的金属电极，使cDEP适用于对生物颗粒进行无损、无菌的表征与分选。本文演示了如何制备cDEP微装置，并开展细胞表征与分选实验。...

无标记细胞分离与富集通过非接触式介电泳

开发了一种微流控涡旋辅助电穿孔平台，可对相同细胞群体依次递送多种分子，并实现精确且独立的剂量控制。在电穿孔前进行的基于尺寸的目标细胞纯化步骤，有助于提高分子递送效率和处理后细胞的存活率。...

用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。...

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

本文描述了一种新型离子浓度极化（ICP）平台的实验方案，该平台能够在任意操作条件下阻止ICP区域的扩散。该平台的独特能力源于同时利用了离子耗尽和富集这两个ICP现象的相反极性过程。...

利用相邻离子交换膜间离子浓度极化的融合阻断极化区的传播

采用低成本干膜光刻胶技术设计并制备了一种微流控生物传感器平台，用于多种分析物的快速、高灵敏度定量检测。该一次性使用系统通过停流技术实现对芯片上固定的酶联检测方法进行电化学读出。...

基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。...

扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。...

基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

电穿孔是利用脉冲电场（PEFs）在细胞培养物中形成瞬时孔隙，以导入分子货物的技术。该技术近年来已在研究和临床领域得到广泛应用。本文中，我们描述了使用近期开发的“电穿孔细胞分析系统”进行活细胞荧光显微镜观察的电穿孔技术。...

一种用于活细胞荧光显微镜观察的电穿孔细胞分析方案——基于U2 OS细胞培养

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。...

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。...

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

学习微流控电穿孔技术，利用硅晶圆和SU-8光刻胶制造可扩展的微流控装置，实现单细胞转染和实时膜透化监测。该方法可优化脉冲条件，提高转染效率，适用于HEK293等多种细胞类型的高通量研究。

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

探索更多视频