使用水凝胶图案化技术控制细胞粘附，用于牵引力显微镜的应用

该程序的总体目标是制造用于2D牵引力显微镜研究的微图案水凝胶。这是通过首先制作甲基丙烯酸玻璃盖玻片并在其上形成聚丙烯酰胺水凝胶的第一层来实现的。第二步是创建另一个含有荧光珠的水凝胶层，用于牵引力显微镜检查。

水凝胶夹在上面，上面有一个微图案盖滑，导致微图案基质蛋白在水凝胶表面上的转移。接下来，将聚丙烯酰胺水凝胶留在室温下聚合45分钟。然后小心地取下顶盖衬。

荧光显微镜成像用于显示微珠的存在和微模式细胞外基质蛋白的成功转移。这种方法有助于通过使用光和利用细胞的释放来有效和精确地测量几种牵引力。使得从同一样品中获得更多数量的实验观察结果成为可能。

因此，演示该程序的将是Joel Christian，我实验室的研究生。将10毫升双蒸馏水加入烧杯中。之后，向溶液中加入18.75毫升乙酸，18.75毫升3-丙基甲基丙烯酸酯和252.5毫升乙醇。

溶液完成后，将其转移到结晶皿中。取24毫米圆形盖玻片，用精密擦拭干净，然后放入定制的特氟龙架中。然后将其浸入溶液中并孵育15分钟。

拿起架子，用乙醇冲洗。干燥盖子在气流下滑动。甲基丙烯酸化盖玻片可在室温下储存长达一个月。

拿一个15毫米的圆形盖玻片，把它放在培养皿上。使用钻石笔在盖玻片的上侧做标记。然后通过氧气等离子体处理进行清洁。

盖玻片在 0.4 毫巴和 200 瓦时保持清洁状态，持续两分钟。将100微升0.01%的聚-L-赖氨酸溶液移取到盖子滑移的表面上，并在室温下孵育30分钟。之后，用10毫摩尔的pH值以8.5的pH值清洗盖玻片。

取出多余的液体，但保持表面湿润。将100微升每毫升mPEG-SVA的50微升移液在10毫摩尔pH 8.5溶液中移取到盖子的表面上，并在室温下孵育一小时。之后，用10毫摩尔pH 8.5冲洗盖子。

然后将两微升PLPP凝胶，然后加入40微升乙醇到表面上。轻轻倾斜培养皿以均质溶液。等待五分钟，让溶液两极分化。

将盖玻片放入 35 毫米底孔培养皿内。将装有盖玻片的培养皿放在显微镜载物台上。调整玻璃表面的焦点。

加载并锁定预绘制的图案。通过紫外线剂量开始图案化，每平方毫米30毫焦耳。完成图案化步骤后，取出图案盖滑移并用PBS冲洗表面。

用每毫升25微克纤连蛋白和每毫升25微克纤维蛋白原的100微升混合物孵育样品，并与Alexa 488偶联，在室温下溶解在PBS中一小时。要制备水凝胶底物，首先将甲基丙烯酸盖玻片放入培养皿中。首先，通过将9.55毫升双蒸馏水加入15毫升Falcon管中来制备新鲜的氧化AgA溶液。

然后加入0.5毫升AgA。然后将42毫克偏丙酮酸钠加入溶液中。将溶液放在摇床上四小时。

然后根据表1通过混合丙烯酰胺，双丙烯酰胺和双蒸馏水来制备储备溶液。储备溶液可以在四摄氏度下保存长达一年。通过将99.3微升的储备溶液与0.5微升的1%过硫酸铵和0.2微升的TEMED混合来制备底层的工作溶液。

从溶液中取出10微升，然后滴落移液到甲基丙烯酸盖玻片上。小心地将15毫米圆形盖玻片放在液滴上，等待45分钟使其聚合。接下来，用手术刀拆下顶盖滑。

然后通过将93.3微升的储备溶液与一微升氧化HEA，五微升荧光珠，0.5微升1%的过硫酸铵和0.2微升的TEMED混合来制备顶层的工作溶液。从溶液中取出五微升，并将其滴落到底层水凝胶上。小心地将微图案盖玻片放在液滴上。

等待45分钟，让它聚合。用手术刀轻轻拆下盖玻片。并将盖子滑钉粘在定制的钻孔六孔板的底部。

将 PBS 添加到孔中。要看到细胞，请从六孔板中吸出PBS。对于成纤维细胞，加入含有L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM，并补充10%FPS和1%青霉素和链霉素。

将细胞在37摄氏度和5%CO2下孵育过夜。打开CO2和显微镜载物台的加热装置。然后打开显微镜并将孔板放在载物台上。

设置照明模式并标记感兴趣的单元格。重新聚焦在水凝胶的表面。获取明场通道中细胞的图像。

要拍摄处于变形状态的珠子的图像，请切换到通道。然后切换到激光通道，并根据图案照亮细胞三分钟。这相当于每平方毫米6， 000毫焦耳的剂量。

之后，切换通道并获取处于未变形状态的珠子的图像。要计算牵引力，请打开已针对横向漂移进行校正的荧光珠图像。引力的完整分析详见随附的脚本。

为了验证细胞对水凝胶表面上微图案区域的选择性粘附，使用预标记的基质蛋白用荧光显微镜对样品进行成像，并用明场显微镜观察细胞。聚丙烯酰胺水凝胶的力学性能通过混合不同量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺而改变。通过原子力显微镜的纳米压痕实验评估了水凝胶的刚度。

在应用空间，时间控制的紫外线激光束照明以选择性地照亮聚丙烯酰胺水凝胶的微米级区域后，进行牵引力测量。通过使用正则化FTTC和广义交叉验证选择的正则化参数来重建牵引力。我们基于吸引力显微镜结合光和使用微图案细胞释放的模型模块化方法是多功能的，可以与其他显微镜和成像设置进一步利用，以提高其分辨率和灵敏度。