分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

该方法可使研究人员同时研究多个患者细胞系的细胞收缩，从而更快速、更高效地研究疾病。该技术可实现对细胞收缩的实时定量分析。

一小时内，我们可以获得数十个细胞的收缩值。我们首次证明，在一组主动脉瘤患者中，肌细胞的收缩功能下降。这可能成为医学治疗的新生物标志物或靶点。

首先将两把手术镊子和一把手术刀浸入70%乙醇中进行消毒，随后擦干。然后在将进行组织解剖的培养皿中加入2毫升SMC培养基。接着向两个T-25培养瓶中各加入2.5毫升SMC培养基。

轻轻旋转锥形瓶，使少量培养基覆盖整个表面。肉眼观察活检组织，通过内膜侧是否存在动脉粥样硬化斑块以及外膜侧是否存在黏滑的结缔组织来识别主动脉的三层结构。为了从中膜分离平滑肌细胞，首先将组织放置为内膜斑块侧朝上，然后用一对镊子夹住组织向下推压，同时用另一对镊子将坚硬的斑块从组织上剥离，从而去除其余两层，直至露出粉红色、均匀的中膜层。

现在将组织翻转，通过牵拉去除外膜层，重复上述操作，必要时可多次尝试，确保去除所有可见部分，因为该层不易与中膜分离。一旦分离出中膜层，用镊子压住中膜，用手术刀沿单一方向进行切割，将组织切成小块，切口应整齐且为单向切割，以尽量减少损伤。用镊子将10至20个这样的组织块放置于T-25培养瓶的上四分之一区域。

按照前述方法对两把手术镊和一把手术刀进行灭菌后，在将进行组织解剖的培养皿中加入两毫升成纤维细胞培养基。然后向两个T-25培养瓶中各加入2.5毫升成纤维细胞培养基，并轻轻旋转培养瓶，使少量培养基覆盖整个瓶壁表面。肉眼观察活检组织，识别具有明显皮肤表面的表皮层，有时可见毛发；再观察其对侧，寻找呈黄色且质地黏滑的皮下脂肪组织。

表皮与皮下脂肪之间的层是真皮，也是有活力的成纤维细胞的来源。为了从真皮中分离成纤维细胞，需去除另外两层：将组织置于真皮面朝上，使三层结构均可见。然后用镊子固定组织，沿一条整齐的切线完整切除整个表皮，同时避免损伤组织。

现在翻转组织，用手术刀在真皮层内平行于皮下脂肪边界处进行切割，重复上述操作。一旦分离出真皮层，用镊子将组织压紧，沿单一方向用手术刀将其切成小块。然后用镊子将10至20个这样的组织小块放置于T-25培养瓶的上四分之一区域。

使用自动细胞计数器对细胞进行计数，并以每孔 30,000 个细胞的接种密度，将 SMCs 接种于经明胶包被的 ECIS 板中，每孔加入 200 微升 SMC 培养基，设三个重复孔。将接种有 SMCs 的培养板放入细胞培养孵育箱中的 ECIS 96 孔支架内。双击 ECIS Applied BioPhysics 软件以启动程序，然后点击 Setup 按钮。

在左下方标有“孔板配置”的面板中，检查所有电极是否均与支架接触。如果电极未正确连接，请在开始测量前调整支架中的板位置。现在，通过单击“阵列类型”在同一个面板中选择板的类型。

接下来，准备两支移液器，分别设置为 2 µL 和 150 µL 体积。在开始刺激前，按下软件中的“Mark”按钮并添加注释。为刺激细胞，需打开培养皿盖并将其放置于培养箱内无菌表面上。

然后，尽快向每个孔中加入 2 µL 离子霉素工作液，以诱导平滑肌细胞收缩。待所有细胞均受到刺激后，使用第二支移液器混匀各孔中的培养基。为评估实验间测量的可重复性，将所有纳入的对照组和患者细胞系的两次独立测量结果绘制为 Bland-Altman 图，结果显示该方法的变异均在置信区间范围内，仅有一个离群细胞系除外。

同时接种相同实验并同时刺激的两个孔显示出几乎相同的收缩反应曲线。为了验证所观察到的反应是收缩而非由于离子霉素刺激引起的渗透压应激，刺激后更换了培养基，并记录细胞行为，结果显示受刺激的细胞重新开始在电极上伸展。来源于健康非扩张主动脉的平滑肌细胞（SMCs）的收缩反应中位值为61%，而来源于腹主动脉瘤患者主动脉的平滑肌细胞的中位反应为52%。

对照组的平均收缩反应被用于识别出四名收缩值低于正常值的患者。Western blot 分析及后续定量结果证实，这些细胞表达平滑肌细胞（SMC）标志物。为测定平滑肌细胞（SMC）的增殖能力，进行了 Ki67 的 qPCR 检测。

Ki67 表达在所有细胞中均可检测到，但与收缩输出无相关性。刺激细胞收缩时，请注意不要同时移液过多孔，应尽量快速完成移液。该操作可能需要一些练习。

通过该方法，我们根据患者的收缩功能将其分为正常收缩和低水平收缩两组，从而能够研究这些患者及其与临床特征（如吸烟）之间的关联。