非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

在视网膜病变中，血管改变是临床医生检测到的首个体征。这些改变随着疾病的进展而发展，医生会根据这些变化选择相应的治疗方案。为了研究该病理过程的不同阶段，已开发出多种动物模型。

在本研究中，我们将展示如何测量不同的血管改变。为此，我们将采用两种动物模型。其中一种是氧诱导视网膜病变小鼠模型，该模型可模拟早产儿视网膜病变以及增殖性糖尿病视网膜病变的某些特征。

在此，我们将测量无血管区域、新生血管区域以及小动脉的扩张和扭曲程度。在本实验室中，我们建立了代谢综合征小鼠模型，该模型可诱导非增殖性视网膜病变。本研究对血管密度和分支情况进行了评估。

处死小鼠后，用剪刀摘除眼球。将摘除的眼球用新配制的多聚甲醛在室温下固定1小时。在解剖显微镜下，用剪刀沿角膜缘剪除角膜，并分离出完整的视网膜。

弃去眼球的前段结构，然后将视网膜从视网膜色素上皮层（RPE）-脉络膜复合体中分离出来。将视网膜置于200 µL的离心管中。随后在4°C条件下，用含有5%牛血清白蛋白和Triton的100 µL TBS溶液对视网膜进行封闭和通透处理，轻度振荡孵育6小时。

然后将管子倒置，使视网膜进入凹槽中，并用移液器吸除封闭液。加入含有凝集素的100 µL溶液。用铝箔包裹管子，以保护样品免受光照。

将视网膜与凝集素溶液在4°C下轻轻振荡孵育过夜。用100 µL TBS-Triton在摇床上轻轻振荡洗涤视网膜20分钟。重复此步骤三次。

将视网膜放置在载玻片上，并加入一滴 PBS。在解剖显微镜下，从视网膜边缘向视神经方向进行四条等距的切口。使用镊子或小块滤纸将视网膜的瓣状结构展开。

确保感光细胞侧朝下。用滤纸吸去载玻片上残留的 PBS。然后加入封片剂并加盖盖玻片。

室温下静置干燥一小时。将载玻片置于4°C避光保存。在共聚焦显微镜下，将载玻片倒置于载物台上。

聚焦视网膜血管网的上层丛状结构，选择一个区域以开始图像采集。在软件中设置通用激光参数。设置X、Y和Z轴的坐标。

启动扫描。扫描过程完成后，打开图像并以首选的扩展名保存。在 ImageJ FIJI 软件中，进入菜单栏，点击文件，然后选择打开。

选择要处理的图像。在 Bio-Formats 导入选项窗口中，选中“显示 OME-XML 元数据”并点击“确定”。在 OME 元数据窗口中，查找像素尺寸信息。复制此数据。

进行图像校准，请前往菜单栏并选择图像属性。复制相关信息，然后点击确定。为图像指定偏好的lut。要将所有堆栈可视化为单个图像，请前往菜单栏并选择图像、堆栈、Z投影。

在显示的投影窗口中，选择所有可见血管的图像序列。在“投影类型”中，选择“平均强度”，然后点击“确定”。转到菜单栏中的“图像”→“调整”→“亮度/对比度”，点击“应用”并保存更改。

复制选定的亮度和对比度参数。所有图像的这些参数必须完全相同。在菜单栏中，选择魔棒工具。

选择无血管形成的视网膜区域。按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中点击“测量”以获取无血管区域的信息。

重复这些步骤以测量视网膜的总面积。在菜单栏中，选择魔棒工具。放大图像以更清晰地观察新生血管。

使用魔棒工具逐一选择新生血管。按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中点击“测量”以获取面积数据。

在菜单栏中，选择直线工具。放大图像以更清晰地观察血管壁。在第一条分支之前，对主血管绘制三条垂直于其走向的横线。

按下键盘上的 T 键，以在 ROI 管理器中记录选定区域。在 ROI 管理器中点击“测量”以获取距离数据。在菜单栏中，用鼠标右键点击“直线工具”图标，并选择“分段线”。

从视神经开始，沿血管形态在血管内画一条线，直至第一个血管分叉处。按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。在菜单栏中，选择直线工具。

从视神经画一条线至第一个血管分叉处。按下键盘上的 T 键，将选定区域记录在 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中点击“测量”以获取距离数据。

使用菜单栏中的椭圆工具，定义一个适用于所有实验条件的区域。所选区域必须是以视神经为中心绘制的同心圆。按下键盘上的 T 键，将所选区域记录到 ROI 管理器中。

手动计数所选区域内主血管上发出的初级分支数量。将图像转换为8位模式。在菜单栏中选择“插件”，依次点击“血管分析”、“血管密度”。

使用菜单栏中的方框工具定义希望测量血管密度的区域，然后单击“确定”。程序将显示一个新窗口，提供所需的测量信息。在第一个实验示例中，采用了氧诱导视网膜病变小鼠模型。

在出生后第12天进行玻璃体内注射，以评估一种药物作为抗血管生成剂的有效性。注射溶剂的 小鼠作为对照组。无血管区域定义为缺乏视网膜血管的区域。

根据所获取的图像，无血管区域可量化为无血管区域的总和除以视网膜的总面积。机械损伤区域也表现为血管缺失。为识别损伤区域，可利用Hoechst染色分析神经元层的完整性。

新生血管是由浅层血管丛的已有血管形成的细小血管。我们通过量化新生血管区域占视网膜总面积的比例，来计算新生血管簇所占据的面积。由于新生血管的形态和大小具有变异性，有时可能与碎片和伪影相似。

为了区分新生血管，需确认血管丛是从成熟血管生长而来。在分析扩张程度时，我们在第一个分支之前的三个高度位置测量主血管的直径。为了减少不同实验结果之间的变异性，研究人员必须预先确定测量血管直径的距离。

理想情况下，距离视神经最远的点应约为 300 微米。我们建议每种条件下至少分析六只动物，并对结果进行平均。关于迂曲度，我们通过测量主血管沿其形态走行的距离，与视神经至第一分支点之间的直线距离相比，来计算该值。

如图所示，主血管的弯曲度存在异质性。为了获得具有代表性的结果，每种条件下的小鼠数量不得少于六只。最近的参数，即血管分支和密度，是在一种表现为非增殖性视网膜病变的代谢综合征模型中进行分析的。

在测量血管分支时，我们通过绘制一个同心圆来定义定量区域，然后逐一计数从主中央血管发出的一级分支。根据所获得的图像，血管密度被量化为血管所占面积与ROI面积的比值，其中ROI在每张显微照片中的位置不同。应避免对存在机械损伤的区域进行量化。

如果存在两个以上穿孔区域，则必须弃用该视网膜。总之，本文介绍了在临床实践中用于量化最重要参数的一些经典、成熟且可重复的技术。