Name: 非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的 3D 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 了解非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的原位灌注脱细胞与双光子显微成像技术。该方法可三维可视化ECM重塑动态，为研究肝纤维化机制提供可靠平台。

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感谢 Hyesuk Park 提供的技术帮助。本研究获得了美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）和美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：R01 2DK083283，授予 NJT）以及美国国立衰老研究所（NIA）和美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：1R01AG060726，授予 NJT）的资助。&#160;我们衷心感谢 Beckman 中心细胞科学影像设施的 Jon Mulholland 和 Kitty Lee 在双光子显微成像技术方面提供的技术支持。&#160;

动物实验根据斯坦福大学和帕洛阿尔托退伍军人事务医院的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验程序进行。6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分别喂食普通饲料或含4.2%高果糖玉米糖浆（见材料表）的快餐饮食，持续14周5。小鼠饲养于标准笼具中，维持12小时明暗循环环境。
1. 肝脏灌注的手术准备与操作步骤
<ol>
	<li>在操作前称量小鼠的体重。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见 材料表通过腹腔注射给药。在进行下一步操作前，通过脚趾夹捏法确认小鼠已完全麻醉。 
	注意：由于这是非存活手术，此处不需要异氟烷。</li>
	<li>使用毛发修剪器剃除腹部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。将小鼠仰卧放置，用胶带将其四肢固定在手术板上。</li>
	<li>通过夹捏脚趾再次确认麻醉深度后，使用梅奥剪刀和艾德森镊子（参见 材料表在下腹部外侧做一条3 cm的横向切口，然后从下腹部至剑突做一条5 cm的纵向切口。注意避免打开胸腔。</li>
	<li>打开腹膜后，将肠管轻柔地移至动物左侧，并用棉签轻轻抬起肝脏右叶（参见 材料表暴露门静脉。</li>
	<li>使用24G静脉导管插管门静脉。将导管插入门静脉远端，导管尖端置于门静脉分支进入肝叶之前的位置。</li>
	<li>当导管进入静脉时，立即拔出针头。使用1 mL注射器向肝内灌注PBS，以确认导管在静脉内的位置是否正确。 通过 导管 
	&#8203;注意：PBS 灌注后，所有叶应立即变白。若导管位置正确，静脉血将迅速流经导管。</li>
	<li>使用 Dumont 显微镊子、Castroviejo 显微持针器和 4-0 缝线（参见 材料表在门静脉分叉下方缝合一针，并在其下方1厘米处缝合第二针以固定导管。</li>
</ol>
2. 组织脱细胞
<ol>
	<li>使用鲁尔接头将导管连接至一段硅胶管（长约1 m，内径3 mm，外径4.1 mm）。将硅胶管连接至蠕动泵和盛有去离子水的储液瓶（见材料表）。</li>
	<li>仔细去除管路内的气泡，并在灌注过程中避免产生新的气泡。将蠕动泵设置为流速0.2 mL/min（即288 mL/24 h）。</li>
	<li>首先用去离子水灌注（约50 mL/只小鼠），持续2 h。灌注过程中肝脏颜色将由红色变为黄色。 
	注意：动物在灌注10分钟后将死亡。</li>
	<li>更换灌注液为0.5%（wt/vol）脱氧胆酸钠（DOC，见材料表），继续灌注过夜（18 h，约250 mL/只小鼠）。灌注结束时肝脏将变为白色（图1）。</li>
	<li>再次更换灌注液为去离子水（约50 mL/只小鼠），继续灌注2 h。</li>
	<li>使用Dumont显微镊和显微弹簧剪（见材料表）取出脱细胞肝脏，并在培养皿中用PBS小心清洗。</li>
	<li>将脱细胞组织切成小块，用于立即成像，或于-80 °C冷冻保存，以进行后续生化分析，如串联质谱、ELISA或Western blot。</li>
</ol>
3. 成像用载玻片的制备（使用多光子/共聚焦荧光显微镜）
<ol>
	<li>取一小块脱细胞肝脏组织（&#60;3 × 3 × 3 mm）置于显微镜载玻片上，并将组织放置于中央位置。</li>
	<li>用移液器向组织中加入 10 µL 抗荧光淬灭封片液（见材料表），以防止组织干燥。</li>
	<li>用盖玻片覆盖组织，并施加轻微压力以压平样品。用无色透明指甲油密封盖玻片边缘（图2）。 
	&#8203;注意：由于使用的是直立式双光子显微镜，因此样品上需加盖玻片。但如果使用倒置显微镜，样品的放置方式可有所不同。</li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
	<li>在盖玻片顶部滴加一滴浸油，将玻片放置在显微镜载物台上。降低20倍油镜物镜，使其接触浸油。</li>
	<li>切换至紫色（405 nm）通道，打开快门，并对样品进行聚焦。导航并定位待成像的兴趣区域。在切换至使用激光光进行图像采集前，关闭快门。</li>
	<li>切换至计算机控制并启动双光子激光器。首先打开双光子激光器（图3A），然后打开双光子激光控制器（见材料表）和快门（图3B、C）。确保输出功率高于2.5 W。 
	降低激光功率以防止荧光淬灭。选择并调节探测器（包括光电倍增管和混合探测器），以适配所选用的荧光染料。 
	注：双光子成像在860 nm激发波长下进行。分别选择两个通道用于胶原蛋白二次谐波生成（SHG）和双光子激发荧光（TPEF）&#160;成像。其中一个通道对应415–445 nm波长范围，用于检测来自SHG信号的胶原蛋白精细结构；另一通道覆盖465–669 nm范围，用于收集TPEF信号。</li>
	<li>选择同时或顺序图像采集模式。将针孔调整至最大值。调节激光波长、增益、功率和偏移量。调节像素驻留时间、像素尺寸、平均次数和缩放倍数（图4A）。</li>
	<li>滚动计算机z轴控制器，设置z轴范围，定义起始点和终止点，并选择在体积内（z-stack）采集的图像数量。开始采集图像。 
	注：此处选择20 µm的Z轴扫描范围和1 µm的Z步进尺寸（图4B）。</li>
</ol>

<ol><li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis%3A+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence%2C+incidence%2C+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li>
<li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li>
<li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li>
<li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83(2019).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398(2016).</li>
<li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li>
<li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+cancer%3A+A+strained+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+%28C3A%29+function+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).</li>
<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

作者声明本文不存在利益冲突。

本方案表明，通过低流速十二烷基碳酸钠（DOC）进行脱细胞化 原位 灌注法可保护脆弱的三螺旋及天然纤维状胶原结构，为捕捉非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纤维化过程中动态的细胞外基质（ECM）重塑提供了可靠且经济有效的平台。尽管在鉴定ECM组分或构建用于细胞培养的生物支架前，已对正常和纤维化肝脏进行了脱细胞处理，但肝纤维化中ECM重塑的动态过程尚未得到充分研究8,9,10该方法使研究者能够对不同纤维化模型进行比较。
目前，已有多种灌注方案使用脱氧核糖核酸酶（DNase）、十二烷基硫酸钠（SDS）或曲拉通X-10011。由于需要大量溶液，DNase的成本较高。SDS是一种强烈的变性溶液，属于阴离子去垢剂，可破坏细胞膜并使蛋白质变性，因此在SDS灌注后完整保留整个胶原网络具有挑战性。相比之下，曲拉通X-100是一种温和的非变性非离子型去垢剂...

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的肝脏疾病，影响约20%至25%的成年人群。其中25%的NAFLD患者会进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），此时发生肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌的风险显著增加1。预计在未来20年内，NASH将在美国导致约200万例与肝脏相关的死亡2。由于目前尚无获批的治疗方法，迫切需要阐明导致NASH患者肝纤维化的机制，并开发针对性治疗策略3。
细胞外基质（ECM）是一种动态且复杂的微环境，可与细胞进行双向通讯，从而调控组织稳态4。肝脏ECM由蛋白聚糖、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白等结构成分以及其他非结构蛋白（如嗅觉蛋白和血小板反应蛋白）组成，为组织提供物理和结构支持4。
肝纤维化是对多种病因所致肝损伤的一种慢性伤口愈合反应，包括非酒精性脂肪性肝炎（NASH）3。其成因是动态细胞外基质（ECM）重塑过程失衡，表现为受损肝脏中结构蛋白过度沉积4。纤维化的发生依赖于不同肝细胞类型之间的动态细胞间通讯。肝星状细胞（HSCs）&#160;在活化后可分化为表达平滑肌α-2肌动蛋白、具有迁移和增殖能力的类肌成纤维细胞，并合成ECM蛋白以实现伤口闭合。活化的HSCs是肝脏中主要的胶原蛋白生成细胞1。
细胞外基质重塑的分子机制、纤维化模式及其与细胞事件的关系尚不明确。对三维（3D）结构的深入理解&#160;细胞外基质的结构仍然至关重要，尽管质谱技术已有助于分析细胞外基质的蛋白质组成4传统上，Masson三色染色、苦味酸天狼星红染色以及二次谐波成像（SHG）均在二维（2D）肝组织薄切片上进行。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）典型的纤维化模式称为 &#34;铁丝网，&#34; 延伸至3区，表现为窦周/细胞周纤维化5,6然而，目前尚缺乏针对天然肝脏三维结构的研究，尤其是无需组织切片的技术手段。开发强大的成像方法，以识别肝纤维化过程中动态细胞外基质重塑中纤维化的模式与特征，将显著加深对NASH机制的理解，并有助于发现新的治疗靶点。
为应对这些挑战，优化了一种快速高效的方案，用于成像天然肝细胞外基质 通过 脱细胞化7全肝脱细胞是一种通过洗涤剂灌注去除肝脏细胞成分，同时保留天然三维细胞外基质（ECM）网络的技术。小鼠分别接受普通饲料或快餐饮食（FFD）喂养，持续14周。脱细胞处理在喂养结束后进行。 原位 门静脉灌注温和去垢剂并采用低流速以保存三螺旋及天然纤维状胶原结构。应用双光子显微镜分析细胞外基质（ECM）中胶原结构的变化。重建并分析了正常肝脏与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏中天然ECM结构的三维图像。执行 原位 灌注脱细胞化并结合双光子显微镜分析支架，为观察肝脏中动态细胞外基质重塑提供了一个实用且经济的平台。

<table><tbody><tr><td>4-0 MONOCRYL 无色 1 x 18&quot; P-3</td><td>MONOCRYL</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 缝合线</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪注射液（xylazine）</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>本药物须由持证兽医开具处方或在其指导下使用。</td></tr><tr><td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. 导管（含 BC 技术）</td><td>BD</td><td>382612</td><td></td></tr><tr><td>标准饲料</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>对照饮食。一种固定配方、不可高压灭菌的饲料，采用优质原料制成，旨在支持啮齿类动物的妊娠、哺乳和生长。</td></tr><tr><td>快餐饮食（AIN76A 西式饮食）</td><td>测试饮食</td><td>1810060</td><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td></tr><tr><td>苏木精和伊红染色试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3502</td><td>https://vectorlabs.com/苏木精和伊红染色试剂盒.html</td></tr><tr><td>Kent Scientific 大鼠手术套件</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - 小瓶</td><td>除给药与剂量部分列出的物种外，KetaVed 还在非人灵长类动物中进行了临床研究。</td></tr><tr><td>Leica SP5 直立式共聚焦多光子显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头（带SPIN-LOCK的三通旋塞阀）&amp;reg;)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td></tr><tr><td>Picrosirius Red 染色试剂盒</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td></tr><tr><td>棉签</td><td>清教徒</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>sigmaaldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>糖浆</td><td>www.target.com</td><td>710 毫升</td><td>该链接为商品购买页面，不属于 JoVE 教育与科学内容范畴，无需翻译。</td></tr><tr><td>可变速度蠕动泵</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&amp;amp;psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国最常见的慢性肝病，影响超过7000万美国人。NASH可进展为肝纤维化，并最终发展为肝硬化，而肝硬化是肝细胞癌的重要风险因素。细胞外基质（ECM）通过基质细胞信号提供结构支持并维持肝脏稳态。via肝脏纤维化源于动态ECM重塑过程中的失衡，其特征是结构成分的过度积聚以及糖胺聚糖的相关改变。NASH典型的纤维化模式被称为&#34;鸡丝样&#34;，通常表现为基于Masson三色染色和天狼星红染色所观察到的3区窦周/细胞周围纤维化。然而，这些传统的基于二维（2D）组织切片的薄层成像技术无法展示ECM结构的详细三维（3D）变化，从而限制了对肝脏纤维化中动态ECM重塑过程的理解。
本研究优化了一种快速高效的方法，用于对肝脏中天然细胞外基质结构进行成像 通过 脱细胞化以应对上述挑战。小鼠分别喂食普通饲料或快餐饮食持续14周。脱细胞化在之后进行 原位 门静脉灌注及双光子显微镜技术被用于成像和分析天然细胞外基质（ECM）的变化。对正常肝脏和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏的三维图像进行了重建与分析。执行 原位 灌注脱细胞化并结合双光子显微镜分析支架，为可视化肝脏中动态细胞外基质重塑提供了实用且可靠的平台。

采用二次谐波生成和双光子显微镜检测胶原纤维。信号来源于易碎的三螺旋结构以及天然的纤维状胶原结构。未使用特异性抗体来分析胶原蛋白亚型；但该方法可被添加至成像技术中。
在未进行脱细胞处理的情况下研究肝组织时，很难获得胶原网络的高分辨率图像（图5A）。在脱细胞后的细胞外基质（ECM）中，胶原纤维（绿色）呈现平行或交织排列（图5B）。普通饮食（Chow）组与高脂饮食（FFD）组小鼠肝脏中细胞外基质成分的形态和空间分布存在明显差异。普通饮食小鼠的胶原纤维呈现出交织且结构良好的网络；而在高脂饮食小鼠中，胶原纤维束的连接性较差（图5B）。
为了进一步研究肝脏细胞外基质（ECM）的三维结构，采集了切片在20 µm Z轴体积（厚度）和1 µm Z轴步长条件下的图像。食...

本方案优化了肝脏 原位 灌注/脱细胞化与双光子显微镜方法，以建立可靠的平台，用于可视化非酒精性脂肪性肝炎（NASH）过程中细胞外基质（ECM）重塑的动态变化。

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国最常见的慢性肝病，影响超过7000万美国人。NASH可以……

NASH 是全球最重要的慢性肝病之一。它可发展为纤维化、肝硬化，最终导致肝癌。研究 NASH 中细胞外基质（ECM）的动态变化有助于更好地理解纤维化过程。传统的成像方法无法显示细胞外基质（ECM）三维结构的变化，从而限制了对肝纤维化过程中动态ECM重塑过程的理解。首先，在操作前称量小鼠的体重。麻醉小鼠后，使用毛发修剪器剃除腹部区域的毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。将小鼠仰卧放置，并用胶带将其四肢固定在手术板上。使用梅奥剪和艾德森镊在下腹部侧方做一个3厘米的横向切口，然后从下腹部垂直向上至剑突处做一个5厘米的纵向切口，注意不要打开胸腔。打开腹膜后，将肠管轻轻移至动物左侧，并用棉签轻轻抬起肝脏右叶，以暴露门静脉。进行门静脉插管时，将24号静脉留置针插入门静脉的远端，将导管尖端置于门静脉分支进入肝叶之前的位置。当导管进入静脉时，立即拔出针头。通过导管使用1毫升注射器以PBS灌注肝脏，检查导管是否正确置于静脉内。使用Dumont显微镊、Castroviejo显微针和4-0缝线，在门静脉分叉下方缝合一针，并在其下方1厘米处缝合第二针，以固定导管。使用鲁尔接头将导管连接至一段长度为一米、内径为三毫米、外径为4.1毫米的硅胶管。将硅胶管连接至蠕动泵和盛有去离子水的储液器。仔细去除管路内的气泡，并在灌注过程中避免产生新的气泡。将蠕动泵的流速设置为每分钟0.2毫升。先用去离子水灌注两小时，灌注过程中肝脏颜色将从红色变为黄色。然后将灌注液更换为0.5%脱氧胆酸钠溶液，继续灌注过夜，灌注结束时肝脏将变为白色。将灌注液更换为去离子水，灌注两小时。使用Dumont显微镊子和显微弹簧剪取脱细胞肝脏，在含PBS的培养皿中小心清洗。取一小块脱细胞肝脏转移至载玻片上，将组织置于中央位置。用移液器加入10 µL抗荧光淬灭封片剂至组织上，以防止组织干燥。用盖玻片覆盖组织，并施加轻微压力以压平样品。用无色透明指甲油密封盖玻片边缘。在盖玻片顶部滴加一滴浸油，将载玻片置于显微镜载物台上。降低20X油镜物镜，直至其接触浸油。切换至波长为405纳米的紫色通道。打开快门并聚焦样品。导航并定位成像区域。在切换至使用激光光进行图像采集前，关闭快门。启动双光子激光器时，先切换到计算机控制，首先打开双光子激光器。然后开启双光子激光控制器和快门，确保输出功率高于 2.5 瓦。降低激光功率以防止荧光淬灭。选择并调整光电倍增管和混合探测器，以适配所选的荧光染料。选择同时或顺序成像模式。将针孔调整至最高值。调整激光波长、增益、功率、偏移、像素驻留时间、像素平均大小和缩放倍数。滚动计算机Z轴控制器并设置Z轴范围。定义起始点和终点，并选择在体积内采集的图像数量。采集图像。在进行双光子显微镜成像后，未脱细胞的样本显示出胶原网络的低分辨率图像。在脱细胞的细胞外基质中，普通饮食组与高脂饮食组肝脏的胶原纤维形态及空间分布呈现出明显差异。普通饲料饮食小鼠的胶原纤维呈现出交织且结构良好的网络，而快餐饮食小鼠的胶原纤维束连接性较差。肝脏细胞外基质的三维结构显示，普通饲料饮食小鼠的胶原纤维形成结构良好的网络，而快餐饮食小鼠则未见此特征。为确认脱细胞化细胞外基质中纤维状胶原的质量，切片经苏木精-伊红和天狼星红染色。苏木精和伊红染色显示所有细胞均已被去除。在天狼星红染色图像中，普通饲料喂养小鼠的细胞外基质呈现出结构良好的网络。相比之下，快餐饮食喂养小鼠的胶原纤维更为致密。灌流前需仔细去除试管内的气泡。气泡会阻塞肝脏中的血管，影响灌流效果。

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非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的 3D 成像

在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。...

利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。...

分离与三维胶原三明治培养原代小鼠肝细胞以研究细胞骨架在体外胆小管形成中的作用

本方案介绍了一种具有伴随性纤维化间质区室的三维仿生模型。该模型采用生理相关浓度的水凝胶按比例制备，模拟间质细胞外基质的生物物理特性，而细胞外基质是细胞相互作用、肿瘤生长及转移的活性调节介质。...

一种用于在具有可调生物物理特性的三维环境中研究肿瘤-间质相互作用的肝癌仿生模型

本方案描述了一种增强型超声技术的使用方法，用于无创性地观察和量化非酒精性脂肪性肝病啮齿类动物模型中肝组织的变化。...

超声与剪切波弹性成像在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型中的应用

肝脏疾病可由多种原因引发，导致纤维化或肝硬化。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺，必须探索替代方案。我们的研究提出在动物模型的肝组织中植入胶原支架。...

三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略

使用饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠模型，我们描述了一种新型方法的应用 体内...

新方法 在体 内 用于评估非酒精性脂肪性肝病进展的微型计算机断层扫描成像技术

本研究的目的是开发一种用于肝纤维化早期诊断的新型三维数字模型，该模型包含患者肝脏中每个体素的硬度信息，因此可用于计算患者肝脏在不同纤维化阶段的分布比例。...

基于磁共振弹性成像的肝纤维化早期诊断三维数字模型

在此，我们介绍一种可实现非侵入性 体内 小鼠眼前房移植肝类器官的成像。该实验流程涵盖从原代肝细胞生成类器官，到将其移植至小鼠眼前房的全过程 体内 通过共聚焦显微镜实现细胞分辨率成像。...

活体成像小鼠眼前房移植的肝类器官

一种模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的小鼠模型，具有代谢功能障碍、肝脏基因表达改变以及肝组织病理学变化，且包含进展至晚期纤维化3期的纤维化特征，与人类MASLD相似。该模型可用于MASLD发病机制的研究以及新疗法的临床前研究。...

伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

本方案介绍了一种用于活体小鼠体内显微成像的前沿可重复使用肝脏成像工具（RHIT），该工具可增强组织稳定性，适用于快速和急性实验。RHIT采用3D打印设计，生产成本低，具有可扩展性和多功能性，能够实现对不同体型小鼠代谢过程的长期观察。...

可重复使用的肝脏成像工具：一种用于肝脏活体显微成像的可重复使用3D打印工具

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。...

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

了解非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的原位灌注脱细胞与双光子显微成像技术。该方法可三维可视化ECM重塑动态，为研究肝纤维化机制提供可靠平台。

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

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