细胞膜亲和色谱柱鉴定与固定化托肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物
2022年1月19日
该协议描述了用含有功能性跨膜滋养肌球蛋白激酶受体B蛋白的固定化细胞膜片段制备细胞膜亲和色谱（CMAC）柱。还解释了使用CMAC色谱柱鉴定与这些受体相互作用并存在于复杂天然混合物中的特化植物代谢物。
该垂直是组装具有功能性跨膜受体的细胞膜亲和色谱柱的重要步骤。这些色谱柱可用于鉴定复杂提取物中存在的小分子，并与固定的跨膜受体相互作用。细胞膜亲和色谱柱可加快复杂混合物中存在的生物活性化合物的鉴定。
对于那些对鉴定复杂天然基质中存在的药理活性化合物（例如植物，真菌或细菌提取物）感兴趣的人，使用细胞膜亲和色谱柱可能特别感兴趣。首先，通过将120个苯甲脒溶解在五毫升超纯去离子水中来制备200毫摩尔苯甲脒储备溶液。通过将0.017克PMSF溶解在通风橱中的10毫升乙醇中来制备10毫摩尔PMSF储备溶液。
通过将市售蛋白酶抑制剂混合物溶解在一毫升超纯去离子水中来制备100X蛋白酶抑制剂鸡尾酒。充分混合并等分试样200至300微升鸡尾酒。通过将55.114毫克ATP二钠盐水合物溶解在一毫升电离超纯水中来制备100毫摩尔ATP储备溶液。
充分混合并等分100微升混合物。将3.03克三盐酸钾、2.9克氯化钠、0.22克无水氯化钙、0.2克氯化镁六水合物和0.19克氯化钾溶于500毫升超纯去离子水中制备缓冲液。通过将17.3毫升Tris缓冲液与0.3毫升苯甲脒储备溶液，0.2毫升PMSF储备溶液，0.2毫升蛋白酶抑制剂混合物，20微升ATP储备溶液，2毫升甘油和0.029克EDTA混合，制备均质缓冲液。
使用盐酸溶液将pH调节至7.4。以400×g的摄取温度将4摄氏度收获的细胞旋转5分钟，除去上清液，并用10毫升1X pH 7.4冰冷PBS洗涤剩余的细胞沉淀。弃去上清液，加入20毫升匀浆缓冲液。
将锥形管放在冰上。将细胞悬浮液转移到40毫升的Dounce均质机组织研磨机中，使用40个上下杵行程在冰上手动均质悬浮液。将均质化的细胞悬浮液转移到50毫升锥形管中，丢弃沉淀并将上清液转移到新的锥形管中。
保存细胞膜沉淀并丢弃上清液。通过将8.7毫升缓冲溶液与0.1毫升PMSF储备溶液，0.15毫升苯甲脒储备溶液，0.1毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒，10微升ATP储备溶液，1毫升甘油和0.2克胆酸钠混合来制备增溶缓冲液。将增溶缓冲液转移到具有细胞膜片段的锥形管中。
然后重悬颗粒。将得到的混合物以150 RPM在4摄氏度下旋转18小时。18小时后，将增溶混合物在4摄氏度下以47， 900×g离心30分钟。
添加 100 毫克 IAM。个人电脑。DD2颗粒向上清液中，并将所得悬浮液混合物在4摄氏度下以150 RPM旋转一小时。加入24克Tris-HCl，23.4克氯化钠，0.06克氯化钙，5.85克EDTA和0.07克PMSF，在4升超纯去离子水中制备透析缓冲液。
首先将PMSF溶解在少量乙醇中，然后用缓冲液缓慢加入烧杯中。切10厘米的纤维素膜透析管，准备透析管，并转移含有IAM的悬浮液。个人电脑。DD2颗粒和细胞膜片段进入透析管。
用透析管夹关闭透析管的两端。将透析管置于透析缓冲液中。24小时后，将透析管放入新鲜制备的透析缓冲液中，继续透析24小时。
准备10毫摩尔pH 7.4乙酸铵缓冲液，用于清洗IAM。个人电脑。DD2颗粒和柱状表征实验通过将0.778克乙酸铵溶解在一升超纯去离子水中。透析48小时后，从透析缓冲液中取出透析管，并将透析管的内容物转移到15毫升锥形管中。
弃去上清液，用10毫升乙酸铵缓冲液洗涤剩余的沉淀三次。第三次洗涤后，将剩余的沉淀重悬于一毫升乙酸铵缓冲液中。将其彻底混合，并使用所得浆料包装5 x 20玻璃柱以产生CMAC色谱柱。
要包装色谱柱，请将先前用乙酸铵缓冲液浸泡的底部过滤器放入过滤器支架中。将过滤器支架安装在玻璃柱中，并拧紧色谱柱盖以确保支架的位置。将色谱柱垂直放在手指夹中，并将其固定在实验室支架中。
将烧杯放在塔下方，用单通道移液器将移液器尖端固定在玻璃柱壁上，将少量浆料缓慢转移到玻璃柱中。为了加快填料过程，请在每步骤之间用微量移液管从固定床上方取出缓冲液。放置顶部过滤器并拧紧适配器单元，以便在固定相位上方没有剩余的缓冲器。
使用适配器锁固定适配器单元的位置。将色谱柱连接到高效液相色谱泵，并用乙酸铵缓冲液洗涤色谱柱过夜，将流速设置为每分钟0.2毫升。为了延长储存时间，请在醋酸铵缓冲液中用0.05%叠氮化钠溶液运行色谱柱，在使用叠氮化钠时戴上实验室外套，安全眼镜和手套，并在四摄氏度下储存。
个人电脑。DD2颗粒具有固定化的神经母细胞瘤TrkB细胞膜片段，并且在BDNF的存在下产生荧光颗粒。在TrkB空细胞膜封装的IAM颗粒中或不使用BDNF时未观察到荧光，如在TrkB细胞膜封装的IAM颗粒中。显示功能CMAC柱典型的额叶亲和色谱图，其增加7，8-DHF浓度为1毫摩尔，750纳摩尔，500纳摩尔和300纳摩尔，以固定化的TrkB受体，其显示保留时间的浓度依赖性变化。
无功能的CMAC柱显示标记配体保留缺乏浓度依赖性变化。通过固定细胞膜片段制备CMAC阴性对照柱，不表达靶向蛋白以排除非特异性相互作用。添加0.2%水性积雪草提取物导致7，8-DHF保留率显着降低，表明激动剂结合位点存在竞争配体。
CMAC阴性TrkB空柱上缺乏7，8-DHF保留的减少进一步证实了该柱上缺乏功能性TrkB受体。缺失的峰色谱方法鉴定出一种化合物强烈保留在TrkB柱上，同时在TrkB空柱上早期洗脱，表明特定的相互作用。了解您的快速细胞膜亲和色谱柱的受体来源至关重要。
请务必查看文献，以正确设计均质化和增溶缓冲液。该方案制备的细胞膜亲和色谱柱用于鉴定新的潜在药物命中，并表征固定化受体与其天然配体之间相互作用的性质。
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概述
本协议概述了具有功能性跨膜受体的细胞膜亲和层析（CMAC）柱的制备。这些柱子有助于识别与固定受体相互作用的复杂提取物中的小分子。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 药理学
背景
- 细胞膜亲和层析是一种用于分离生物活性化合物的技术。
- 它特别适用于研究复杂的天然混合物。
- 跨膜受体在细胞信号传导中起着至关重要的作用。
- 理解受体相互作用可以导致新的药理活性化合物的发现。
研究目的
- 为研究跨膜受体准备CMAC柱。
- 识别与这些受体相互作用的特殊植物代谢产物。
- 提高在复杂混合物中识别生物活性化合物的效率。
使用的方法
- 制备苯胺啶和PMSF母液。
- 组装固定受体的CMAC柱。
- 应用CMAC筛选复杂天然提取物。
- 分析代谢产物与受体之间的相互作用。
主要结果
- 成功制备了具有功能性受体的CMAC柱。
- 识别与受体相互作用的小分子。
- 展示了该技术在分析复杂混合物中的效率。
- 对已识别化合物的药理学潜力有了深入了解。
结论
- CMAC是研究受体-配体相互作用的有效方法。
- 该技术可以加速新的生物活性化合物的发现。
- 在药理学和天然产物研究中的进一步应用前景广阔。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cellular membrane affinity chromatography (CMAC) columns with immobilized TrkB receptors enable direct identification of bioactive small molecules from complex natural extracts, streamlining early-stage drug discovery. This targeted approach enhances predictive confidence in ligand-receptor interactions and supports rapid triage of candidate compounds for nervous system disorder portfolios. Integrating CMAC into discovery workflows reduces time and resource investment compared to traditional isolation and screening methods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ligand binding to functional transmembrane targets in a native-like environment.
- Supports biological de-risking by confirming specific interactions with TrkB, a validated nervous system target.
- Facilitates rapid identification of natural product leads for further mechanistic evaluation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated receptor-based columns for reproducible screening of complex mixtures.
- Delivers quantitative retention data to distinguish specific versus nonspecific binding events.
- Enables scalable, platform-ready workflows for compound evaluation and hit prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery outputs with disease-relevant TrkB signaling pathways for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with confirmed target engagement profiles.
- Provides mechanistic insight into ligand-receptor specificity for preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
CMAC columns fit at the interface of early discovery and lead identification, bridging extraction-based hit finding with functional target validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing by confirming direct ligand-receptor interactions in complex matrices.
- Screening: Offers reproducible, quantitative retention measurements for robust compound triage.
- Analytics: Provides chromatographic and fluorescence-based outputs to compare binding affinities and specificities.
- Translational Research: Connects natural product screening to disease-relevant TrkB modulation for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse target classes and extract sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes receptor-ligand screening and enhances reproducibility across batches.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital allocation in early portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of natural product leads for nervous system indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein biochemistry and chromatography techniques.
- Needs access to HPLC systems and fluorescence detection for column characterization.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer and receptor source selection.
- Adaptation may be needed for different receptor classes or extract types.
- Column functionality depends on maintaining native receptor conformation and activity.
