人诱导多能干细胞及其神经和神经胶质衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

我们的协议为科学家提供了一个强大的工具，可以在单细胞水平上结合来自人类IPS及其神经和透明衍生物的多个微参数。该协议允许使用流式细胞术在总水平和每线粒体体积的特定水平上调整线粒体参数。该技术可应用于多种细胞类型，包括来自其他神经退行性疾病的细胞类型。

因此，它可以帮助深入了解这些疾病类型背后的机制，并可能有助于治疗筛查。首先，将细胞分别接种到六孔板中的四个孔中，并将细胞孵育直到达到50%至60%的汇合度。在培养期结束时，制备五种单独的染色溶液，其中包含培养基、FCCP、TMRE、MTG 和水户袜铺的不同组合。

将它们添加到相应的孔中，并按照手稿中的说明孵育细胞。接下来，从所有孔中吸出培养基并用PBS洗涤。对于细胞分离，将细胞与一毫升细胞解离试剂在 37 摄氏度下孵育五分钟。

用一毫升DMEM中和细胞解离试剂，补充有10%FBS。然后将孔内容物收集在15毫升的编年史管中。通过离心沉淀细胞，并用PBS洗涤细胞沉淀一次或两次。

吸出所有上清液，在管中留下约100微升。将细胞沉淀重新悬浮在300微升PBS中。将细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中后，在室温下将管保持在黑暗中。

使用流式细胞仪和文本手稿中描述的带通滤光片设置分析细胞。使用细胞解离试剂分离大约 100 万个细胞并沉淀细胞，如前所述。用DMEM加10%FBS中和细胞悬液，并将悬浮液收集在15毫升管中。

用一毫升1.6%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟。用一毫升冰冷的90%甲醇在零下20摄氏度下渗透代谢细胞20分钟。然后将样品封闭在一毫升封闭缓冲液中，并通过用PBS离心洗涤细胞，如图所示。

为了检测不同的线粒体复合物和亚基，将细胞与文本手稿中描述的相应一抗孵育 30 分钟。用PBS洗涤细胞一次后，将细胞与二抗孵育30分钟。在孵育结束时，如图所示洗涤并重新悬浮细胞和PBS。

将细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中，在冰上避光保存。接下来，分析流式细胞仪上的细胞并检测信号并使用5 30/30带通滤光片过滤一个。对于每个细胞亚群，选择一个直方图并分析不同滤光通道的中位荧光强度或MFI。

计算TMRE水平，MMP ROS复合亚基和TFAM的具体值，如文本手稿中所述。流式细胞术和活细胞用于研究MMP线粒体体积和ROS水平。在POLG DA神经元中，观察到较低的特异性MMP和较高的特异性ROS，而线粒体体积，总MMP和ROS没有变化。

POLG星形胶质细胞MMP降低，但线粒体体积和ROS没有变化。采用流式细胞术和固定细胞研究MRC复合物亚基和TFAM水平。DA神经元与对照组相比，复合物1和TFAM增加，但复合物2水平无变化。

POLG星形胶质细胞显示出复合物一四和特异性TFAM的减少。由于细胞密度也会影响MMP以及MTG和MMP荧光之间的关系，因此这是细胞特异性的。使该协议适应其他细胞类型可能需要优化 在此过程之后，可以进行基于显微镜的asis，例如共聚焦显微镜，提供线粒体结构的其他细节。

因此，虽然该策略检测来自已知线粒体疾病的DA神经元和星形胶质细胞中的线粒体功能障碍，但这些技术也可以应用于探索任何类型的细胞和疾病的线粒体功能。