Name: 使用水凝胶图案化技术控制细胞粘附，用于牵引力显微镜的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学习利用近紫外光刻技术制备微图案化水凝胶，用于牵引力显微镜测量细胞力学行为。该方法通过光诱导释放单细胞，实现同一样本的高通量测量，提升细胞牵引力检测效率。

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感谢Rebecca Alvarado女士在协议视频制作过程中的支持，以及Stephen Casale先生对稿件提出的建设性意见。感谢马克斯·普朗克医学研究所细胞生物物理学系的同事们给予的有益讨论。同时，我们衷心感谢马克斯·普朗克学会为E.A.C.-A.提供的经费支持，以及德国研究基金会（DFG SFB1129，项目编号240245660，E.A.C.-A.获得P15资助，U.S.S.获得P4资助；DFG EXC 2082/1-390761711资助U.S.S.）。J.B.感谢卡尔·蔡司基金会提供的经费支持。E.A.C.-A.、C.S.和U.S.S.感谢由德国联邦教育与研究部（BMBF）支持的马克斯·普朗克“物质构建生命”研究生院提供的资助。C.S.由欧洲研究理事会（整合基金PHOTOMECH，编号101001797）提供资助。

1. 甲基丙烯酸酯化盖玻片的制备
注意：玻璃盖玻片经过甲基丙烯酸化处理，以共价连接光交联水凝胶，从而防止其在与细胞共孵育过程中发生脱落。使用显微镜用玻璃盖玻片以获得高质量的成像效果。
<ol>
	<li>准备 300 mL 溶液时，取一个洁净的 400 mL 玻璃烧杯，并将其置于通风橱内。</li>
	<li>使用血清移液管向烧杯中加入 10 mL 双蒸水（ddH2O）、18.75 mL 乙酸（≥99.8% 分析纯，p.a.）、18.75 mL 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯以及 252.5 mL 乙醇（≥99.8% 分析纯，p.a.）。将混合溶液倒入结晶皿中。</li>
	<li>使用精密擦拭纸清洁 24 mm 圆形玻璃盖玻片，并将盖玻片放入定制的聚四氟乙烯支架中。</li>
	<li>将支架浸入溶液中，在室温（RT）下孵育 15 分钟。</li>
	<li>取出支架，用乙醇（99.8% 分析纯，p.a.）冲洗所有盖玻片，并在气流下干燥。 
	注意：甲基丙烯酸化盖玻片可在室温下保存长达 1 个月。</li>
</ol>
2. 在玻璃盖玻片上对外基质蛋白进行微图形化
注意：首先用一层包含蛋白质和抗细胞黏附分子的涂层处理玻璃盖玻片。随后通过光刻图案化技术去除该涂层，从而允许在微图案化区域中沉积细胞外基质蛋白。
<ol>
	<li>取一个15 mm圆形玻璃盖玻片，将其放置于培养皿中。使用金刚石笔在盖玻片上表面做标记。随后进行清洗步骤 通过 在0.4 mbar和200 W条件下进行2分钟的氧气等离子体处理。</li>
	<li>移液器 100 µL 在每个盖玻片表面加入0.01%聚-L-赖氨酸溶液，室温孵育30分钟。用10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH 8.5洗涤盖玻片。去除多余液体，但保持表面湿润。</li>
	<li>移液器 100 µL 在每张盖玻片表面加入50 mg/mL聚乙二醇甲醚琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA）的10 mM HEPES（pH 8.5）溶液。室温孵育1小时。用10 mM HEPES（pH 8.5）缓冲液冲洗盖玻片，并在气流下吹干。</li>
	<li>添加 2 µL 紫外光敏感型光引发剂（例如 PLPP-gel）后接 40 µL 将乙醇（≥99.8% p.a.）滴加到表面。为使凝胶和乙醇在表面均匀分布，轻轻前后倾斜培养皿。静置5 min，使溶液聚合。</li>
	<li>将一个盖玻片置于底部带有20 mm通孔的35 mm培养皿内。此设计可使来自下方的激光束直接照射到玻璃表面。</li>
	<li>打开显微镜和光图案化模块（仅在经过激光安全官员的安全培训后方可操作该设备）。在20倍空气物镜下校准紫外A激光。将含有光引发剂的样品放置于载物台上。调节焦距至玻璃表面，并开启焦距控制。加载并锁定预先绘制的图案。
	<ol>
		<li>使用 Inkscape 等图形软件制备图案。确保图案文件不超过 DMD 的尺寸（1824 x 1140 像素，对应 552 x 325 µm 在20倍物镜下（0.28 µm/px)). 
		注意：建议使用DMD尺寸（1824 × 1140像素）作为图案文件的尺寸，以确保图案化过程中无误差。例如，不要制作尺寸为1830 × 1130像素的图案文件。</li>
		<li>为将图案转移至聚丙烯酰胺凝胶，确保图案化范围仅限于从玻璃中心至边缘半径的60%–70%。</li>
		<li>用于单个细胞图案化时，采用直径为50-100 µm 距离为 100 µm 在模式之间以及直径为150-300 µm 对于一个细胞群体，合适的图案尺寸在很大程度上取决于典型的细胞大小，且必须足够大以允许细胞黏附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以30 mJ/mm的紫外剂量开始图案化2图案化所需时间取决于图案的数量。生成单个图案大约需要1秒。</li>
	<li>完成图案化步骤后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗表面三次。将样品与 100 µL 的 25 µg/mL 纤连蛋白溶于1x PBS中 25 µg/mL 在 PBS 中加入纤维蛋白原 Alexa488 偶联物，室温孵育 1 小时。对于其他细胞外基质蛋白，需确定能够完全覆盖图案化区域的最适浓度。</li>
	<li>用1×PBS冲洗表面三次。确保图案化玻璃立即用于玻璃-PA转移。在水凝胶制备过程中，将图案化玻璃保存在室温的PBS中。</li>
</ol>
3. 制备图案化聚丙烯酰胺水凝胶
注意：制备聚丙烯酰胺水凝胶时，加入氧化的N-羟乙基丙烯酰胺（HEA），以在表面呈现反应性醛基，用于基质蛋白的共价结合。此外，采用双层结构方法，仅在水凝胶的上层嵌入荧光微球，以改善牵引力显微镜实验中微球位移的记录效果。
<ol>
	<li>将甲基丙烯酸化处理的玻璃盖玻片放入培养皿中。</li>
	<li>为配制新鲜的氧化HEA溶液，向一个15 mL离心管中加入9.55 mL双蒸水，然后加入0.5 mL HEA和42 mg高碘酸钠，最终得到10 mL溶液。在避光条件下持续搅拌该溶液4小时。</li>
	<li>根据表1将丙烯酰胺、双丙烯酰胺和双蒸水混合，配制成10 mL储备液水凝胶（操作需在通风橱中进行，单体具有神经毒性）。脱气后盖紧瓶盖，确保密封。
	 
	注意：该储备液可分装保存，在4 °C条件下最长可保存1年。使用前务必表征水凝胶的杨氏模量。</li>
	<li>制备双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶（操作需在通风橱中进行，单体具有神经毒性）。
	<ol>
		<li>首先配制底层：在1.5 mL离心管中轻轻混合99.3 µL储备液、0.5 µL 1%过硫酸铵（APS）和0.2 µL四甲基乙二胺（TEMED）。从中取出10 µL溶液，用移液器逐滴加至甲基丙烯酸化盖玻片的中心位置。</li>
		<li>小心地将一个15 mm圆形盖玻片覆盖在液滴上，静置45分钟使其聚合。随后用手术刀轻轻剥离上层盖玻片。</li>
		<li>配制上层：在1.5 mL离心管中轻轻混合93.3 µL储备液与1 µL新鲜氧化的HEA溶液、5 µL荧光微球（对应每平方微米三个200 nm大小的微球）、0.5 µL 1% APS和0.2 µL TEMED。从中取出5 µL溶液，用移液器逐滴加至已聚合的底层中心位置。</li>
		<li>将带有微图案的盖玻片轻轻覆盖在液滴上，在室温下静置45分钟使液滴聚合。确保图案面与液滴接触。随后用手术刀轻轻剥离盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用双组分硅胶将24 mm盖玻片粘附至自行打孔的6孔板底部。5分钟后向孔中加入PBS。</li>
	<li>通过原子力显微镜（AFM）表征聚丙烯酰胺水凝胶样品的杨氏模量。
	<ol>
		<li>将球形探针悬臂梁安装至AFM探头座上。</li>
		<li>在硬质基底（如玻璃或云母）上获取力-距离曲线（设定值为3–4 V），校准每个悬臂梁：外推悬臂梁灵敏度，从表面撤回，并进行热调谐以获得其弹簧常数。</li>
		<li>将校准后的悬臂梁置于水凝胶样品上方，在PBS缓冲液中获取力曲线，参数设置如下：力设定值为20–30 nN，接近与撤回速度为5或10 µm/s，斜坡大小为5 µm。
		 
		注意：使用配备空气40倍物镜和绿色荧光蛋白（GFP）滤光片的倒置光学显微镜，用于观察并定位PA水凝胶样品中的细胞外基质（ECM）微图案区域。</li>
		<li>使用AFM分析软件绘制所获取的力-距离曲线。</li>
		<li>确定接触点，并将力-距离曲线转换为力-压痕曲线。</li>
		<li>采用赫兹模型（或根据探针几何形状选择合适的力学模型），在泊松比介于0.2至0.5之间时，对曲线的压痕部分进行拟合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过紫外A激光照射实现细胞牵引力的局部释放（LUVI-TFM）
注意：使用紫外A（UV-A）激光释放水凝胶特定区域中细胞所受的牵引力。该UV-A激光（例如，波长λ = 375 nm的固体激光器，&lt;15 mW）属于3B类激光。未屏蔽的激光束对眼睛有害，通常也对皮肤有害。反射光和散射光辐射也可能具有危险性。此外，紫外辐射可能引发皮肤癌。只有在接受过激光安全官员的安全培训后，才允许操作此类设备。
<ol>
	<li>吸去孔板中的 PBS。</li>
	<li>在生长培养基中，每6孔板接种 3 × 106 个细胞。对于成纤维细胞，使用含 L-谷氨酰胺的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素。将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。开始显微镜观察前，洗涤样品以去除未贴壁的悬浮细胞。</li>
	<li>开启显微镜培养箱和气体供应，调节至 37 °C 温度和 5% CO2 的环境。</li>
	<li>开启显微镜和激光图案化模块。如有必要，使用 Leonardo 软件在 20 倍空气物镜下重新校准紫外 A（UV-A）激光。将定制的含样品的 6 孔板放置于载物台上，调整焦距至光敏剂（PA）表面。</li>
	<li>设置照明图案并标记目标细胞。重新对焦至水凝胶表面。在明场通道下采集细胞图像。切换至 Cy5 通道（远红滤光片，650 nm 激发，670 nm 发射），采集处于变形状态下的微珠图像。</li>
	<li>切换至激光通道。开启激光照射 3 分钟。在本实验系统中，此过程对应的光剂量为 6,000 mJ/mm2。</li>
	<li>切换回 Cy5 通道，采集微珠在未变形状态下的图像。 
	注意：对于使用小鼠胚胎成纤维细胞的实验，需在光照后等待 15 分钟再记录参考图像（即未变形状态图像）（参见代表性结果部分）。其他类型细胞的等待时间可能有所不同。对其他目标细胞重复步骤 4.5–4.7。</li>
	<li>为检测 UV-A 照射后升高的氧化应激水平，可使用市售试剂 CellRox。CellRox 在还原状态下无荧光，当被活性氧氧化后，其荧光发射峰约为 665 nm。</li>
	<li>根据试剂说明书，将 5 µM 的试剂加入成像培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。随后用预热的 1× PBS 洗涤细胞 3 次，并更换成像培养基。在相同光照条件下，通过荧光成像记录 UV-A 照射前后 Cy5 信号的变化。</li>
</ol>
5. 图像处理、粒子图像测速及牵引力计算
注意：细胞牵引力通过分析荧光微珠的位移来记录，并利用基于粒子图像测速技术的图像分析工具进行计算。
<ol>
	<li>打开荧光微球图像，使用 Fiji 软件分别查看激光处理前（即变形状态）和处理后（即未变形状态）的图像。将两幅图像合并为一个图像栈（stack）图像 | 图像序列 | 待叠加的图像).</li>
	<li>使用 StackReg 插件（P. Thévenaz，洛桑瑞士联邦理工学院）校正两幅图像间的横向漂移。将图像更改为 8 位（图像 | 类型 | 8 位）并重新缩放至 1024 x 1024 像素（图像 | 比例尺）。将图像序列保存为 TIFF 格式，参考图像始终位于序列开头。</li>
	<li>使用互相关技术获取位移矢量场19 来自 OpenPIV 项目中实现的 PIV 场
	<ol>
		<li>确保松弛（未变形）图像和变形图像均被覆盖以指定尺寸的搜索窗口 wR 和 wD 以像素为单位。对于每个搜索窗口，使用以下公式定义互相关函数： 
		<img alt="静态相关方程，ΣΣ(R(i,j)-R̄)(D(i+r,j+s)-D̄)，用于研究分析的数学公式" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		此处，R(i,j) 和 D(i,j) 表示将两幅图像截取至选定的搜索窗口后，再进行镜像填充的强度场。 <img alt="静力学平衡分析中平均半径公式 \( \overline{R} \) 的物理方程。" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 和 <img alt="统计计算中的平均值符号，\(\overline{D}\)。" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"> 描述其平均值。窗口大小选择为 wR = 32 和 wD = 32，相邻搜索窗口之间使用70%的重叠率。</li>
		<li>为每个搜索窗口确定一个位移矢量 <img alt="向量表示法，方程 \(\vec{u}=(r,s)^T\)，数学图示，线性代数概念" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"> 通过在最大值区域周围使用高斯拟合来优化互相关函数，并将其分配给搜索窗口的中心位置，从而实现亚像素精度20.</li>
		<li>查找并移除模糊的位移矢量。当互相关函数的两个最高局部极大值之间的比值低于1.5阈值时，对应搜索窗口的位移矢量被视为模糊位移矢量21.</li>
		<li>丢弃在残差阈值为1.5时未通过归一化中值检验的位移矢量22.</li>
		<li>（可选）通过减去一个固定向量来校正剩余的侧向漂移 <img alt="带箭头的变量 \( \vec{u_0} \)，表示物理方程中的初速度。" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 5"> 从所有位移中减去该值。这样做的原因是，远离细胞的选定区域中的位移趋近于零。</li>
		<li>使用三次多项式插值，将得到的位移矢量场重采样至输入图像每 4 像素间距的规则网格。缺失的数据点通过平滑的双变量样条外推法进行填充。以像素为单位的位移矢量可通过图像的像素比例转换为局部形变0.33 µm/px 用于20倍空气镜。</li>
		<li>（可选）对图像进行镜像填充，以减少后续分析中的振铃伪影。</li>
		<li>将变形场乘以一个Tukey窗函数，以消除由于漂移校正引起的边缘效应，参数为0.2–0.3。本实验关注的是位于视场中心的微图案区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用正则化傅里叶变换牵引力显微术（FTTC）重建牵引力18作为正则化方法，我们采用最简单且合理的选项，即0。th 二阶 Tikhonov（L2）正则化23,24,25选择一个最优的正则化参数 λ，使其最小化由广义交叉验证（GCV）函数定义的值。26: 
	<img alt="用于统计模型评估的广义交叉验证（GCV）方程。" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 6"> 
	这里 τλ 是一个堆叠向量，包含给定条件下重建牵引场的 x 和 y 分量 λ 对于所有傅里叶采样模式，G 是将牵引力场映射到其对应位移场的线性算子，其定义与傅里叶变换牵引力显微镜（FTTC）中的定义一致。求和遍历矢量分量。 ui 是所有傅里叶采样模式下位移场的x和y分量。GCV在病态逆问题领域被广泛使用，是TFM中常用L曲线准则的良好替代方法。采用Lanzcos滤波器以减少由于频率空间有限和位移场上采样所引入的伪影。牵引力的计算依赖于PA的杨氏模量（例如，11.3 kPa）和泊松比（例如，PA的泊松比根据交联剂浓度在0.2至0.5范围内变化）。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了含有荧光微珠的微图案化聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的制备方法，这些荧光微珠作为牵引力显微镜（TFM）研究中的基准标记。我们的方法包括三个步骤：1）双层PA水凝胶的制备；2）细胞外基质（ECM）蛋白的微图案化及其向水凝胶表面的转移；3）利用近紫外光图案进行TFM分析。用于分析细胞对基底牵引力的实验装置需要使用已知刚度值的线弹性材料，以计算与荧光微珠位移相关的力26。PA水凝胶易于制备，其刚度可轻松调节，常用于刚度感知和TFM研究18,28。然而，为了获得可重复的聚合时间以及整个水凝胶的均匀聚合，需注意试剂的储存条件和储存时间，例如过硫酸铵（APS）应保存在干燥器中以避免失活；四甲基乙二胺（TEMED）应避免直接光照。使用氧化的2-羟乙基丙烯酸酯（HEA）可实现基质蛋白在水凝胶表面的共价结合，这可能有助于形成完整且稳定的蛋白层。每次制备PA水凝胶时都应新鲜配制氧化HEA溶液。双层PA水凝胶具有三个主要优势：1）它提供了一种可重复地在水凝胶表面附近实现基准微珠均匀分布的替代方法，而无需将凝胶做得极薄（即&lt;20 µm）。对水凝胶厚度的控制对于在TFM中获得准确测量结果至关重要。当弹性基底过薄时，强黏附细胞（如成纤维细胞）可能会感知并机械响应其下方刚性玻璃基底的影响29,30。较厚的水凝胶则会使力重建所需的图像采集更加困难。此外，考虑到用于固定水凝胶的玻璃基底所增加的厚度，许多显微镜可能没有足够的空间容纳过厚的样品，除非使用超薄显微镜载玻片。2）在双层PA水凝胶中，通过精确量取水凝胶溶液和荧光微珠进行简单孵育，即可实现在水凝胶表面附近微珠的均匀分布，而无需使用离心机。高密度微珠在进行粒子图像测速（PIV）分析时具有显著优势，因为它可在无需共聚焦显微镜的情况下提高牵引力的分辨率和信噪比。3）将微珠限制在靠近细胞-材料界面的薄层中，使得不仅可使用共聚焦显微镜，也可使用落射荧光显微镜成像牵引力。在制备水凝胶时，操作者应确保其在进行后续步骤前已牢固黏附于底部玻璃表面。我们建议严格遵循水凝胶各层聚合所需的孵育时间，否则在不损坏水凝胶表面的前提下移除顶部玻璃可能较为困难。
测量弹性性能最常用的技术包括原子力显微镜（AFM）、纳米压痕、拉伸试验和流变仪。然而，纳米压痕会对材料施加极高的应变，可能影响弹性性能的测定。而拉伸试验和流变仪属于宏观测量技术，细胞的相互作用则发生在微观尺度上31,32。AFM能够在生理条件下以较低应变实现微尺度测量。如果实验细节缺失（如压痕力和压痕速度）或记录的数据不足，AFM测量的可靠性可能受到不利影响27。Huth 等人描述了一种从AFM数据中提取杨氏模量的算法，强调保持测量参数的一致性27。该算法可精确且可靠地确定杨氏模量，并已被用于我们的实验中。此外，我们在不同日期制备的样品上测量了大量曲线，获得了非常相似的结果（平均值变异约为1–2 kPa）。这表明我们凝胶的刚度可以被可靠预测。
在本实验方案中，我们使用光图案化模块在玻璃表面创建微图案区域，随后将这些微图案转移至水凝胶表面。本方案中展示的微图案化技术基于DMD（数字微镜器件）的无掩模近紫外光刻技术（λ = 375 nm）7。DMD由芯片上大量微镜组成，每个像素对应一个微镜。计算机中的像素化图案文件通过DMD投射，并利用物镜聚焦到表面。在蛋白质微图案化过程中，聚焦的激光在光引发剂的辅助下切割排斥性聚合物刷。随后，暴露的区域被细胞外基质（ECM）蛋白填充。这种无掩模消融方法在设计新图案方面具有高度灵活性，因为它无需使用光掩模。设计和应用图案非常简便，使用Inkscape等免费软件仅需几分钟即可完成。然而，该方法在短时间内可生成的图案数量和样品通量存在主要局限，因为每次只能对单一基底进行图案化。光图案化模块采用发射数毫瓦功率的近紫外固态激光源。未屏蔽的激光束对眼睛和皮肤具有危险性，反射光和散射光及辐射也可能造成危害。操作时必须在激光安全负责人指导下进行安全培训。使用光图案化模块时，实验方案中最关键的步骤是确保在微图案化和消融过程中激光正确聚焦于表面。图案化过程中紫外光的照射剂量（强度乘以时间）是否一致，取决于激光在表面的聚焦情况。若因聚焦不良导致表面光强过弱，可能导致ECM无法成功转移至水凝胶表面，从而造成细胞无法在水凝胶上附着。
在TFM实验中，对贴壁细胞和定位标记物进行初始成像后，需通过胰蛋白酶处理将细胞从PA水凝胶上释放，以记录其松弛状态。执行此步骤的一个缺点是在显微镜载物台上操作样品。若无灌流腔室，打开培养皿盖、吸除培养基、清洗以及加入胰蛋白酶溶液等操作，对于初学者乃至经验丰富的使用者而言均具有挑战性。事实上，这些操作是导致xyz轴方向漂移的主要原因，从而造成位置和焦平面的丢失。我们提出的局部紫外光照射方案使TFM技术对初学者更加友好。需要注意的是，我们使用了一种市售的基于显微镜的无掩模光图案化模块，但原则上任何UV-A照明系统均可使用，必要时可结合掩模以保护基底上不需要记录细胞牵引力的区域。使用较大量短波长可见光（例如激发DAPI发射的紫光）照射细胞会增加氧化应激，可能导致光毒性及细胞死亡。因此，该技术即使在无紫外激光模块的落射荧光显微镜上也可应用。然而，由于光照强度较弱，在此类情况下采用酶处理完成TFM将更为简便。
由于LUVI-TFM能够实现单个细胞或小细胞群的局部脱离，因此可以对同一样本进行多次测量。然而，在选择待脱离细胞时需格外注意，以避免记录到来自邻近细胞的力信号。因此，在无微图案条件下进行单细胞测量时，应避免选择细胞密集区域；对于单个微图案化细胞的测量，微图案的设计应确保各独立结构之间的距离至少为图案化区域直径的两倍。我们还建议不要依次使用相邻图案中的细胞，而应从基底上相距较远的区域进行取样。本实验可在配备焦平面控制功能和40倍空气物镜（NA = 0.9）的落射荧光显微镜上良好实施，该物镜的工作距离足够长，且可在不同孔之间快速、灵活地移动。靶向脱离细胞的方法在牵引力显微镜（TFM）应用中有效，适用于测量单个细胞或整个小型细胞簇（例如，直径达300 µm）的细胞力学。使用我们的装置，我们观察到单个细胞经紫外（UV）处理后出现细胞变圆并脱离的现象（图3A），而小细胞簇则很少发生脱离。这可能导致对细胞牵引力的低估。对于较大的细胞簇，建议采用酶解法进行脱离，因为用户需要使用20倍空气物镜来成像整个细胞簇，且仍需具备焦平面控制功能。由于20倍空气物镜的景深更长，操作时对焦的敏感性低于高倍物镜。用户应确保在细胞消融时正确设置焦平面，因为照射剂量依赖于激光在表面的聚焦状态。尽管我们意识到在细胞群体中使用LUVI-TFM可能存在局限性，例如未处理邻近细胞可能产生的力学相互作用，但这一特性实际上可能有助于研究靶向细胞挤出过程中的力学机制，例如上皮单层中的细胞挤出。
总之，通过将我们的 TFM 方法与光诱导释放微图形化细胞相结合，我们提供了一种稳健且高通量的细胞黏附力测量方案。该方法的多功能性可进一步结合显微镜和成像系统加以利用，以提高分辨率和灵敏度。

贴壁细胞在与胞外环境相互作用时会产生力学力，这些力主要通过整合素介导的黏着斑传递，将细胞外基质（ECM）与肌动蛋白细胞骨架连接起来。黏着斑是由多种蛋白质组成的复合结构，其核心是整合素与纤连蛋白和胶原等ECM蛋白的结合。整合素的聚集以及黏着斑的生长不仅对于形成机械稳定的连接至关重要，而且对于招募其他黏着斑相关蛋白也必不可少，其中包括激活RhoA通路以调控细胞收缩力的蛋白1。RhoA依赖性的肌动蛋白细胞骨架收缩力使细胞能够在下方的ECM上铺展和迁移，并感知基质的刚度2。牵引力的分布高度依赖于细胞的铺展面积和形态，而这两者又受基质特性的影响，从而进一步影响细胞骨架的组织结构，最终在基质力学性质与细胞骨架组织之间形成一个闭合的反馈回路3,4。
表面微图形化技术可通过创建微米尺度的细胞外基质（ECM）黏附蛋白区域，实现对细胞形态的精确控制；根据这些区域的大小，单个细胞或细胞群体可黏附于微图形上5。可在玻璃基底上通过多种方法（如微接触印刷、光图形化或激光图形化）对ECM蛋白进行图案化6。结合抗污策略使用紫外光（λ = 185 或 375 nm）可在靠近表面边缘的区域实现高精度的多种蛋白类型固定，并灵活设计不同的形状和尺寸7,8。采用聚乙二醇（PEG）等抗蛋白吸附化学物质包被的区域，可通过铬掩膜或基于数字微镜器件（DMD）的无掩膜光刻系统进行保护。掩膜中的图形允许紫外光照射将要进行ECM蛋白图案化的区域。在水凝胶表面进行ECM蛋白图案化时，需要一个转移步骤，以将蛋白从玻璃表面转移并交联至目标图案。另一种方法是在软材料上进行图案化：首先将掩膜涂覆抗蛋白吸附层，然后利用深紫外光照烧蚀未被掩膜覆盖的区域。由于深紫外光可产生臭氧并使表面具有反应活性，从而利于蛋白结合，因此未被掩膜覆盖的区域会被ECM蛋白包被，最后凝胶直接在这些暴露区域上聚合9,10。
图案化水凝胶可用于进行牵引力显微镜（TFM）分析，这是一种用于测量细胞与材料界面处细胞作用力的技术11。在二维牵引力显微镜（2D-TFM）中，通常使用较厚聚合物薄膜的平坦表面，其中嵌入了标记微球以追踪形变12,13,14,15。为了提取位移矢量，必须结合两幅图像：一幅为形变状态下的图像，另一幅为无变形的参考图像。随后通过图像处理将这两幅图像相互配准。当标记微球密度较高时，通常采用粒子图像测速法（Particle Image Velocimetry, PIV），这是一种重建流体动力学流动的成熟方法；而在标记微球密度较低或进行三维牵引力显微镜（3D-TFM）分析时，则通常采用粒子追踪测速法（Particle Tracking Velocimetry, PTV），该方法可结合实验数据集的特定特征进行分析。一种计算成本较低的替代方法是光流法，例如Kanade-Lucas-Tomasi（KLT）算法16。对于水凝胶基底，通常在材料聚合过程中高密度地嵌入荧光微球，并在细胞经酶解脱离前后分别采集图像。通过酶解（例如胰蛋白酶消化）使贴壁细胞脱离，会导致水凝胶上所有细胞的牵引力同时释放，从而难以对大量细胞进行详细分析。
本文介绍了一种制备微图案化水凝胶的方案，用于控制细胞形态和定位，以及一种利用紫外光（UV）将单个细胞从基底上分离以连续高效测量牵引力的方法。在牵引力测量方面，我们提出了一种制备双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的技术，其中荧光微球仅嵌入顶层，从而提高其密度并减少垂直分布。结合紫外光介导的细胞牵引力释放与微图案化技术，可在细胞间保持足够间距的前提下，实现对细胞脱离的空间控制（例如，选择性地脱离单个细胞而不影响感兴趣区域内其他细胞的黏附）。随后采用目前最高效且可靠的二维牵引力显微术（2D-TFM）方法——傅里叶变换牵引力显微术（FTTC）结合正则化处理，重建细胞牵引力17,18。

<table><tbody><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>#440159</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>#33209</td><td>Honeywell</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>#1610140</td><td>Bio-Rad</td><td>注意：有毒，需在通风橱中操作</td></tr><tr><td>AFM 悬臂梁</td><td>#CP-CONT-BSG-A-G</td><td>NanoAndMore</td><td>5 &amp;mu;m 球形探针</td></tr><tr><td>AFM 系统</td><td>#NanoWizard3</td><td>JPK</td><td>与配备 40x 空气物镜和 GFP 滤光片的光学显微镜联用</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>#A3678</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td>#1610142</td><td>Bio-Rad</td><td>注意：有毒，需在通风橱中操作</td></tr><tr><td>sCMOS 相机</td><td>#C11440-42U30</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 相机</td><td>#ANDORZYLA4.2</td><td>Oxford Instrument</td><td></td></tr><tr><td>CellRox</td><td>#C10422</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>定制培养箱腔室</td><td></td><td>EMBLEM</td><td></td></tr><tr><td>牙科胶水</td><td>#1300 100</td><td>Picodent</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>#41965</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>#Eclipse Ti2E</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>#Axiovert200</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>#9065.3</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>南美来源胎牛血清（FBS）</td><td>#S181T</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>#F13191</td><td>Invitrogen</td><td>Alexa488 偶联物</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>#F1141</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>200 nm 荧光微球</td><td>#F8805</td><td>Invitrogen</td><td>羧基化（365/415）</td></tr><tr><td>200 nm 荧光微球</td><td>#F8848</td><td>Invitrogen</td><td>羧基化（505/515）</td></tr><tr><td>200 nm 荧光微球</td><td>#F8810</td><td>Invitrogen</td><td>羧基化（580/605）</td></tr><tr><td>200 nm 荧光微球</td><td>#F8807</td><td>Invitrogen</td><td>羧基化（660/680）</td></tr><tr><td>15 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>#41001115</td><td>Assistent</td><td></td></tr><tr><td>24 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>#41001124</td><td>Assistent</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>#MRH08230</td><td>Nikon</td><td>20x 空气物镜，数值孔径 0.45</td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>#CRL-2991</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>#MPEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td></td></tr><tr><td>N-羟乙基丙烯酰胺</td><td>#697931</td><td>Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>#100-E</td><td>TePla</td><td></td></tr><tr><td>PLPP 凝胶</td><td>#PLPPgel</td><td>Alveole</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>#P4823</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>聚(L-赖氨酸)-接枝-聚(乙二醇)</td><td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td><td>SuSoS</td><td></td></tr><tr><td>偏高碘酸钠</td><td>#S1878</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>#17919</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>紫外光刻模块</td><td>#PRIMO</td><td>Alveole</td><td></td></tr><tr><td>UVO 清洗仪</td><td>#342-220</td><td>Jelight</td><td></td></tr></tbody></table>

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

牵引力显微镜（TFM）是力学生物学中用于测量细胞力学的主要方法。该技术通常用于研究黏附在细胞牵引力作用下会发生形变的柔软平面基底上的细胞（二维 TFM）。TFM 依赖于使用线性弹性材料，例如聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚丙烯酰胺（PA）。在 PA 基底上进行二维 TFM 时，获得高通量结果的主要困难源于细胞形态和牵引力的高度变异性，因此需要实现标准化。本文介绍了一种快速高效制备用于二维 TFM 研究的微图案化 PA 水凝胶的实验方案。微图案首先通过无掩模紫外光刻技术利用近紫外光构建，使细胞外基质蛋白仅结合于微图案区域，而表面其余部分对细胞保持非黏附性。细胞外基质蛋白的微图案化依赖于活性醛基的存在，从而形成不同形状的黏附区域，以适应单个细胞或细胞群体的生长。在 TFM 测量中，我们通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的含量来制备具有不同弹性的 PA 水凝胶，并追踪嵌入的荧光微球的位移，利用正则化傅里叶变换牵引力显微技术（FTTC）重建细胞牵引力场。
为了进一步实现对细胞受力的精确记录，我们描述了一种使用可控剂量的图案化光照，在特定区域释放单个细胞或细胞群牵引力的方法。我们将该方法称为局部紫外光照牵引力显微技术（LUVI-TFM）。通过酶处理，所有细胞会同时从样品上脱离；而使用LUVI-TFM，则可以按顺序记录样品不同区域中细胞的牵引力。我们展示了本方案的适用性：（i）用于研究细胞牵引力随其对基底可控黏附的变化关系；（ii）可在同一样品上获得更多的实验观测数据。

PA水凝胶在甲基丙烯酸化玻璃盖玻片上聚合，该盖玻片表面具有可与PA发生共价连接的反应性基团。因此，将水凝胶置于水溶液中时，可防止其从基底上脱落（图1A-D）。为了在水凝胶表面附近获得高密度的标记点，我们开发了一种双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的制备方法。底层不含任何荧光微珠，在甲基丙烯酰化盖玻片上聚合而成；随后，将含有微珠的另一层在底层之上进行聚合（图1E-H），取代了常用于使微珠分布于单一焦平面并增加微珠密度的沉降法。为了在进行牵引力显微镜（TFM）测量时控制细胞形态，我们制备了微图案化PA水凝胶。 通过 从玻璃盖玻片直接转移纤连蛋白图案化微结构至预聚合的PA图1F-F'）。在顶层水凝胶溶液中添加1%非常规交联剂（氧化的HEA），可提供醛基，与纤连蛋白的氨基发生共价结合。
我们制备了厚度约为60 µm的PA水凝胶，并在靠近水凝胶表面的上层固定了荧光微球。这类水凝胶是使用倒置显微镜成像细胞牵引力的合适基底，且厚度足够（已有报道表明进行牵引力显微镜测量的最小厚度为20–30 µm）18，可避免玻璃基底带来的任何影响。通过共聚焦显微镜对荧光微球的位置进行成像（图1I）。为了可视化水凝胶上的蛋白质转移，我们使用了荧光标记的细胞外基质（ECM）蛋白，并通过落射荧光显微镜进行成像（图1J）。我们制备了直径分别为100 µm（左侧）和50 µm（右侧）的纤维连接蛋白微图案圆形区域，以允许细胞群体或单个细胞黏附，如黏附细胞的明场图像与荧光标记的定位微球及纤维连接蛋白微图案的叠加图像所示。在另一样品中，通过间接免疫荧光显微镜验证单个细胞对微图案化纤维连接蛋白的黏附反应，以成像黏着斑蛋白（如paxillin）的定位情况（图1K）。
细胞外基质（ECM）蛋白包被和水凝胶刚度均为细胞黏附的关键参数26。为表征本研究中PA水凝胶的力学性能，我们结合落射荧光显微镜，采用原子力显微镜（AFM）进行纳米压痕实验27。利用我们的实验装置，制备并测试了三种不同刚度的水凝胶基底（图2 和 表1）。使用球形AFM悬臂梁，对无图案化的PA水凝胶以及共轭有Alexa488标记的纤维蛋白原微图案区域进行循环接近与回撤操作，同时记录力-距离曲线。随后，通过接触点评估并应用赫兹（Hertz）模型，估算各样品的杨氏模量（E）。细胞外基质微图案化未改变水凝胶的杨氏模量，其值仍与各无图案化PA水凝胶相当。
为了测量贴壁细胞在基底上施加的牵引力，我们开发了一种基于参考的牵引力显微技术（TFM）实验装置，该装置在配备近紫外激光模块（UV-A 6000 mJ/mm）的宽场落射荧光显微镜上实施。2）以释放细胞牵引力（图 3A）。由于激光束照射可在时间和空间上进行精确控制，因此不仅可以选择性地对单个细胞或细胞簇施加高剂量激光，更重要的是，无需再通过胰蛋白酶等消化酶将细胞从整个样本中分离出来这一具有破坏性的中间步骤。以如此高剂量的激光照射细胞会诱导产生升高的氧化应激，从而导致细胞死亡。图3B）。细胞死亡导致细胞对基质的牵引力释放，这一点由微珠位移所示（如图所示 图3A）。我们将紫外A（UV-A）照射与光图案化模块相结合，以选择性地照射PA水凝胶的微米级区域（图3B-C）。通过这种方法，可以释放微图形化细胞簇的牵引力（图3C，F）或单个细胞（图3B）。重要的是，在我们所采用的时间尺度下，紫外线照射对细胞外基质图案化水凝胶的力学性能没有显著影响（图2C）。氧化应激水平的升高如图所示 图3D，E牵引力通过使用正则化傅里叶变换牵引力显微镜（regularized FTTC）进行重构，正则化参数由广义交叉验证（Generalized Cross Validation, GCV）方法选定。图3B，F）。单个细胞的力释放过程持续约15分钟，LUVI-TFM的结果与基于胰蛋白酶的TFM相当。图 3G-H).
<img alt="聚丙烯酰胺凝胶聚合示意图，APS、TEMED 方法；黏附蛋白图案，显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于牵引力显微镜（TFM）的图案化纤连蛋白基底制备示意图。（A）将底层溶液滴加至甲基丙烯酸化表面。（B）将一块较小的洁净盖玻片小心地置于液滴上。（C）凝胶化时间为 45 分钟。（D）移除上层盖玻片，底层制备完成。（E）将上层溶液滴加至水凝胶上。（F）将图案化盖玻片小心地置于液滴上。（F'）通过无掩模近紫外光刻技术在玻璃表面生成黏附蛋白的微图案，随后将其从玻璃转移至聚丙烯酰胺（PA）水凝胶。黏附蛋白（如纤连蛋白）的游离氨基与PA表面的醛基发生共价结合。（G）凝胶化时间为 45 分钟。（H）移除上层盖玻片，图案化PA水凝胶制备完成。（I）共聚焦xyz显微图像的三维表示，显示表面附近存在高密度的定位标记微珠。（J）荧光标记的纤连蛋白（品红色）在含有嵌入式荧光微珠（绿色）的PA表面的显微图像，并叠加了细胞的明场图像。（K）单个细胞黏附于圆形纤连蛋白微图案（100 µm）的间接免疫荧光显微成像。细胞核（蓝色），paxillin（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原子力显微镜装置示意图、力-压痕曲线、PAA水凝胶上的杨氏模量结果、细胞外基质图案。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：通过原子力显微镜表征样品的力学性能。（A）原子力显微镜纳米压痕实验装置。使用球形悬臂探测经或未经紫外处理的细胞外基质微图案，以及双层聚丙烯酰胺（5% 丙烯酰胺，0.3% 双丙烯酰胺）非图案区域。（B）细胞外基质微图案的典型力-压痕曲线（黑色）。采用赫兹拟合（红色）计算样品的杨氏模量（E）。（C）双层聚丙烯酰胺非图案区域（无细胞外基质）、细胞外基质微图案以及经紫外A照射后的细胞外基质微图案的力学测量结果。柱状图表示均值 ± 标准误（Brown-Forsythe 和 Welch 单因素方差分析检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="UV-A 诱导的细胞形变与恢复；应力-应变图、显微图像、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3．局部 UV-A 照明牵引力显微术（LUVI-TFM）可在大视野内实现局部牵引力测量。（A）局部 UV-A 照明 TFM 示意图。细胞经高剂量 UV-A 激光处理以获取未变形（参考）图像。（B）单个细胞在 UV-A 激光照射前的明场图像。中图：单个细胞在 UV-A 激光照射后的明场图像。右图：单个小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）黏附于纤连蛋白包被的聚丙烯酰胺水凝胶（E = 5.74 kPa）并在直径为 50 µm 的紫外光束（红色虚线）照射下的牵引力图。（C）左图：一群黏附于微图案化纤连蛋白（圆形，直径 100 µm）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的牵引力记录。该细胞群被直径为 200 µm 的紫外光束（红色虚线）照射。右图：一群黏附于微图案化纤连蛋白（圆形，直径 300 µm）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的牵引力记录。该细胞群被直径为 300 µm 的紫外光束（红色虚线）照射。比例尺 = 200 µm。（D,E）通过荧光显微镜检测到高剂量 UV-A 激光照射后 Cy5 信号强度增加，表明细胞内氧化应激水平升高。氧化应激导致细胞死亡。比例尺 = 200 µm。（F）左图：一群黏附于微图案化纤连蛋白（圆形，直径 100 µm）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的应力热图。右图：一群黏附于微图案化纤连蛋白（圆形，直径 300 µm）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的应力热图。（G）黏附于直径 100 µm 纤连蛋白微图案的 MEF 细胞在 UV-A 照射后逐渐释放其牵引力。完全释放发生在 15 分钟后（参考图像在照射后 15 分钟采集）。（H）与传统胰蛋白酶处理 TFM 方法对比，针对黏附于直径 300 µm 纤连蛋白图案的 MEF 细胞。UV-A 照明（6,000 mJ/mm2）后等待 15 分钟的结果与传统胰蛋白酶处理（即 0.05% 胰蛋白酶作用 20 分钟）无显著差异。柱状图显示均值 ± 标准误（双尾 Student's t-检验，****P &lt; 0.0001，* P &lt; 0.05，ns P ≤ 0.5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>丙烯酰胺 (%)</td>
			<td>双丙烯酰胺 (%)</td>
			<td>40% 储液配制的丙烯酰胺 (ml)</td>
			<td>2% 储液配制的双丙烯酰胺 (ml)</td>
			<td>水 (ml)</td>
			<td>杨氏模量 (kPa)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：水凝胶储备溶液混合物及其对应的弹性
所有数据均已存入马克斯·普朗克学会开放获取数据存储库（Edmond），可通过以下地址访问：https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。

牵引力显微镜技术（TFM）是力学生物学领域用于测量细胞力学的主要方法。该技术通常用于研究贴附在平面基底上的细胞……

本实验的总体目标是制备用于二维牵引力显微镜研究的微图案水凝胶。首先制备甲基丙烯酸化玻璃盖玻片，并在其上形成聚丙烯酰胺水凝胶的第一层；第二步是制备另一层含有荧光微珠的水凝胶，用于牵引力显微镜分析。
将带有微图案的盖玻片置于水凝胶上方，使微图案基质蛋白转移到水凝胶表面。接着，将聚丙烯酰胺水凝胶在室温下静置聚合45分钟。然后小心移除上方的盖玻片。
荧光显微成像用于显示微珠的存在以及微图案化细胞外基质蛋白的成功转移。该方法通过光诱导细胞释放，能够高效且精确地测量细胞牵引力，从而可从同一样本中获得更多的实验观测数据。
演示该实验步骤的是我实验室的研究生Joel Christian。向烧杯中加入10毫升双蒸水。随后，向溶液中加入18.75毫升乙酸、18.75毫升3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯以及252.5毫升乙醇。
当溶液配制完成后，将其转移至结晶皿中。取24毫米圆形盖玻片，用精密擦拭纸清洁后放入定制的聚四氟乙烯架中。然后将架子浸入溶液中，孵育15分钟。
取下架子，用乙醇冲洗。在气流下干燥盖玻片。甲基丙烯酸酯化盖玻片可在室温下保存长达一个月。
取一个15毫米的圆形盖玻片，将其放置在培养皿中。使用金刚石笔在盖玻片的上表面做标记。随后通过氧等离子体处理进行清洁。
在0.4毫巴和200瓦条件下处理两分钟，使盖玻片清洁。用移液器将100微升0.01%的多聚-L-赖氨酸溶液滴加到盖玻片表面，在室温下孵育30分钟。随后，用pH为8.5的10毫摩尔HEPES缓冲液洗涤盖玻片。
吸去多余液体，但保持表面湿润。用移液器将100微升浓度为50毫克/毫升的mPEG-SVA溶于10毫摩尔/升、pH 8.5的HEPES溶液中，滴加至盖玻片表面，在室温下孵育1小时。随后，用10毫摩尔/升、pH 8.5的HEPES溶液冲洗盖玻片。
然后在表面加入 2 µL PLPP 凝胶，再加入 40 µL 乙醇。轻轻倾斜培养皿以混匀溶液。静置 5 分钟，使溶液聚合。
将盖玻片放入35毫米底部带孔的培养皿中。将含有盖玻片的培养皿置于显微镜载物台上。调节焦距至玻璃表面。
加载并锁定预先绘制的图案。以30毫焦耳/平方毫米的紫外剂量开始图案化。完成图案化步骤后，取出图案盖玻片，并用PBS冲洗表面。
将样品与100微升含有25微克/毫升纤连蛋白和25微克/毫升Alexa 488标记纤维蛋白原的PBS溶液混合，在室温下孵育1小时。制备水凝胶基质时，首先将甲基丙烯酸酯化盖玻片放入培养皿中。首先，在15毫升Falcon管中加入9.55毫升双蒸水，新鲜配制氧化HEA溶液。
然后向溶液中加入0.5毫升HEA。再向溶液中加入42毫克偏亚硫酸氢钠。将溶液置于摇床中振荡4小时。
然后，根据表1将丙烯酰胺、双丙烯酰胺和双蒸水混合，配制储存液。储存液可在4摄氏度下保存长达一年。通过将99.3微升储存液与0.5微升1%过硫酸铵和0.2微升TEMED混合，配制下层工作液。
从溶液中取 10 微升，用移液器逐滴加到甲基丙烯酸酯化盖玻片上。小心地将一个 15 毫米圆形盖玻片置于液滴上，静置 45 分钟使其聚合。接着，用手术刀小心剥离顶部的盖玻片。
然后，通过将93.3 µL储备液与1 µL氧化的HEA、5 µL荧光微球、0.5 µL 1%过硫酸铵和0.2 µL TEMED混合，制备上层工作溶液。从中取出5 µL溶液，用移液器逐滴加到底层水凝胶上。小心地将微图案盖玻片放置在液滴上。
等待45分钟使其聚合。用解剖刀轻轻剥离盖玻片，并将盖玻片粘附到定制钻孔的六孔板底部。
向孔中加入 PBS。为观察细胞，吸去六孔板中的 PBS。对于成纤维细胞，加入含 L-谷氨酰胺的高糖 DMEM，并补充 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。
将细胞在37摄氏度和5% CO2条件下孵育过夜。打开显微镜载物台的CO2和加热装置。然后开启显微镜，并将培养板放置在载物台上。
设置照明模式并标记感兴趣的细胞。重新对焦至水凝胶表面。在明场通道中采集细胞的图像。
为了获取变形状态下微珠的图像，切换至 Cy5 通道。然后切换至激光通道，并按照指定模式照射细胞三分钟。这相当于 6,000 毫焦每平方毫米的剂量。
然后，切换通道并获取微珠在未变形状态下的图像。为了计算牵引力，打开已校正侧向漂移的荧光微珠图像。牵引力的完整分析详见附带的脚本。
为了验证细胞对水凝胶表面微图案区域的选择性黏附，使用预先标记的基质蛋白进行荧光显微镜成像，并通过宽场显微镜观察细胞。通过混合不同量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺来调节聚丙烯酰胺水凝胶的机械性能。采用原子力显微镜进行纳米压痕实验，评估水凝胶的刚度。
在对聚丙烯酰胺水凝胶中微米尺度区域施加空间和时间上可控的紫外激光束照射后，进行牵引力测量。通过使用正则化傅里叶变换牵引力显微技术（regularized FTTC）重构牵引力，其中正则化参数由广义交叉验证法确定。我们基于牵引力显微镜结合光诱导微图案细胞释放的模块化模型方法具有多功能性，可进一步与其他显微镜和成像系统联用，以提高其分辨率和灵敏度。

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