Name: 细菌种群中分层基因型和辅助基因组位点的启发式挖掘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 探索使用ProkEvo计算平台对细菌种群进行分层基因型和辅助基因组位点启发式挖掘的方法。该方案支持大规模全基因组测序数据分析，以Salmonella Newport为例揭示种群结构和耐药性模式，助力公共卫生实时监测与流行病学研究。

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本研究工作得到了内布拉斯加大学林肯分校农业研究部（UNL-IANR）、国家抗菌耐药性研究与教育中心以及内布拉斯加食品与健康中心（隶属于食品科学与技术系，UNL）的资金支持。本研究的完成依赖于内布拉斯加大学林肯分校的霍兰计算中心（HCC），该中心获得了内布拉斯加研究计划的支持。我们还感谢通过霍兰计算中心访问开放科学网格（OSG）所提供的资源，开放科学网格由美国国家科学基金会和美国能源部科学办公室提供支持。本研究使用了Pegasus工作流管理软件，该软件由美国国家科学基金会资助（项目编号 #1664162）。

作者声明不存在任何竞争利益。

基于系统的启发式方法和分层种群结构分析为识别细菌数据集中可能解释独特生态学和流行病学模式的新基因组特征提供了框架20。此外，将附属基因组数据映射到种群结构上，可用于推断祖先获得和/或近期衍生的性状，这些性状有助于ST谱系或cgMLST变异株在不同储存库中的传播6,20,21,45,46。更广泛而言，对细菌种群中泛基因组内容分布的全球性评估可揭示种群近期可能经历的生态趋向性或地理空间/时间瓶颈背后的多样化模式18,21。对于致病菌而言，通过挖掘临床分离株与环境分离株的种群结构，可识别与人畜共患病事件相关的遗传决定因素，并用于改进诊断和监测手段<sup c...

细菌全基因组测序（WGS）在公共卫生实验室和监管机构的常规监测及流行病学调查中的应用日益广泛，已显著加强了对病原体暴发事件的调查能力1,2,3,4。因此，目前已有大量去标识化的WGS数据公开可用，可用于以前所未有的规模研究病原菌物种的群体生物学特征，包括基于群体结构、基因型频率以及跨多个储存库、地理区域和环境类型的基因/等位基因频率的研究5。最常见的基于WGS的流行病学调查通常仅依赖共享的核心基因组内容进行分析，即仅使用共享（保守）区域进行基因型分类（例如变异位点检测），而这些变异位点则成为流行病学分析和溯源追踪的基础1,2,6,7。通常，基于细菌核心基因组的分型采用多位点序列分型（MLST）方法，所用位点数量从七个到数千个不等8,9,10。这些基于MLST的策略包括将预组装或已完成组装的基因组序列比对至高度审编的数据库，从而将等位基因信息整合为可重复的基因型单元，用于流行病学和生态学分析11,12。例如，基于MLST的分类可在两个分辨率层次上生成基因型信息：较低分辨率的序列型（STs）或ST谱系（7个位点），以及较高分辨率的核心基因组MLST（cgMLST）变异型（约300–3,000个位点）10。
基于MLST的基因型分类在计算上具有可移植性，并且在不同实验室之间具有高度可重复性，因此被广泛接受为细菌物种水平以下的一种准确分型方法13,14。然而，细菌种群的结构具有物种特异性的克隆程度差异（即基因型同质性）、基因型之间复杂的等级亲缘关系模式15,16,17，以及附属基因组内容分布上的广泛变异18,19。因此，一种更为整体化的方法应超越对MLST基因型的离散分类，纳入不同分辨率尺度下基因型的层级关系，并将附属基因组内容的分布映射到基因型分类体系中，从而促进基于种群的推断18,20,21。此外，分析还可聚焦于即使亲缘关系较远的基因型之间附属基因组位点的共同遗传模式21,22。总体而言，这种综合方法能够无偏地探究种群结构与特定基因组组成（例如，基因位点）在地理空间或环境梯度上的分布之间的关系。该方法可提供有关特定种群生态特征的基础性和实用性信息，进而解释其在不同储存宿主（如食品动物或人类）中的嗜性及传播模式。
这种基于系统的、分层的、以群体为导向的方法需要大量的全基因组测序（WGS）数据，以获得足够的统计学效力来预测可区分的基因组特征。因此，该方法需要一个能够同时处理成千上万个细菌基因组的计算平台。最近开发的ProkEvo是一个免费、自动化、可移植且可扩展的生物信息学平台，支持基于分层整合的细菌群体分析，包括泛基因组作图20。ProkEvo支持对中等到大规模细菌数据集的研究，同时提供一个框架，使用户能够生成可验证和可推断的流行病学、生态学假设以及表型预测，并可根据需要进行自定义。本研究作为该流程的补充，提供了一份操作指南，介绍如何将ProkEvo生成的输出文件作为输入，用于分层群体分类和附属基因组挖掘的分析与解读。本研究以动物源性血清型Salmonella enterica谱系I中的S. Newport群体为例，旨在为微生物学家、生态学家和流行病学家提供实用指导，具体包括：i）使用自动化的、依赖系统发育的方法绘制分层基因型图谱；ii）评估基因型的频率分布，作为评价生态适应性的代理指标；iii）采用独立的统计方法确定谱系特异性的克隆化程度；iv）绘制谱系差异性耐药（AMR）位点，作为在群体结构背景下挖掘附属基因组内容的示例。更广泛而言，该分析方法提供了一个可推广的框架，能够在适用于推断进化和生态模式的规模上开展基于群体的基因组分析，而不限于特定目标物种。

<table><tbody><tr><td>经筛选的耐药性数据</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762</td></tr><tr><td>原始耐药性数据</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994</td></tr><tr><td>BAIPS 分析结果</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003</td></tr><tr><td>核心基因组系统发育树</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006</td></tr><tr><td>基因组 SRA 数据</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209</td></tr><tr><td>Linux、Mac 或 PC</td><td></td><td></td><td>任意高性能计算平台</td></tr><tr><td>MLST 分析结果</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997</td></tr><tr><td>SISTR 分析结果</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000</td></tr><tr><td>需提供 figshare 账户凭据以登录并访问相关文件</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

细菌群体中层级基因型与附属基因组位点的启发式挖掘

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

细菌全基因组测序（WGS）的常规化和系统性应用正在提升公共卫生实验室和监管机构所开展流行病学调查的准确性和分辨率。大量公开可用的WGS数据可用于在大规模上研究病原菌群体。最近，一个名为ProkEvo的免费计算平台被发布，旨在利用细菌WGS数据实现可重复、自动化且可扩展的基于层级结构的群体基因组分析。本研究中对ProkEvo的应用展示了将标准的群体基因型图谱绘制与附属基因组内容挖掘相结合在生态推断中的重要性。特别是，本工作使用R编程语言，基于ProkEvo生成的结果进行了群体尺度的层级分析。主要目标是为微生物学家、生态学家和流行病学家提供一个实用指南，展示如何：i）使用系统发育指导的层级基因型图谱绘制方法；ii）评估基因型的频率分布以作为生态适应性的代理指标；iii）利用特定的基因型分类来确定亲缘关系和遗传多样性；以及iv）绘制谱系特异性的附属基因座图谱。为了增强分析的可重复性和可移植性，采用了R Markdown文件来完整展示整个分析流程。示例数据集包含了来自人畜共患食源性病原菌Salmonella Newport的2,365个分离株的基因组数据。基于系统发育锚定的层级基因型图谱绘制（血清型 -&#62; BAPS1 -&#62; ST -&#62; cgMLST）揭示了该群体的遗传结构，突出显示序列型（ST）是关键的区分性基因型。在三个最主要的谱系中，ST5与ST118的共同祖先比与高度克隆型的ST45谱系更为接近。基于ST的差异进一步体现在附属的抗菌药物耐药性（AMR）基因座分布上。最后，采用基于系统发育锚定的可视化方法，将层级基因型与AMR内容相结合，揭示了亲缘结构和谱系特异性的基因组特征。综上所述，该分析方法为利用泛基因组信息开展启发式细菌群体基因组分析提供了一些指导原则。

通过利用计算平台ProkEvo进行群体基因组学分析，细菌全基因组测序数据挖掘的第一步是结合核心基因组系统发育关系来考察其层级化的群体结构（图1）。在以下情况下 S. enterica 谱系I，以 S. Newport 数据集的群体结构按层级划分如下：血清型（最低分辨率层级）、BAPS1 亚群或单倍型、ST 世系以及 cgMLST 变异型（最高分辨率层级）20. 这种基于系统发育指导的层级种群结构分析特别允许检验以下几点：i）在基于SISTR被错误分类为其他血清型的基因组情况下，其系统发育分布 沙门氏菌；ii) 种群的遗传或亲缘结构；iii) 不同基因型分辨率水平下的分化模式；iv) 揭示进化、生态或流行病学模式背后的主要基因型单元；v) 通过BAPS1亚群或单倍型组成分析ST谱系间的祖先关系，以及ST谱系内cgMLST变异型之间的关系；vi) 基于cgMLST变异型组成对ST谱系基因型同质性程度的部分评估。
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该分析性计算平台为对细菌群体基因组学感兴趣的微生物学家、生态学家和流行病学家提供了实用指导。具体而言，本文展示了如何进行：i）基于系统发育指导的分层基因型作图；ii）基于频率的基因型分析；iii）亲缘关系与克隆性分析；iv）谱系差异性附属基因座的鉴定。

细菌全基因组测序（WGS）的常规化和系统性应用正在提高流行病学调查的准确性和分辨率，从而……

该分析方案可实现对细菌致病种群的大规模研究。这一点非常重要，因为它能够提升生态学和流行病学调查的研究能力。然而，要实现这一目标，我们需要一种自动化且可扩展的工具，或一个计算平台，能够同时分析成千上万的基因组序列。ProkEvo 填补了这一空白，它能够大规模地进行实用的细菌种群分析，同时绘制泛基因组内容图谱，以评估基因型及其独特特征，服务于生态学和流行病学研究。本方案的主要优势在于利用功能强大、自动化且可扩展的计算平台（如 ProkEvo），对细菌种群中的层级基因型进行启发式挖掘。本文所介绍的分析方案具有多项实际应用价值。其中一个应用是促进诊断，即能够以可扩展的方式实时绘制和追踪细菌基因型图谱，从而识别和界定病原体的致病谱系，并在不同环境中追踪和绘制这些病原体的传播路径。另一个应用是加强公共卫生实验室和监管机构的常规监测工作，以促进在不同商业环境中对病原体的追踪。本文提供的方案为微生物学家、生态学家、流行病学家以及任何对细菌群体基因组学感兴趣的研究人员提供了实用指导。ProkEvo 是一个开源且公开可用的平台，其 GitHub 页面提供了详细的使用说明。本文所述的实验方案同样可在 GitHub 上获取。通过提供的操作指南，我们希望使 ProkEvo 及该实验方案易于使用，便于初级和高级研究人员广泛应用。开始使用 Gigi tree 进行分析，绘制系统发育树并整合基因型信息。为此，通过调整 x-lim 和 G 热图中的数值，优化 Gigi tree 图形尺寸，包括环的直径和宽度。在将多层数据与系统发育树一同绘图时，将所有元数据归并为尽可能少的类别，以方便选择配色面板。根据研究问题和领域知识进行数据汇总。完成后，通过汇总序列类型（ST）谱系和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）变异型的数据，使用柱状图评估相对频率，以促进数据可视化。选择用于数据汇总的经验性或统计学阈值。示例代码可用于检查ST序列型的频率分布并确定截断值。示例代码展示了如何将次要或低频的ST序列型进行归类汇总。未编号的ST序列型可归为其他ST序列型。对cgMLST变异体使用类似的代码。采用嵌套方法计算每个BAPS1亚组内各ST谱系的比例，以确定属于同一BAPS1亚组的ST。该代码示例展示了如何在不同BAPS1亚组中计算基于ST的比例。为了绘制耐药性或耐药基因位点在ST型谱系中的分布情况，可采用经验性或统计学阈值筛选出最重要的耐药基因位点，以方便可视化分析。提供一个包含所有ST型谱系中各耐药基因位点计算比例的原始 CSV 文件。接下来，使用代码计算每个ST的AMR比例。完成所有ST的计算后，使用代码将数据集合并为一个数据框，然后使用代码导出包含计算所得比例的csv文件。在绘制基于AMR的ST谱系分布图之前，需根据设定的阈值对数据进行筛选，以方便可视化展示。接下来，使用 Gigi tree 将核心基因组系统发育树与耐药性数据中的分层基因型分类信息整合到同一张图中进行绘制。然后，利用前文提到的参数在 Gigi tree 中优化图形尺寸。通过整合变量或采用二元分类（例如基因的有无）来优化可视化效果。在核心基因组系统发育背景下，分析了肠道沙门菌第一谱系的层级种群结构。随后利用所有层级基因型的相对频率，评估了整体分布情况及最常观察到的分类。为便于数据可视化，将较少见的ST谱系归并为其他STs。类似地，将较少出现的cgMLST变异型归类为其他cgMLST类型。通过嵌套方法分析BAPS1亚群或单倍型中ST谱系的相对频率，以考察ST之间的祖先关系。评估ST谱系中区分耐药位点的相对频率，以鉴定与血清型Newport群体结构相关的独特附属基因组特征。结果表明，血清型纽波特菌群祖先性获得了MDFA和AAC6IAA位点，而ST45被预测为多重耐药。与ST45相比，其他主要ST谱系（如ST5和ST118）更可能对多种药物敏感。此外，采用基于系统发育的锚定可视化方法，系统地整合了分层群体结构数据。该分析方案为大规模挖掘细菌种群数据提供了基础。它不仅能够利用ProkEvo对基因型进行大规模的定位与追踪，还可进一步扩展以回答其他问题，例如探究代谢通路和毒力因子在基因型信息中的分布情况。也就是说，我们可以预测与特定目标基因型相关的表型特征。本文所述方案无疑为研究人员探索群体基因组学领域的新问题铺平了道路，并可推断致病性及非致病性细菌物种的进化与生态模式。

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细菌种群中分层基因型和辅助基因组位点的启发式挖掘

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