Name: 使用报告基因表达重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠的病毒感染进行实时成像和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解利用荧光或荧光素酶报告基因重组SARS-CoV-2在K18 hACE2转基因小鼠中进行活体成像和病毒追踪的方法。该技术可实时监测病毒感染动态，为评估抗SARS-CoV-2治疗药物提供可靠平台。

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我们感谢本研究所（德克萨斯生物医学研究所）的成员在 COVID-19 大流行期间为保障设施正常、安全运行所付出的努力。我们还要感谢本机构生物安全委员会（IBC）和机构动物照护与使用委员会（IACUC）以高效的方式审阅我们的实验方案。感谢西奈山伊坎医学院的 Thomas Moran 博士提供了SARS-CoV交叉反应性单克隆抗体1C7C7核衣壳（N）蛋白。Martinez-Sobrido 实验室目前的 SARS-CoV-2 研究得到了美国国家过敏与传染病研究所（NIAID/NIH）基金项目 RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1 和 R43AI165089-01 的资助；美国国防部（DoD）基金项目 W81XWH2110095 和 W81XWH2110103；圣安东尼奥精准治疗合作伙伴计划；德克萨斯生物医学研究所论坛；德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心；圣安东尼奥医学基金会；以及由 NIAID 资助的流感致病机制与传播研究中心（CRIPT），即流感研究与应对卓越研究中心（CEIRR，合同号 #75N93021C00014）的支持。

涉及K18 hACE2转基因小鼠的实验方案已获得德克萨斯生物医学研究所（TBRI）机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有实验均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》中的建议40。在操作小鼠时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. 使用 K18 hACE2 转基因小鼠
<ol>
	<li>在生物安全二级（BSL-2）动物饲养设施中，以无特定病原体条件饲养和维持4至6周龄雌性B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J小鼠（K18 hACE2转基因小鼠）。
	<ol>
		<li>到达BSL2设施后，让动物适应环境7天，随后将其转移至BSL-3动物设施进行感染及其他实验操作。</li>
		<li>根据IACUC规程，每笼放置4只小鼠。为确保动物已死亡，在小鼠感染rSARS-CoV-2后 体内 成像后，使用致死剂量的Fatal-Plus实施安乐死&#62;100 mg/kg</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生物安全
注意：本研究中，rSARS-CoV-2 是使用基于 BAC 的反向遗传系统生成的，针对 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 毒株，方法如先前所述37。所有涉及 rSARS-CoV-2/Nluc 或 rSARS-CoV-2/Venus 感染的体内操作必须在生物安全三级（BSL-3）条件下于生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在执行本文所述所有实验操作之前和之后，依次使用2% Wexicide和70%乙醇消毒剂清洁生物安全柜。</li>
	<li>每次使用前后均需对所有解剖器械（如剪刀、解剖镊等）及匀浆器进行灭菌处理。</li>
	<li>每次使用前后，根据制造商说明，清洁分离室并使用MB10片剂进行消毒。</li>
	<li>按照IBC和IACUC指南，妥善处理实验过程中产生的所有生物材料。</li>
</ol>
3. 在体 rSARS-CoV-2的表征
<ol>
	<li>小鼠感染
	<ol>
		<li>将4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠放入标记好的笼子中，每笼4只，并使用耳缘打孔编码对每只小鼠进行标识。分别设立一组小鼠用于体重和存活率观察，另一组用于病毒滴定和成像分析。</li>
		<li>感染前，从胸部腹侧乳头至腹股沟乳头区域剃除小鼠胸部毛发，以利于生物发光信号的检测。</li>
		<li>制备含有10的rSARS-CoV-2接种物5 在无菌条件下，使用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS），以50 µL的总体积将噬斑形成单位（PFU）/小鼠进行处理。 
		注意：使用以下公式计算病毒稀释时所需的 rSARS-CoV-2 用量：所需病毒量 = (105 （每只小鼠的PFU / 50 µL）× 最终体积）/ 病毒原液滴度</li>
		<li>将病毒接种物保持在冰上冷藏。</li>
		<li>使用模拟感染（1× PBS）和rSARS-CoV-2/WT感染的小鼠作为内部对照。将模拟感染小鼠与rSARS-CoV-2感染小鼠分笼饲养。</li>
		<li>在麻醉舱中使用5%异氟烷气体麻醉小鼠，并以3%异氟烷维持麻醉。</li>
		<li>在确认姿势反应和翻正反射后，将小鼠置于仰卧位。</li>
		<li>用食指和拇指捏住小鼠颈部的皮肤，同时用小指将尾巴固定在手掌上，使动物保持背位。</li>
		<li>将含有50 µL病毒接种物的移液器吸头置于鼻孔处，缓慢注入溶液。通过观察接种液滴消失，确保病毒接种物已被吸入且无反流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物发光监测感染rSARS-CoV-2/Nluc的K18 hACE2转基因小鼠图1 和 图2) 
	注意：本实验遵循示意图所示流程，并使用图中展示的病毒 图1需要使用异氟烷麻醉装置 体内 成像系统（IVIS）。参见 材料表 有关所需仪器和系统的详细信息。
	<ol>
		<li>启动成像软件并设置参数，点击图像模式 生物发光，打开滤光片，将曝光时间设置为自动。</li>
		<li>启动IVIS成像系统后，在生物安全柜内将小鼠放入隔离室。以5%浓度的异氟烷对小鼠进行麻醉诱导。待姿势反应和翻正反射消失后，维持使用3%异氟烷。</li>
		<li>小鼠麻醉后，将其从隔离舱中取出，用25 G针头经眼后静脉窦注射以1×PBS按1:10稀释的荧光素酶底物（每只小鼠终体积100 µL）。</li>
		<li>注射荧光素酶底物后，将小鼠放回隔离室，胸部朝上，鼻腔置于混合气锥形罩内，以在成像过程中维持动物的麻醉状态。</li>
		<li>将分离室转移至IVIS成像仪中，在关闭IVIS成像仪门后立即选择 获取 在软件程序中初始化（图2A).</li>
		<li>为了分析所获得的生物发光图像，使用以下方法 感兴趣区域 （感兴趣区域）工具在软件中指定精确信号并测量通量（图2B).</li>
		<li>点击 测量 并让系统开始以光子为单位评估生物发光，以提供可与不同参数提供的输出测量值相比较的绝对光子发射量。</li>
		<li>在感染后第1、2、4和6天对小鼠进行成像。</li>
		<li>之后&#160;成像&#160;将小鼠放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>K18 hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Venus 后的荧光分析图3 和 图4) 
	注意：本实验遵循图示方案及所示的rSARS-CoV-2 图3参见 材料表 有关所需仪器和系统的详细信息。
	<ol>
		<li>启动成像软件并设置参数，设定激发波长（500 nm）和发射滤光片（530 nm），点击图像模式以 荧光 并将曝光时间设置为自动。</li>
		<li>腹腔注射致死剂量的 Fatal-Plus 处死小鼠（&#62;100 mg/kg）。安乐死后，用70%乙醇对切口部位进行消毒。</li>
		<li>使用镊子拉起皮肤，从胸骨向腹部做一纵向切口，并用剪刀从切口两侧向旁侧剪开。剪断肝静脉以减少肺部血液量，避免成像时产生高背景信号。</li>
		<li>用剪刀剪开胸骨并打开肋骨笼。接着用剪刀剪断气管末端，并用镊子取出肺脏。</li>
		<li>将切除的肺组织置于含有2 mL 1x PBS的6孔板中，冲洗以去除多余血液。在样品间使用70%乙醇对手术器械进行消毒和清洁，以尽量减少样品间的交叉污染。</li>
		<li>启动IVIS仪器后，将肺组织放入黑色托盘中，并将各组织彼此分开。</li>
		<li>将托盘放入生物安全柜内的隔离舱中，然后将隔离舱转移至IVIS。关闭舱门并点击 获取 启动成像系统（图 4A).</li>
		<li>为了分析荧光，使用 感兴趣区域 工具并在每只肺周围绘制感兴趣区域（ROI）。手动测量每个ROI，然后使用所提供的平均辐射效率值，并减去假感染小鼠的值（图4B).</li>
		<li>成像完成后，将组织置于冰上用于当天分析，或放入冻存管中用干冰速冻，随后于 -80 °C 保存以备后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>K18-hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Nluc 后的肺部明场成像与病理评分图2A- C）和 rSARS-CoV-2/Venus（图4A- C)
	<ol>
		<li>在对感染了 rSARS-CoV-2/Nluc、rSARS-CoV-2/WT 以及模拟感染的小鼠进行生物发光成像后，将小鼠放回笼中。随后进行安乐死及后续操作。 离体 小鼠肺组织的明场成像（图2A).</li>
		<li>成像后 离体 感染小鼠肺部的荧光，拍摄肺部的明场图像（图 4A).</li>
		<li>使用 ImageJ 分析肺表面的大体病变图2C 和 4C).</li>
		<li>在 ImageJ 中打开待分析的肺部图像。</li>
		<li>计算像素与厘米的比值，使用 直的 工具并测量图像的实际长度。</li>
		<li>选择后，点击 分析 &#62; 测量 用于计算长度方向上的像素长度。</li>
		<li>点击 分析 &#62; 设定比例尺 并输入从上一步计算得出的数值。</li>
		<li>使用 自由选择 工具并选择整个肺表面。点击 分析 &#62; 测量 测量总肺面积。</li>
		<li>点击 编辑 &#62; 选择 &#62; 制作倒置图像 选择肺部其余区域，然后按删除键或退格键以去除背景。</li>
		<li>移除选定区域，然后单击 图像 &#62; 调节 &#62; 颜色阈值.</li>
		<li>选择病理病变区域，调整 亮度 根据存在的充血和出血程度，将数量调整至最低（1到50之间）和最高（50到200之间）。</li>
		<li>选择病理性病变后，单击 选择 阈值颜色面板底部，然后单击 分析 &#62; 测量 用于测量病理区域。</li>
		<li>使用以下公式计算大体病变的百分比：病变区域百分比 =（病变区域测量值 / 肺总表面积）× 100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒滴定（图2D 和 图 4D)
	<ol>
		<li>成像完成后，对小鼠实施安乐死，并采集肺、脑和鼻黏膜组织。</li>
		<li>将肺、脑和鼻黏膜分别放入无菌组织匀浆器中，并各加入1 mL冰冷的1×PBS。</li>
		<li>以 21,500 x g 离心均质样品 g 离心10分钟以沉淀细胞碎片。收集上清液并转移至新的无菌离心管中，弃去沉淀。</li>
		<li>若当天进行病毒滴度测定，将上清液置于 4 °C 保存。或者，将匀浆样本的上清液于 -80 °C 冻存，待后续检测时使用。</li>
		<li>利用组织匀浆上清液进行10倍系列稀释，并用每种稀释度的上清液1 mL感染融合的Vero E6细胞单层（6孔板格式，1.2 × 106 细胞/孔，设三个重复</li>
		<li>在37 °C、湿润的5% CO₂条件下孵育1小时，使病毒吸附2 培养箱</li>
		<li>病毒吸附后，用 1 mL 1x PBS 洗涤细胞，并在含有 1% 琼脂的 2 mL 感染后培养基中孵育，孵育环境为湿度控制的 5% CO₂ 培养箱2 37 °C 培养箱中孵育 72 小时。</li>
		<li>孵育后，将培养板置于4 °C条件下，用10%中性缓冲甲醛溶液灭活24小时，确保整个培养板完全浸没。</li>
		<li>从BSL3中取出培养板，用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次，再加入1 mL 0.5% Triton X-100，在室温（RT）下透化10 min。</li>
		<li>用1 mL含2.5%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS于37 °C封闭细胞1 h，随后在1 mL用2.5% BSA稀释的1 µg/mL SARS-CoV核衣壳（N）蛋白交叉反应性单克隆抗体（1C7C7）中于37 °C孵育1 h。</li>
		<li>用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次，然后根据制造商说明书，使用ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒进行斑块显色。</li>
		<li>以 PFU/mL 计算病毒滴度。 
		&#8203;注意：使用公式 PFU/mL = 稀释倍数 × 空斑数 × (1 mL/接种体积) 进行计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>K18-hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Nluc 后组织中的 Nluc 活性图 2E)
	<ol>
		<li>使用荧光素酶检测试剂盒，按照制造商说明书对模拟感染、rSARS-CoV-2/WT感染及rSARS-CoV-2/Nluc感染的K18 hACE2转基因小鼠器官匀浆中的Nluc存在情况进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>发病率与死亡率评估（图2F，G 和 图4E，F)
	<ol>
		<li>通过鼻腔感染4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠，剂量为105 PFU 的 rSARS-CoV-2/WT、rSARS-CoV-2/Venus、rSARS-CoV-2/Nluc 或模拟感染，操作如第 3.1 节所述。</li>
		<li>在12天内每天同一时间监测并称量小鼠体重，以尽量减少因进食导致的体重波动。对于体重下降达到初始体重25%的小鼠，应实施安乐死，因其已达到人道终点，并记录这些小鼠为死于病毒感染。</li>
		<li>12天后，处死存活的小鼠，计算体重变化百分比和存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

作者声明，本研究所涉及的工作不存在任何商业、财务、非财务或个人利益冲突。

本方案展示了利用表达报告基因的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）监测病毒感染的可行性 体内两种表达报告基因的重组病毒均为研究SARS-CoV-2感染提供了优良工具 体内. 所述的 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 成像系统是研究 SARS-CoV-2 感染动态、病毒致病机制以及在病毒感染后不同时间点鉴定受感染细胞/器官的优良选择。为开展 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 研究中，准确且可重复的感染以及对 rSARS-CoV-2/Nluc 进行充分的接种至关重要。
当研究时 体内 使用rSARS-CoV-2/Nluc进行感染实验时，应剃除小鼠毛发以利于在IVIS下观察Nluc信号。同时需要接种Nluc底物以实现Nluc的可视化。这可能需要一些预实验来确定Nluc底物的浓度和用量，以确保获得较强的Nluc信号。在研究过程中 <e...

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种有包膜的、正义单链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）的乙型冠状病毒属1。该病毒家族分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒1。甲型和乙型冠状病毒主要感染哺乳动物，而丙型和丁型冠状病毒几乎 exclusively 感染鸟类2。迄今为止，已有七种冠状病毒（CoV）跨越物种屏障，成为人类冠状病毒（HCoV）：两种甲型冠状病毒（HCoV-229E 和 HCoV-NL63）以及五种乙型冠状病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]和SARS-CoV-2）3,4,5,6。SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 具有高度致病性，可引起严重的下呼吸道感染7。在SARS-CoV-2出现之前，曾发生过两次由冠状病毒引起的疫情：2002年至2003年间在中国广东省暴发的SARS-CoV疫情，病死率（CFR）约为9.7%；以及自2012年起在中东地区持续至今的MERS-CoV疫情，病死率约为34%7,8。SARS-CoV-2的总体病死率介于3.4%至49%之间，基础疾病会增加病死率8,9。自2019年12月在中国武汉被发现以来，SARS-CoV-2已在全球范围内导致超过2.42亿例人类感染和超过490万例死亡7,10,11,12。值得注意的是，自2020年底以来，新出现的SARS-CoV-2关注变异株（VoC）和兴趣变异株（VoI）已影响病毒特性，包括传播性和抗原性9,13，并改变了COVID-19大流行的总体走向。针对SARS-CoV-2感染的治疗，目前仅有一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗性抗病毒药物（瑞德西韦），以及一种获得紧急使用授权（EUA）的药物（巴瑞替尼，需与瑞德西韦联合使用）14。此外，还有6种获得EUA授权的单克隆抗体：REGEN-COV（卡西瑞单抗和伊德维单抗，联合使用）、索托维单抗、托珠单抗，以及巴尼维单抗与艾德维单抗联合使用15,16,17,18,19。目前仅有一种FDA批准的预防性疫苗（辉瑞-生物新技术疫苗），另有两种预防性疫苗（Moderna 和 Janssen）获得EUA授权20,21,22,23,24。然而，由于感染率失控以及关注变异株和兴趣变异株的不断出现，SARS-CoV-2仍对人类健康构成威胁。因此，迫切需要开发新的方法，以识别高效预防和治疗手段，控制SARS-CoV-2感染及仍在持续的COVID-19大流行。
研究SARS-CoV-2需要繁琐的技术和间接方法，以鉴定感染细胞和/或已验证的感染动物模型中病毒的存在。反向遗传学的应用使得能够构建重组病毒，从而回答病毒学研究中的重要问题。例如，反向遗传学技术为揭示和理解病毒感染机制、致病机制及疾病过程提供了手段。同样，反向遗传学方法也为构建缺失特定病毒蛋白的重组病毒铺平了道路，以研究这些蛋白在病毒致病过程中的作用。此外，反向遗传学技术已被用于生成表达报告基因的重组病毒，用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究，包括筛选预防性和/或治疗性策略以应对病毒感染。由于灵敏度高、稳定性好且检测便捷，得益于新技术的进步，荧光蛋白和生物发光蛋白是最常用的报告基因25,26。在体外（in vitro）研究中，荧光蛋白更适用于病毒在感染细胞中的定位，而荧光素酶则更便于定量分析27,28,29。在体内（in vivo）成像中，全动物成像通常优先选择荧光素酶而非荧光蛋白，而荧光蛋白则更适用于感染细胞的鉴定或离体（ex vivo）成像30,31,32。表达报告基因的重组病毒已被广泛用作研究多种病毒科的重要工具，包括黄病毒科（flaviviruses）、肠道病毒属（enteroviruses）、甲病毒属（alphaviruses）、慢病毒属（lentiviruses）、沙粒病毒科（arenaviruses）以及流感病毒（influenza viruses）等28,33,34,35,36。
克服对二次方法研究SARS-CoV-2以及实时表征SARS-CoV-2感染的需求 体内我们利用先前描述的基于细菌人工染色体（BAC）的反向遗传学系统，构建了可复制的、表达生物发光（nanoluciferase, Nluc）或荧光（Venus）蛋白的重组型（r）SARS-CoV-2，该系统以单拷贝形式维持 E. coli 为了在细菌中扩增病毒序列时将其毒性降至最低37,38值得注意的是，rSARS-CoV-2/Nluc 和 rSARS-CoV-2/Venus 表现出与 rSARS-CoV-2/WT 相似的致病性 体内. rSARS-CoV-2/Venus 中 Venus 的高水平表达使得能够利用一种方法在感染的 K18 hACE2 转基因小鼠肺部检测到病毒感染 体内 成像系统（IVIS）39Venus表达水平与在肺部检测到的病毒滴度高度相关，表明利用Venus表达作为SARS-CoV-2感染的有效替代指标是可行的。通过使用rSARS-CoV-2/Nluc，我们能够实时追踪病毒感染的动态过程，并对SARS-CoV-2感染进行纵向评估。 体内 使用相同的IVIS方法在K18 hACE2转基因小鼠中进行。

<table><tbody><tr><td>0.5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>室温（RT）保存</td></tr><tr><td>1% DEAE-葡聚糖</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛溶液，中性缓冲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>5% 碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura成像软件 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>康宁</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>麻醉气体机</td><td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>4至6周龄雌性K18-hACE2转基因小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 版本 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>巴克斯特</td><td>1001936040</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>MARS 数据分析软件</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 片剂</td><td>QUIP 实验室</td><td>MBTAB1.5</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Nano-Glo 荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>该试剂用于检测Nluc活性。储存于-20℃ &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液</td><td>康宁</td><td>30-009-CI</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution 匀浆器</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>软组织匀浆 CK14 &amp;ndash; 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒，辣根过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4002</td><td>ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒</td></tr></tbody></table>

利用报告基因表达的重组sars-cov-2对k18 hace2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起。截至目前，SARS-CoV-2已在全球造成超过2.42亿例感染和逾490万例死亡。与其他病毒类似，研究SARS-CoV-2需要采用实验方法来检测病毒感染细胞和/或动物模型中的病毒存在。为克服这一限制，我们构建了可复制的表达生物发光（纳米荧光素酶，Nluc）或荧光（Venus）蛋白的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）。这些表达报告蛋白的rSARS-CoV-2可用于追踪病毒感染过程 体外 和 体内 基于Nluc和Venus报告基因的表达。本研究描述了使用rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus在先前报道的K18人血管紧张素转换酶2（hACE2）转基因小鼠感染模型中检测和追踪SARS-CoV-2感染的方法 体内 成像系统（IVIS）。该rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus表现出与rSARS-CoV-2/WT相似的致病性及病毒复制能力 体内重要的是，Nluc 和 Venus 的表达使我们能够直接追踪病毒感染过程 体内和离体，在感染小鼠中。这些rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus是研究SARS-CoV-2生物学的优良工具 体内，以了解病毒感染及相关的新冠肺炎疾病，并确定有效的预防性和/或治疗性措施来应对SARS-CoV-2感染。

K18 hACE2 转基因小鼠中 rSARS-CoV-2/Nluc 感染图1 2） 
图1A 显示了用于评估感染的 rSARS-CoV-2/WT（上图）和 rSARS-CoV-2/Nluc（下图）的示意图 体内. 图1B 展示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2/Nluc感染动态的示意图流程。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠（N = 4）分别以1×PBS进行模拟感染或以105 经鼻接种 rSARS-CoV-2/WT 或 rSARS-CoV-2/Nluc 的 PFU。感染后第 1、2、4 和 6 天，使用隔离舱对小鼠进行麻醉，随后经眶后注射 Nluc 底物。立即将隔离舱放入 IVIS 系统中检测 Nluc 信号 体内 使用成像软件进行检测。在感染rSARS-CoV-2/Nluc的小鼠中可明显检测...

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起。截至目前，SARS-CoV-2已……

本方案描述了在SARS-CoV-2感染的K18人ACE2转基因小鼠模型中，利用表达荧光或发光信号的重组SARS-CoV-2进行活体及离体病毒检测与病毒示踪的活体成像技术。该技术的主要优势在于，可在K18人ACE2转基因小鼠模型中实现SARS-CoV-2的活体与离体研究，具备良好的病毒检测与追踪应用性及可行性。在K18人ACE2转基因小鼠模型中开展SARS-CoV-2的活体成像，是评估抗SARS-CoV-2感染治疗药物在活体内疗效的优良选择。报告基因标记的 SARS-CoV-2 的应用是评估其在体内致病性、病毒复制及嗜性特征的极佳选择。在使用表达荧光素酶的 SARS-CoV-2 进行体内实验时，建议剃除小鼠体毛并在底物注射后立即成像，以增强生物发光信号。开始生物发光检测时，启动活体成像系统（IVIS），设置参数：将成像模式设为生物发光，打开滤光片，并将曝光时间设为自动。接下来，将一只已剃毛并麻醉的小鼠从隔离舱中取出，使用25号针头通过眼后静脉窦向小鼠注射100 µL以PBS按1:10稀释的荧光素酶底物。然后将小鼠放回隔离舱，将隔离舱转移至IVIS成像仪中（该仪器配备加热组件以防止低体温），关闭IVIS成像仪门，并在软件程序中选择“Acquire”以启动成像。为分析所获得的生物发光图像，使用软件中的ROI（感兴趣区域）工具圈定精确信号区域并测量荧光强度。启动成像软件并设置参数。将成像模式设为荧光，激发波长设为 500 纳米，发射滤光片设为 530 纳米，曝光时间设为自动。进行尸体解剖，从小鼠体内切除肺组织。将切除的肺组织置于含有两毫升 1X PBS 的 6 孔板中，冲洗以去除多余的血液。在样品之间使用 70% 乙醇对手术器械进行消毒和清洁。启动 IVIS 仪器后，将肺组织放置在黑色背景板上，并将各组织彼此分开。然后将托盘放入生物安全柜内的隔离舱中，再将隔离舱转移至IVIS系统。关闭IVIS成像仪的门，点击“Acquire”以启动成像系统。为分析荧光信号，使用ROI工具并在每侧肺周围绘制感兴趣区域（ROI）。手动测量每个 ROI，然后使用提供的平均辐射效率值，并减去假感染小鼠的数值。成像完成后，将组织放入冻存管中，用干冰速冻，随后于零下 80 摄氏度保存，以备后续处理。利用组织匀浆所得的上清液，进行 10 倍系列稀释，并取每种上清液稀释液 1 毫升，分别接种至 Vero E6 细胞的融合单层细胞中，每组设三个重复。在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育1小时，使病毒吸附。完成后，用1毫升1×PBS洗涤细胞，然后在含1%琼脂的2毫升感染后培养基中，于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中继续培养细胞72小时。孵育结束后，在4°C条件下，用10%中性缓冲福尔马林处理培养板24小时以灭活病毒，确保整个培养板完全浸没。从生物安全三级实验室取出培养板，在室温下用一毫升0.5% Triton X-100溶液洗涤细胞三次，每次10分钟。接着，用一毫升含2.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液在37摄氏度封闭通透细胞一小时，随后加入一毫升用2.5% BSA稀释的SARS-CoV核衣壳蛋白交叉反应性单克隆抗体1C7C7（浓度为每毫升一微克），在37摄氏度孵育一小时。用一毫升1×PBS溶液洗涤细胞三次，然后根据制造商说明书，使用ABC及二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物试剂盒显色斑块，最后以每毫升斑块形成单位计算病毒滴度。研究中观察到，生物发光纳米荧光素酶（nanoluciferase，简称 Nluc）可被轻松检测到，感染 rSARS-CoV-2 Nluc 的小鼠呈现信号，而感染 rSARS-CoV-2 野生型或模拟感染的小鼠则无信号。定量分析显示了感染后不同时间点的 Nluc 信号强度。感染 rSARS-CoV-2 Nluc 的小鼠肺表面的大体病变与感染 rSARS-CoV-2 野生型小鼠组的病变程度相似。此外，在感染后的不同时间点，检测到的病毒滴度以及rSARS-CoV-2 Nluc感染小鼠各器官中的病毒载量与rSARS-CoV-2野生型病毒感染小鼠相当。同时，Nluc活性仅在rSARS-CoV-2 Nluc感染小鼠的器官中被检测到。另设一组模拟感染和病毒感染小鼠，连续监测12天的体重变化和存活情况。感染rSARS-CoV-2 Nluc和rSARS-CoV-2野生型的小鼠体重最多减轻了25%，并且在感染后7至8天内全部死于病毒感染。感染rSARS-CoV-2 Venus后，可在感染rSARS-CoV-2 Venus的小鼠肺组织中 readily 检测到Venus的表达，而在感染rSARS-CoV-2野生型或模拟感染的小鼠中则无法检测到。定量分析显示，Venus荧光强度在感染后第2天达到峰值，随后在感染过程中逐渐下降，且在感染小鼠的肺组织中亦呈现下降趋势。肺表面图像显示，感染rSARS-CoV-2 Venus的小鼠的肉眼病变与感染rSARS-CoV-2野生型的小鼠相似。此外，感染rSARS-CoV-2 Venus后，所有器官中的病毒滴度与感染rSARS-CoV-2野生型小鼠中观察到的相当。感染rSARS-CoV-2 Venus和rSARS-CoV-2野生型的小鼠体重减轻高达25%，并在感染后第9天全部因病毒感染死亡，无一存活。表达SARS-CoV-2的报告基因系统的结果已被证明是病毒性感染的有效替代指标。因此，这有助于快速鉴定和评估用于治疗SARS-CoV-2感染的应对措施。

live-imaging-quantification-viral-infection-k18-hace2-transgenic-mice

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用报告基因表达重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠的病毒感染进行实时成像和定量

介绍了一种追踪突触连接神经元的方法。我们利用上游细胞中TVA的特异性，检测目标细胞群体是否接收来自基因定义细胞类型的突触输入。...

基因定义神经环路的病毒示踪

来源： Jamieson, T. R., et al. 利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的伪病毒感染。 J. Vis. Exp.

利用哺乳动物细胞培养生产与收集假病毒颗粒

来源：Morales Vasquez, D.，等．利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18...

基于噬斑实验的感染小鼠组织样本中病毒载量定量分析

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

一种带有荧光素酶-荧光报告基因的流感病毒用于追踪病毒感染

本视频演示了杂交链式反应（HCR）-荧光原位杂交（FISH）技术在可视化SARS-CoV-2亚基因组RNA空间分布中的应用。将HCR与免疫荧光技术相结合，有望在单细胞水平上揭示宿主与病毒之间的相互作用。...

利用免疫-RNA 荧光原位杂交技术可视化 SARS-CoV-2

我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。...

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

甲型流感病毒（IAV）是具有传染性的呼吸道病原体，可引起每年的流行和偶发的大流行。本文介绍了一种利用新型重组荧光素酶和荧光双报告甲型流感病毒（BIRFLU）在活体中追踪病毒感染的实验方案。该方法为研究人员提供了在活体内研究甲型流感病毒的优良工具。...

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

在此，我们介绍一种简单的方法，该方法结合了RNA荧光原位杂交 将RNA原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合，用于可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该方案可能有助于加深理解SARS-CoV-2...

使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2...

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

本文详细介绍了一种优化的小鼠侧尾静脉注射方案，用于在成年小鼠中系统性给予腺相关病毒（AAV）。此外，我们还描述了常用的检测方法，以评估AAV的转导效率。...

通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

了解利用荧光或荧光素酶报告基因重组SARS-CoV-2在K18 hACE2转基因小鼠中进行活体成像和病毒追踪的方法。该技术可实时监测病毒感染动态，为评估抗SARS-CoV-2治疗药物提供可靠平台。

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

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