Name: 细胞膜亲和色谱柱鉴定与固定化托肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学习细胞膜亲和色谱柱制备技术，用于鉴定与固定化TrkB受体相互作用的植物代谢物。该方法可加速从复杂天然提取物中发现具有药理活性的生物活性化合物。

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Z.C.A. 受土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）2219 国际博士后研究奖学金项目资助。本研究的资助来自美国国立卫生研究院国家补充与综合医学中心，资助编号为 1R41AT011716-01。本工作还部分得到了美国药学科学学会研究启动基金以及 Regis Technologies 向 L.C. 提供的基金支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞（TrkB 和 TrkB-NULL（亲代）细胞系）的细胞培养
注意：细胞系（SH-SY5Y 细胞系 (TrkB, BR6) 和 SH-SY5Y 亲本细胞系 (TrkB NULL))49,50 购自 Kerafast。培养的细胞用作固定化跨膜受体的来源，以制备 CMAC 柱。以下步骤描述了如何获得细胞膜片段并组装功能性的 CMAC 柱。
<ol>
	<li>在150 mm细胞培养皿中，于37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养细胞，培养基为RPMI培养基450 mL、胎牛血清50 mL、青霉素/链霉素溶液5 mL和遗传霉素（G418）0.3 mg/mL混合配制而成。</li>
</ol>
2. 细胞收获
<ol>
	<li>使用显微镜确认细胞汇合度（80%-90%），该状态通常在细胞传代后3-4天达到。</li>
	<li>吸除细胞上方的培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，1×，pH 7.4）洗涤细胞两次。去除PBS后，加入2 mL低浓度胰蛋白酶（0.25%）以解离细胞。</li>
	<li>轻轻摇晃培养皿，使胰蛋白酶溶液均匀覆盖所有细胞，并在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育约2分钟。加入8 mL细胞培养基终止消化，将解离的细胞转移至50 mL锥形管中，并置于冰上。</li>
	<li>使用血细胞计数板估算细胞数量（约3 × 107个细胞）。通过反复吹打混匀细胞悬液，确保细胞分布均匀。取10 µL细胞悬液滴加于盖玻片下，使用40×物镜在显微镜下计数细胞。</li>
</ol>
3. 细胞匀浆
<ol>
	<li>配制以下蛋白酶抑制剂的储备液：苯甲脒（200 mM）、苯甲基磺酰氟（PMSF，10 mM）以及市售的蛋白酶抑制剂混合液（100倍浓度），其中包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）、抑肽酶（aprotinin）、亮抑蛋白酶肽（bestatin）和亮肽素（leupeptin）。 
	注意：PMSF仅可在通风橱内操作。
	<ol>
		<li>通过将120 mg苯甲脒溶解于5 mL超纯去离子水中，配制苯甲脒储备液（200 mM）。4 °C保存，并在一天内使用。建议每次使用前新鲜配制。</li>
		<li>通过将0.017 g PMSF溶解于10 mL乙醇中，配制PMSF储备液（10 mM）。-20 °C保存。</li>
		<li>将市售的蛋白酶抑制剂混合物溶解于1 mL超纯去离子水中，配制蛋白酶抑制剂混合液（100倍浓度）。充分混匀后，分装200–300 µL至若干小管，-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将55.114 mg三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP disodium salt hydrate）溶解于1 mL去离子超纯水中，配制ATP储备液（100 mM）。充分混匀后，分装100 µL至若干小管，-20 °C保存备用。</li>
	<li>在500 mL超纯去离子水中溶解以下成分以配制缓冲液：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，50 mM）3.03 g、氯化钠（NaCl，100 mM）2.9 g、无水氯化钙（CaCl2，3 mM）0.22 g、六水合氯化镁（MgCl2，2 mM）0.2 g，以及氯化钾（KCl，5 mM）0.19 g。</li>
	<li>取步骤3.3中配制的缓冲液17.3 mL，加入苯甲脒储备液0.3 mL（终浓度3 mM）、PMSF储备液0.2 mL（终浓度0.1 mM）、蛋白酶抑制剂混合液0.2 mL、ATP储备液20 µL（终浓度100 µM）、甘油2 mL（终浓度10%）以及EDTA 0.029 g（终浓度5 mM），混匀后配制成匀浆缓冲液（表1）。用盐酸溶液调节pH至7.4。</li>
	<li>将步骤2.3中收集的细胞在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用10 mL预冷的PBS缓冲液（1×，pH 7.4）洗涤细胞沉淀。再次在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入20 mL步骤3.4中配制的匀浆缓冲液重悬细胞沉淀。将锥形管置于冰上。</li>
	<li>将细胞悬液转移至40 mL Dounce匀浆器中，并将匀浆器置于冰上。在冰上手动进行40次上下研磨（使用研杵），完成匀浆。将匀浆后的细胞悬液转移至50 mL锥形管中。</li>
	<li>将匀浆液在4 °C、400 × g条件下离心7分钟。弃去沉淀，将上清液转移至新的锥形管中，并在4 °C、47900 × g条件下离心30分钟。保留细胞膜沉淀，弃去上清液。</li>
</ol>
4. 细胞膜增溶
<ol>
	<li>通过将第 3.3 步配制的缓冲液 8.7 mL 与 0.1 mL（0.1 mM）PMSF 储存液、0.15 mL（3 mM）苯甲脒储存液、0.1 mL 蛋白酶抑制剂混合液、10 µL（100 µM）ATP 储存液、1 mL（10%）甘油以及 0.2 g（2%）胆酸钠混合，制备溶解缓冲液（表 2）。</li>
	<li>将溶解缓冲液加入含有第 3.8 步获得的细胞膜碎片的锥形管中，重悬沉淀。将所得混合物在 4 °C、150 rpm 条件下旋转孵育 18 小时。 
	&#8203;注意：此时实验可暂停，过夜溶解细胞膜沉淀。</li>
</ol>
5. 细胞膜在 IAM.PC.DD2 颗粒上的固定化
<ol>
	<li>18 小时后，在 4 °C 条件下以 47900 × g 离心溶解混合物 30 分钟。</li>
	<li>保留上清液，弃去沉淀。向上清液中加入 100 mg IAM.PC.DD2 颗粒，涡旋混匀，并在 4 °C、150 rpm 条件下旋转孵育所得悬浮液 1 小时。</li>
	<li>为促进细胞膜片段在 IAM.PC.DD2 颗粒上的固定化，按以下步骤进行透析：
	<ol>
		<li>在 4 L 超纯去离子水中加入 24 g 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，50 mM）、23.4 g 氯化钠（NaCl，100 mM）、0.06 g 氯化钙（CaCl2，0.1 mM）、5.85 g 乙二胺四乙酸（EDTA，5 mM）和 0.07 g 苯甲基磺酰氟（PMSF，0.1 mM；表 3），配制透析缓冲液。 
		&#8203;注意：PMSF 不溶于水，因此需先用少量乙醇溶解，再缓慢加入盛有缓冲液的烧杯中。</li>
		<li>用盐酸溶液调节 pH 至 7.4。将缓冲液置于 4 °C 至少 1 小时，然后再进行透析步骤。</li>
		<li>取 10 cm 长的纤维素透析管（10 K 截留分子量，35 mm）剪裁成段，将含有 IAM.PC.DD2 颗粒和细胞膜片段的悬浮液转移至透析管中。使用透析管夹封闭透析管两端。</li>
		<li>将装有 IAM.PC.DD2 固定相的透析管放入透析缓冲液中，在 4 °C 轻柔搅拌条件下透析 24 小时。</li>
		<li>24 小时后，将透析管转移至新配制的透析缓冲液中，继续透析 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. CMAC 层析柱装填
<ol>
	<li>配制醋酸铵缓冲液（10 mM，pH 7.4），用于清洗 IAM.PC.DD2 颗粒及柱特性分析实验：将 0.7708 g 醋酸铵溶解于 1 L 超纯去离子水中，用盐酸溶液调节 pH 至 7.4。</li>
	<li>透析 48 小时后，从透析缓冲液中取出透析袋，并将袋内内容物转移至 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 10 mL 醋酸铵缓冲液将剩余沉淀洗涤三次，每次洗涤后均在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>第三次洗涤后，将剩余沉淀重悬于 1 mL 醋酸铵缓冲液中，充分混匀，所得浆液用于填充 5/20 玻璃柱，制备 CMAC 色谱柱。</li>
	<li>填充色谱柱时，首先将预先用醋酸铵缓冲液浸泡过的底部滤片放入滤片架中，将滤片架装入玻璃柱内，并拧紧柱帽以固定滤片架位置。将色谱柱垂直置于手指夹中，并固定在实验架上，在柱下方放置一个烧杯。</li>
	<li>使用单通道移液器将步骤 6.4 中获得的少量浆液转移至玻璃柱中。缓慢倾倒，使移液器吸头紧贴玻璃柱内壁。待填充材料沉降后再加入下一份浆液。</li>
	<li>为加快填充过程，每次加入浆液并沉降后，用微量移液器吸除固定床层上方的缓冲液。重复上述步骤，直至填入 1 mL 浆液。</li>
	<li>放置顶部滤片并拧紧适配器单元，确保固定相上方无残留缓冲液，如图 1所示。使用适配器锁固定适配器单元的位置。</li>
	<li>将色谱柱连接至高效液相色谱（HPLC）泵，设定流速为 0.2 mL/min，用醋酸铵缓冲液过夜洗涤色谱柱。此时色谱柱已准备好进行表征步骤。使用前将色谱柱保存于 4 °C。 
	注意：若需长期储存（超过一周未使用），应用含 0.05% 叠氮化钠的醋酸铵缓冲液冲洗色谱柱，并于 4 °C 保存。 
	&#8203;警告：叠氮化钠经口摄入或经皮肤吸收时具有高毒性，仅可在通风橱中操作。处理叠氮化钠时务必穿戴实验服、护目镜和手套（推荐使用腈类手套）。</li>
</ol>
7. CMAC 柱的表征
<ol>
	<li>共聚焦显微镜与BDNF结合
	<ol>
		<li>按照步骤1至步骤6.4的说明，制备固定有分别来自过表达TrkB的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和SH-SY5Y TrkB-NULL细胞的细胞膜片段的IAM.PCC.DD2固定相颗粒。</li>
		<li>对于在抗体染色前需与BDNF孵育的样品，通过将10 μg BDNF溶解于100 μL超纯去离子水中来制备BDNF储备液。将溶液储存于-20 °C。
		<ol>
			<li>分别取100 μL固定有过表达TrkB的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的IAM.PC.DD2柱填料和100 μL固定有SH-SY5Y TrkB-NULL细胞的IAM.PC.DD2柱填料，悬浮于乙酸铵缓冲液中，转移至不同的1.5 mL微量离心管中。</li>
			<li>向每根管中加入390 μL乙酸铵缓冲液、10 μL BDNF储备液以及0.5 μL ATP储备液（按步骤3.2制备），在室温下轻轻振荡孵育1小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于在抗体染色前不与BDNF孵育的样品，将100 μL悬浮于乙酸铵缓冲液中的固定有过表达TrkB的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的IAM.PC.DD2柱填料转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>向每根管中加入400 μL乙酸铵缓冲液和0.5 μL ATP储备液（按步骤3.2制备），在室温下轻轻振荡孵育1小时。</li>
		<li>将步骤7.1.2和7.1.4中制备的样品在4 °C、10,000 x g条件下离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>用500 μL乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀10分钟，再次在4 °C、10,000 x g条件下离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>向每份沉淀中加入220 μL乙酸铵缓冲液、25 μL 10%正常山羊血清和5 μL一抗抗BDNF抗体，在4 °C冷室中轻轻振荡过夜孵育。</li>
		<li>孵育完成后，在4 °C、10,000 x g条件下离心混合物1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>用含1%温和去污剂（例如胆酸钠）的乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀3次，每次10分钟，在4 °C、10,000 x g条件下每次离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>通过混合900 μL乙酸铵缓冲液、100 μL 10%正常山羊血清和1 μL荧光素标记的二抗（1:1,000稀释）制备二抗溶液。向步骤7.1.9中获得的每份沉淀加入300 μL二抗溶液，在4 °C轻轻振荡过夜孵育。</li>
		<li>在4 °C、10,000 x g条件下离心混合物1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>用含1%温和去污剂（例如胆酸钠）的乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀3次，每次10分钟，在4 °C、10,000 x g条件下每次离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>将所得沉淀重悬于50 μL乙酸铵缓冲液中。取每种混合物20 μL滴加至载玻片上，加盖盖玻片。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜对固定有细胞膜片段的IAM.PC.DD2颗粒进行成像，激发波长为488 nm，发射波长为520 nm，采用固态激光系统。使用数值孔径（NA）为0.75、工作距离（WD）为0.35 mm的20倍物镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以7,8-DHF为标记配体的前沿亲和色谱
	<ol>
		<li>将CMAC柱连接至配备二极管阵列检测器和/或质谱仪的高效液相色谱（HPLC）系统。</li>
		<li>在含有5%甲醇的乙酸铵缓冲液中配制500 mL浓度为1 mM的7,8-DHF溶液。</li>
		<li>以0.4 mL/min流速在室温下将标记配体（1 mM）恒定浓度溶液泵入CMAC柱。使用二极管阵列检测器（DAD，波长254 nm）或质谱仪（采用单离子监测模式；负离子化模式下m/z 253）监测洗脱曲线。</li>
		<li>运行结束后，用乙酸铵缓冲液冲洗柱子过夜。</li>
		<li>使用不同浓度的标记配体（750 nM、500 nM、300 nM）重复步骤7.2.2至7.2.4，每次运行后均过夜冲洗柱子。采用前沿亲和色谱法计算配体的Kd值，具体方法详见其他文献综述24,51。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Centella asiatica&#160;（L.）Urb.（积雪草，又称gotu kola）提取物进行置换研究
	<ol>
		<li>在含有5%甲醇和0.2%水相积雪草提取物（10 mg/mL）的乙酸铵缓冲液中配制500 mL浓度为500 nM的7,8-DHF溶液。</li>
		<li>以0.4 mL/min流速在室温下将含提取物的标记配体（500 nM）恒定浓度溶液泵入柱中。使用DAD检测器（波长254 nm）或质谱仪（采用单离子监测模式；负离子化模式下m/z 253）监测洗脱曲线。</li>
		<li>运行结束后，用乙酸铵缓冲液冲洗柱子过夜。</li>
		<li>绘制500 nM 7,8-DHF的洗脱曲线以及加入积雪草提取物后所得的洗脱曲线，以观察标记配体是否发生置换。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 采用色谱峰缺失法从积雪草提取物中鉴定潜在的 TrkB 结合物
<ol>
	<li>使用CMAC柱对积雪草提取物进行分级
	<ol>
		<li>将CMAC TrkB柱和TrkB-NULL柱分别连接至高效液相色谱（HPLC）系统，每根柱子分别注入50 μL积雪草水提物（10 mg/mL）。以0.4 mL/min的流速在室温下用含5%甲醇的乙酸铵缓冲液（10 mM，pH 7.4）冲洗色谱柱。</li>
		<li>分别从CMAC TrkB柱和TrkB-NULL柱收集洗脱组分，时间段如下：0–5 min、5–10 min、10–15 min、15–20 min、20–25 min、25–30 min、30–35 min、35–40 min、40–45 min、45–50 min、50–55 min、55–60 min。</li>
		<li>将收集到的组分冷冻并冻干。在进行超高效液相色谱-质谱分析前，将冻干组分重新溶解于50 μL甲醇中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>积雪草CMAC组分的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析
	<ol>
		<li>使用与超高效液相色谱（UPLC）系统联用的质谱仪对8.1.3步骤中获得的所有组分进行分析（采用UPLC-MSE分析模式）。使用C18色谱柱（2.1 × 50 mm，1.7 µm）并配备C18 VanGuard保护柱（2.1 mm × 5 mm，1.7 µm）进行分析。</li>
		<li>采用以下梯度洗脱程序，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速为0.3 mL/min：0.0 min时为99% A和1% B，1.5 min时为84% A和16% B，5.0 min时为80% A和20% B，7.0 min时为75% A和25% B，10.0 min时为65% A和35% B，20.0–24.0 min时为1% A和99% B，25.0–29.0 min时为99% A和1% B。</li>
		<li>每个样品的进样体积设为3 µL。在高分辨正离子和负离子模式下进行MSE分析，低能量碰撞电压设为4 V，高能量碰撞电压设为20–35 V。</li>
		<li>正离子化模式下采用以下电喷雾电离（ESI）源参数：毛细管电压1.5 kV，采样锥电压40 V，源偏移量80，源温度100 °C，脱溶剂温度350 °C，锥气体流速38.0 L/h，脱溶剂气体流速400 L/h。</li>
		<li>负离子化模式下采用以下电喷雾电离（ESI）源参数：毛细管电压1.45 kV，采样锥电压40 V，源偏移量80，源温度110 °C，脱溶剂温度300 °C，锥气体流速50.0 L/h，脱溶剂气体流速652 L/h。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Lukasz Ciesla 与 IAM.PC.DD2 颗粒的供应商 Regis Technologies 合作。

在复杂的特化代谢物混合物中鉴定活性化合物是一项极具挑战性的任务23。传统方法通常先分离单个化合物，再通过不同的检测方法测试其活性。该方法耗时长、成本高，且常常导致仅分离和鉴定出丰度最高且已被充分表征的化合物23。&#160;目前常用的高通量筛选方法主要依赖于对组合化学文库进行筛选，并针对已知靶点设计，难以用于鉴定和分离复杂混合物中存在的生物活性化合物53。
CMAC 可用于鉴定靶向 TMPs 的化合物23,24,54。该技术将含有 TMPs 的细胞膜片段固定在 IAM 固定相颗粒表面23,24。CMAC 是一种独特的方法，可将含有靶蛋白的细...

植物混合物富含药理活性化合物1，是发现新药物候选物和先导化合物的良好来源2,3,4,5.&#160;从天然产物中发现新药物一直是一种卓有成效的方法，许多目前获批的药物都源于最初在自然界中发现的化合物。天然化合物的化学多样性难以被人工合成的分子库所匹敌。许多天然化合物能够与人类蛋白质靶点相互作用并调节其功能，可被视为在进化过程中优化而成的类药物分子6这些天然化合物特别适用于神经系统疾病药物先导化合物的筛选。6目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗阿尔茨海默病（AD）的两种药物来源于天然生物碱，分别为加兰他敏和利斯的明（毒扁豆碱的衍生物）。6左旋多巴（L-DOPA）是目前治疗帕金森病最常处方的药物，最初是从蚕豆中分离得到的Vicia faba L.)7. 溴隐亭和利舒脲是多巴胺受体激动剂，为寄生真菌天然麦角生物碱的衍生物 Claviceps purpurea8利血平，一种从印度蛇根草（Rauwolfia serpentina）中分离得到的生物碱，Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz)&#160;是最早问世的抗精神病药物之一9近年来，免疫反应失调和全身性炎症已被证实与多种神经系统疾病的发生有关，例如重度抑郁症或神经退行性疾病。10植物性饮食结合其他生活方式干预措施已被发现可改善老年人的认知和功能能力11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21某些属于三萜类和多酚类的亲电分子被发现可在体内外调节炎症反应 体外 和 体内 模型12例如，含有α,β-不饱和羰基（如姜黄素、肉桂醛）或异硫氰酸酯基团（如莱菔硫烷）的天然化合物可干扰Toll样受体4（TLR4）的二聚化，从而抑制小鼠白细胞介素-3依赖性早B细胞系中促炎性细胞因子的下游合成12,22流行病学证据强烈表明，存在于复杂食物基质中的膳食植物化学物质也可能成为新药研发的有效来源6.
鉴定植物提取物（包括植物性食品）中具有生物活性的分子时，面临的主要障碍之一是待研究样品的复杂性。传统方法通常先将单个化合物分离、纯化，再逐一测试其生物活性。这种方法通常只能鉴定出含量最丰富且已被充分表征的化合物。在没有明确分子靶点的情况下，基于表型的药物发现策略依赖于对复杂混合物进行生物活性导向的分级分离23。在此方法中，先将提取物分级为复杂度较低的亚组分，再对这些亚组分进行表型检测。活性化合物的分离与纯化过程由检测中确认的生物活性进行指导。若已知特定药物靶点的身份，可显著加快复杂混合物中药理活性化合物的鉴定进程。这类方法通常基于将分子靶点（例如酶）固定在固相载体（如磁珠）表面23。固定化的靶点随后用于筛选实验，从而分离出能与靶点相互作用的化合物。尽管该方法已被广泛用于鉴定作用于胞质蛋白的化合物，但在鉴定与跨膜蛋白（TMPs）相互作用的化学物质方面的应用则相对较少23。跨膜蛋白固定化过程中的另一个挑战在于，其蛋白活性依赖于与细胞膜磷脂以及双分子层中其他分子（如胆固醇）的相互作用23,24。因此，在尝试固定跨膜靶点时，必须保持蛋白与其天然磷脂双分子层环境之间的细微相互作用。
在细胞膜亲和色谱法（CMAC）中，细胞膜片段（而非纯化的蛋白质）通过吸附作用固定在人工膜（IAM）固定相颗粒的表面23。IAM固定相是通过将磷脂酰胆碱类似物共价键合到硅胶上制备而成。近年来，已开发出新型的IAM固定相，其游离氨基和硅醇基团经过末端封闭处理（即IAM.PC.DD2颗粒）。在CMAC柱的制备过程中，细胞膜片段通过吸附作用固定在IAM颗粒的表面。
CMAC 柱迄今已被用于固定化多种不同类型的跨膜蛋白（TMP），包括离子通道（例如烟碱型受体）、G蛋白偶联受体（GPCR，例如阿片受体）、转运蛋白（例如P-糖蛋白）等24。这些固定化的蛋白质靶标已被应用于小分子配体与靶标相互作用的药效动力学表征（例如解离常数 Kd）或结合动力学（kon 和 koff）的测定，同时也用于在复杂基质中鉴定潜在新药先导化合物的过程24。本文中，我们介绍了固定化原肌球蛋白激酶受体B（TrkB）的CMAC柱的制备方法，TrkB 已成为多种神经系统疾病药物发现中一个可行的靶标。
先前的研究表明，脑源性神经营养因子（BDNF）/TrkB 通路的激活与某些神经系统疾病的改善相关，例如阿尔茨海默病（AD）或重度抑郁症25,26,27,28据报道，AD 中 BDNF 水平及其受体 TrkB 的表达均下降，类似的减少也在 AD 动物模型中损害了海马功能29. 报道显示，AD 患者血清和脑组织中的 BDNF 水平降低30,31,32Tau 蛋白的过表达或过度磷酸化在原代神经元及阿尔茨海默病动物模型中被发现可下调 BDNF 的表达33,34,35此外，有报道称BDNF对β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性具有保护作用 体外 和 体内36将BDNF直接注入大鼠脑内可改善认知功能受损动物的学习与记忆能力37BDNF/TrkB 已成为改善包括阿尔茨海默病（AD）在内的神经及精神疾病的有效靶点28,38靶向BDNF/TrkB信号通路以开发阿尔茨海默病（AD）的治疗策略，有望加深我们对该疾病的理解39不幸的是，由于BDNF本身药代动力学特性差且具有不良副作用，因此无法作为治疗手段使用40TrkB/BDNF 通路的小分子激活剂已被探索作为潜在的 TrkB 配体41,42,43在已测试的小分子激动剂中，7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）已被证实可激活 BDNF/TrkB 通路41,44,45,46一种7,8-DHF衍生物（R13；4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7,8-二基双(甲基氨基甲酸酯)）目前正在被评估作为阿尔茨海默病（AD）的潜在药物47最近研究表明，多种抗抑郁药通过直接与TrkB结合并促进BDNF信号传导而发挥作用，这进一步强调了将TrkB作为治疗多种神经系统疾病有效靶点的重要性48.
本方案描述了组装功能性TrkB柱和TrkB-NULL阴性对照柱的过程。使用已知的天然产物小分子配体7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）对这些色谱柱进行表征。此外，我们以植物提取物为例，描述了筛选复杂基质以鉴定与TrkB相互作用化合物的过程。

<table><tbody><tr><td>7-8 二羟基黄酮水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td><td>&amp;ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>BDNF 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 &amp;mu;L</td><td>一抗；浓度为 2 mg/mL</td></tr><tr><td>盐酸苄脒水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>人源脑源性神经营养因子 (BDNF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 &amp;mu;g</td><td>重组型，大肠杆菌表达，冻干粉末，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠盐</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>杜恩斯匀浆器 (Dounce homogenizer)</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL，总长 285 mm，32 x 140 mm (外径 x 高)</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 mL</td><td>经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>G418 硫酸双盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 mL</td><td>50 mg/mL 溶于 H2O，0.1 &amp;mu;m 过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR Life Science</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>固定化人工膜 (IAM.PC.DD2)</td><td>Regis Technologies, Inc.</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9244-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Nikon</td><td></td><td>共聚焦激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>正常山羊血清 (10%)</td><td>Life Technologies</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>K812-500 mL</td><td>1x</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>VWR Life Science Ambreso</td><td>M221-1 mL</td><td>蛋白质组学级，含 50 mM AEBSF、30 &amp;micro;M 抑肽酶、1 mM 亮抑蛋白酶肽、1 mM E-64 和 1 mM 亮抑蛋白酶肽</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td><td>含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>二抗 山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>表达 Trk-B 的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞系</td><td>Kerafast</td><td>ECP007</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Trk-NULL 细胞系</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>蛇皮透析管</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K 截留分子量，干燥内径 35 mm</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>BDH9286-2.5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tricorn 5/20 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 mL</td><td>0.25%，经无菌过滤，适用于细胞培养，含 2.5 g 猪胰蛋白酶和 0.2&amp;nbsp;g EDTA</td></tr></tbody></table>

用于鉴定与固定化原肌球蛋白激酶受体b相互作用的特化植物代谢物的细胞膜亲和色谱柱

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

植物、真菌、细菌和海洋无脊椎动物合成的化学物质一直是新药发现和先导化合物的重要来源。临床上常用的他汀类药物、青霉素、紫杉醇、雷帕霉素和青蒿素等药物，最初均是从天然产物中鉴定并分离得到的。然而，从天然来源中鉴定和分离具有生物活性的特化代谢物是一个具有挑战性且耗时的过程。传统方法通常是在生物量提取后，从复杂的混合物中逐一分离和纯化单个代谢物，随后通过功能检测来验证这些分离分子的生物活性。本文介绍了使用细胞膜亲和色谱（CMAC）柱直接从复杂混合物中鉴定生物活性化合物的方法。CMAC柱能够鉴定与固定在天然磷脂双分子层环境中的功能性跨膜蛋白（TMP）相互作用的化合物。这是一种靶向策略，要求研究者事先明确希望用新发现的小分子候选药物进行调控的跨膜蛋白靶点。在本实验方案中，我们介绍了一种制备固定化原肌球蛋白激酶受体B（TrkB）的CMAC柱的方法，TrkB已被认为是多种神经系统疾病药物发现的可行靶点。本文提供了详细的实验步骤，介绍如何利用过表达TrkB受体的神经母细胞瘤细胞系构建固定化TrkB受体的CMAC柱，并进一步阐述了评估该色谱柱功能性的方法，以及将其应用于鉴定与TrkB受体相互作用的植物特化代谢物的策略。

根据实验方案，组装了两根CMAC色谱柱：一根装填了过表达TrkB的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞膜片段，另一根装填了SH-SY5Y TrkB-NULL细胞膜片段。正确组装的CMAC色谱柱如图1所示，细胞膜片段固定化的具体步骤如图2所示。
由于此前尚未尝试将 TrkB 受体固定在 IAM.PC.DD2 色谱固定相上，因此通过抗体染色和使用标记配体 7,8-DHF 的前沿亲和色谱法验证了受体成功固定。抗体染色实验的示意图见图2。采用优化后的方案，将来源于过表达 TrkB 受体的神经母细胞瘤细胞系的细胞膜片段以及来源于不表达 TrkB 受体（TrkB-NULL）的亲本细胞系的细胞膜片段固定在 IAM.PC.DD2 颗粒上。随后，将固定有细胞膜片段的颗粒与 BDNF（生理配体）孵育，再与一抗及荧光标记的二抗孵育（图2）。结果显示，固定有神经母细胞瘤 Tr...

本方案描述了细胞膜亲和色谱（CMAC）柱的制备方法，其中固定化了含有功能性跨膜原肌球蛋白激酶受体B蛋白的细胞膜片段。同时阐述了CMAC柱在鉴定复杂天然混合物中与这些受体相互作用的特化植物代谢物中的应用。

用于鉴定与固定化原肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物的细胞膜亲和色谱柱

植物、真菌、细菌和海洋无脊椎动物合成的化学物质一直是新药发现和先导化合物的重要来源。他汀类药物等药物，……

本视频展示了组装具有功能性跨膜受体的细胞膜亲和层析柱的关键步骤。此类层析柱可用于鉴定复杂提取物中与固定化跨膜受体相互作用的小分子。细胞膜亲和层析柱可加速从复杂混合物中鉴定生物活性化合物的过程。细胞膜亲和色谱柱的使用对于致力于鉴定复杂天然基质（如植物、真菌或细菌提取物）中具有药理活性化合物的研究者而言具有特殊意义。首先，通过将120毫克的苯甲脒溶解于5毫升超纯去离子水中，配制200毫摩尔的苯甲脒储备液。在通风橱中，将0.017克PMSF溶解于10毫升乙醇中，配制10毫摩尔的PMSF储备液。通过将市售的蛋白酶抑制剂混合物溶解于1毫升超纯去离子水中，配制100倍蛋白酶抑制剂混合液。充分混匀后，分装成200至300微升的等份。通过将55.114毫克三磷酸腺苷二钠盐水合物溶解于1毫升去离子超纯水中，配制100毫摩尔的ATP储存液。充分混匀后，取100微升该混合液进行分装。通过将3.03克Tris-HCl、2.9克氯化钠、0.22克无水氯化钙、0.2克六水合氯化镁以及0.19克氯化钾溶解于500毫升超纯去离子水中，制备缓冲液。通过将17.3毫升Tris缓冲液与0.3毫升苯甲脒储备液、0.2毫升PMSF储备液、0.2毫升蛋白酶抑制剂混合液、20微升ATP储备液、2毫升甘油以及0.029克EDTA混合，制备匀浆缓冲液。使用盐酸溶液将 pH 调至 7.4。在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，并用 10 毫升预冷的 1× PBS（pH 7.4）洗涤剩余的细胞沉淀。弃去上清液，加入 20 毫升匀浆缓冲液。将锥形管置于冰上。将细胞悬液转移至40毫升Dounce玻璃匀浆器中，在冰上手动匀浆，使用研杵上下研磨40次。将匀浆后的细胞悬液转移至50毫升锥形管中，弃去沉淀，将上清液转移至新的锥形管中。保存细胞膜沉淀，弃去上清液。通过将8.7毫升缓冲液与0.1毫升PMSF储备液、0.15毫升苯甲脒储备溶液、0.1毫升蛋白酶抑制剂混合物、10微升ATP储备溶液、1毫升甘油和0.2克胆酸钠混合，制备溶解缓冲液。将溶解缓冲液转移至含有细胞膜碎片的锥形管中。重悬沉淀。将所得混合物在4°C、150 RPM条件下旋转孵育18小时。18小时后，在4°C、47,900 × g条件下离心溶解混合物30分钟。向上清液中加入 100 毫克 IAM. PC.DD2 颗粒，在 4°C 条件下以 150 转/分钟旋转孵育一小时。在 4 升超纯去离子水中加入 24 克 Tris-HCl、23.4 克氯化钠、0.06 克氯化钙、5.85 克 EDTA 和 0.07 克 PMSF，配制透析缓冲液。先将 PMSF 溶于少量乙醇中，然后缓慢加入含有缓冲液的烧杯中。剪取 10 厘米长的纤维素透析膜以制备透析管，将含有 IAM 的悬浮液、PC.DD2 颗粒和细胞膜碎片转移至透析管中。用透析管夹将透析管两端封闭。将透析管放入透析缓冲液中。24小时后，将透析管转移至新配制的透析缓冲液中，继续透析24小时。通过将0.778克乙酸铵溶解于1升超纯去离子水中，制备用于洗涤IAM.PC.DD2颗粒以及柱表征实验的10毫摩尔、pH 7.4的乙酸铵缓冲液。透析48小时后，从透析缓冲液中取出透析管，并将透析管内的内容物转移至15毫升锥形管中。弃去上清液，再用10毫升醋酸铵缓冲液将剩余沉淀洗涤三次。第三次洗涤后，将剩余沉淀重悬于1毫升醋酸铵缓冲液中。充分混匀，并将所得悬液用于填充5 × 20玻璃柱，制备CMAC层析柱。装柱时，将预先用醋酸铵缓冲液浸泡过的底部滤膜放入滤膜架中。将滤膜架安装到玻璃柱中，并拧紧柱帽以固定滤膜架的位置。将色谱柱垂直放置于手指夹中，并固定在实验架上。将一个烧杯置于柱子下方，用单通道移液器将少量浆液缓慢转移至玻璃柱中，移液时将移液器吸头紧贴玻璃柱管壁。为加快装柱过程，可在每步操作间隙用微量移液器吸除固定相床面上方的缓冲液。放置上端滤膜，并拧紧适配器单元，确保固定相上方无残留缓冲液。使用适配器锁固定适配单元的位置。将色谱柱连接至高效液相色谱泵，并用乙酸铵缓冲液以每分钟0.2毫升的流速冲洗色谱柱过夜。对于长期保存，使用含0.05%叠氮化钠的乙酸铵缓冲液冲洗色谱柱，在操作叠氮化钠时需穿戴实验服、护目镜和手套，并在4°C下保存。IAM。将固定有神经母细胞瘤 TrkB 细胞膜片段并在存在 BDNF 的情况下孵育的 PC.DD2 颗粒产生了荧光信号。而在包裹 TrkB 缺失细胞膜的 IAM 颗粒中，或在未添加 BDNF 的 TrkB 细胞膜包裹的 IAM 颗粒中，均未观察到荧光。图中显示了功能化 CMAC 柱对固定化 TrkB 受体进行前缘亲和色谱分析的典型图谱，依次上样 7,8-DHF 的浓度分别为 1 毫摩尔、750 纳摩尔、500 纳摩尔和 300 纳摩尔，结果显示保留时间随浓度增加而发生依赖性变化。一个无功能的CMAC柱显示出标记配体的保留无浓度依赖性变化。通过固定不表达靶蛋白的细胞膜片段，制备了CMAC阴性对照柱，以排除非特异性相互作用。加入0.2%的积雪草水提取物后，7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）的保留显著降低，表明存在与激动剂结合位点竞争的配体。7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）在CMAC阴性TrkB空柱上的保留未发生减少，进一步证实该柱上无功能性TrkB受体。缺失峰色谱法鉴定出一种在TrkB柱上强保留、而在TrkB空柱上较早洗脱的化合物，表明其存在特异性相互作用。了解用于快速细胞膜亲和色谱柱的受体来源至关重要。务必查阅相关文献以正确设计匀浆和溶解缓冲液。本方案中制备的细胞膜亲和层析柱可用于鉴定新的潜在药物候选分子，并表征固定化受体与其天然配体之间相互作用的性质。

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