非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

NASH 是全球最重要的慢性肝病之一。它可发展为纤维化、肝硬化，最终导致肝癌。研究 NASH 中细胞外基质（ECM）的动态变化有助于更好地理解纤维化过程。

传统的成像方法无法显示细胞外基质（ECM）三维结构的变化，从而限制了对肝纤维化过程中动态ECM重塑过程的理解。首先，在操作前称量小鼠的体重。麻醉小鼠后，使用毛发修剪器剃除腹部区域的毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。

将小鼠仰卧放置，并用胶带将其四肢固定在手术板上。使用梅奥剪和艾德森镊在下腹部侧方做一个3厘米的横向切口，然后从下腹部垂直向上至剑突处做一个5厘米的纵向切口，注意不要打开胸腔。

打开腹膜后，将肠管轻轻移至动物左侧，并用棉签轻轻抬起肝脏右叶，以暴露门静脉。进行门静脉插管时，将24号静脉留置针插入门静脉的远端，将导管尖端置于门静脉分支进入肝叶之前的位置。

当导管进入静脉时，立即拔出针头。通过导管使用1毫升注射器以PBS灌注肝脏，检查导管是否正确置于静脉内。使用Dumont显微镊、Castroviejo显微针和4-0缝线，在门静脉分叉下方缝合一针，并在其下方1厘米处缝合第二针，以固定导管。

使用鲁尔接头将导管连接至一段长度为一米、内径为三毫米、外径为4.1毫米的硅胶管。将硅胶管连接至蠕动泵和盛有去离子水的储液器。仔细去除管路内的气泡，并在灌注过程中避免产生新的气泡。

将蠕动泵的流速设置为每分钟0.2毫升。先用去离子水灌注两小时，灌注过程中肝脏颜色将从红色变为黄色。然后将灌注液更换为0.5%脱氧胆酸钠溶液，继续灌注过夜，灌注结束时肝脏将变为白色。

将灌注液更换为去离子水，灌注两小时。使用Dumont显微镊子和显微弹簧剪取脱细胞肝脏，在含PBS的培养皿中小心清洗。取一小块脱细胞肝脏转移至载玻片上，将组织置于中央位置。

用移液器加入10 µL抗荧光淬灭封片剂至组织上，以防止组织干燥。用盖玻片覆盖组织，并施加轻微压力以压平样品。用无色透明指甲油密封盖玻片边缘。

在盖玻片顶部滴加一滴浸油，将载玻片置于显微镜载物台上。降低20X油镜物镜，直至其接触浸油。切换至波长为405纳米的紫色通道。

打开快门并聚焦样品。导航并定位成像区域。在切换至使用激光光进行图像采集前，关闭快门。

启动双光子激光器时，先切换到计算机控制，首先打开双光子激光器。然后开启双光子激光控制器和快门，确保输出功率高于 2.5 瓦。降低激光功率以防止荧光淬灭。

选择并调整光电倍增管和混合探测器，以适配所选的荧光染料。选择同时或顺序成像模式。将针孔调整至最高值。

调整激光波长、增益、功率、偏移、像素驻留时间、像素平均大小和缩放倍数。滚动计算机Z轴控制器并设置Z轴范围。定义起始点和终点，并选择在体积内采集的图像数量。

采集图像。在进行双光子显微镜成像后，未脱细胞的样本显示出胶原网络的低分辨率图像。在脱细胞的细胞外基质中，普通饮食组与高脂饮食组肝脏的胶原纤维形态及空间分布呈现出明显差异。

普通饲料饮食小鼠的胶原纤维呈现出交织且结构良好的网络，而快餐饮食小鼠的胶原纤维束连接性较差。肝脏细胞外基质的三维结构显示，普通饲料饮食小鼠的胶原纤维形成结构良好的网络，而快餐饮食小鼠则未见此特征。为确认脱细胞化细胞外基质中纤维状胶原的质量，切片经苏木精-伊红和天狼星红染色。

苏木精和伊红染色显示所有细胞均已被去除。在天狼星红染色图像中，普通饲料喂养小鼠的细胞外基质呈现出结构良好的网络。相比之下，快餐饮食喂养小鼠的胶原纤维更为致密。

灌流前需仔细去除试管内的气泡。气泡会阻塞肝脏中的血管，影响灌流效果。