大鼠模型中的视网膜病理生理学评估

这些技术的总体目标是评估链脲佐菌素诱导的糖尿病视网膜病变大鼠模型中的视网膜病理生理学。糖尿病视网膜病变是失明的主要原因之一。持续的搜索正在进行中，以发现具有更好疗效和更长作用的药物来治疗糖尿病视网膜病变。

在临床前动物模型中发现药理剂的过程起着至关重要的作用。这些动物模型有助于了解眼睛后节段组织的结构和功能改变。因此，我们将展示三种不同的技术来研究后段问题的这些变化。

我们正在展示组织学以研究层中视网膜细胞的形态变化，BRB分解测定通过量化血浆中玻璃体中泄漏的蛋白质来研究受损的BRB，以及荧光血管造影术以使用FITC-葡聚糖染料可视化视网膜脉管系统。使用高剂量的戊巴比妥对大鼠实施安乐死，并确认其死亡，没有可检测到的心跳。通过使用手术刀刀片在眼睛的鼻和颞叶区域做切口来修饰眼睛。

然后沿着其边缘切割，将眼睛从眼眶窝中取出。去除眼睛周围的多余脂肪，并将其置于5毫升固定溶液中。将眼睛在固定溶液中孵育24至48小时。

固定后，将眼睛从固定溶液中取出，转移到装有10 mL PBS的培养皿中。使用微型镊子，用视神经握住眼睛，并在微型剪刀的帮助下在pars plana上划痕。切开角膜的整个边缘，将眼的前杯和后杯分开。

取下晶状体并切断视神经。将后杯切成两半，穿过视神经。将每半部分转移到单独的盒式磁带中。

通过将乙醇的浓度从50%逐渐增加到100%乙醇来使组织脱水。最后，用二甲苯清除乙醇。用60摄氏度的预热石蜡浸渍组织以取代组织中的二甲苯。

使用钢模准备石蜡块，以将组织和盒作为底座。在准备砌块时，眼睛的视盘部分应面向钢模的底部。用石蜡填充盒，然后将其转移到阴凉的表面上。

将刀片式服务器和胶盒安装到切片机上的相应支架上。使用切片机修剪多余的石蜡，并切割五到六个厚度为5微米的丝带。将丝带转移到预温水浴的表面上以展开丝带。

在涂有白蛋白的载玻片上收集切片。让载玻片在37摄氏度下干燥过夜。要进行苏木精和曙红染色，请将载玻片在60摄氏度下预热1小时以融化石蜡。

按照手稿中给出的染色程序进行。从组织补液开始，然后用苏木精染色，然后用曙红染色。现在，使组织脱水并在切片上添加安装介质。

将盖玻片放在切片上，并在光学显微镜下可视化。为了进行血液 - 视网膜屏障分解测定，使用氯胺酮和木拉嗪麻醉大鼠，并通过脚趾捏确认麻醉状态。定位心脏并用24号针头插入1 mL注射器，通过心脏穿刺抽血。

一旦收集了足够的血液，将其转移到EDTA涂层的管中。轻轻混合以防止溶血。对眼睛进行去核，并立即将其转移到干冰上。

在冷冻条件下，通过去除角膜和晶状体开始解剖眼睛。使用镊子从眼睛后段拉出玻璃体，而不会受到视网膜的任何污染。将其转移到带有三到四个珠子的均质管中。

使用珠状均质机以中速均质10秒对样品进行均质。将血液和玻璃体液样品转移到微量离心管中以进一步处理。将两个样品在4摄氏度下以5， 200 g离心10分钟。

使用多通道移液器，将250微升布拉德福德试剂加入孔中。使用PBS稀释玻璃体样品10次，血浆样品稀释20次。将5微升稀释的样品加入布拉德福德试剂中并充分混合。

将样品孵育20至30分钟，然后使用96孔板读数仪测量590纳米处的吸光度。样品的强度与蛋白质的浓度成正比。为了进行荧光血管造影，使用3%异氟醚麻醉大鼠，并通过脚趾冲头确认麻醉状态。

在注入染料之前，将尾巴浸入温水中。将1 mL每mL FITC-葡聚糖溶液50mg注入侧尾静脉。让染料循环5至10分钟。

使用戊巴比妥对大鼠实施安乐死，并通过无法检测到的心跳确认其死亡。对眼睛进行去核，然后进行平贴准备。要准备视网膜扁平支架，请将眼睛放在无纤维的Kimwipe上，并切除眼睛的前部。

慢慢地将晶状体和玻璃体液从眼睛的后段拉出。将后段转移到充满PBS的培养皿中并切断视神经。现在，将尖镊子的尖端放在巩膜和视网膜之间。

沿着杯子的边缘轻轻移动它，以确保视网膜在任何时候都不会附着在巩膜上。在视盘附近切开，使视网膜完全脱离巩膜。一旦确认视网膜未附着在任何一侧的巩膜上，将其缓慢推入PBS溶液中。

在镊子的帮助下，将视网膜转移到干净的载玻片上，而不会对其造成任何损害。使用微型剪刀或手术刀刀片，在视网膜上做四个切口，如图所示，将其分成四个象限。从视网膜周围去除多余的PBS，并在视网膜平坦支架上添加防褪色安装介质。

用盖玻片盖住它，并在共聚焦显微镜下可视化平面支架。这里需要注意的是，荧光血管造影的整个过程都是在最小的光线下进行的，以避免来自FITC-葡聚糖染料的荧光猝灭。在糖尿病大鼠中，视网膜细胞发生变性，导致进一步的并发症。

这些结构变化可以通过组织学技术可视化，以确定视网膜的细胞数量和厚度。在糖尿病大鼠的情况下，视网膜层的厚度由于水肿而增加。因此，该技术有助于筛选各种潜在的药理学药物来治疗糖尿病视网膜病变。

糖尿病引起的视网膜代谢变化导致的周细胞丢失和血液 - 视网膜屏障的破坏。由于蛋白质和其他生物分子泄漏到视网膜和玻璃体中，糖尿病大鼠玻璃体中总蛋白质的水平增加。预防血液 - 视网膜屏障的破坏可能会显着阻碍糖尿病视网膜病变的进展。

在糖尿病视网膜病变中，血管内皮生长因子的表达增加，导致新血管的形成。这些血管会扰乱正常的视网膜结构，因此其神经支配是治疗糖尿病视网膜病变的首要问题。荧光血管造影技术用于可视化新血管和血管泄漏，如本文重点介绍的那样。

然而，血管生成仅在糖尿病诱导 6 至 12 个月后才显现出来。该技术有助于我们量化药物治疗对血管生成和血管渗漏神经支配的影响。糖尿病视网膜病变的未来治疗需要更有效的药物，但未来的治疗只能通过更好地了解疾病的发病机制来实现。

掌握这些技术可以帮助研究人员更好地了解糖尿病视网膜病变的发病机制，这可能导致发现更好的药物干预。