Name: 制备珠状支持脂质双分子层研究T细胞免疫突触的颗粒输出 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解利用珠状支持脂质双分子层研究T细胞免疫突触颗粒输出的方法。该方案通过优化蛋白质校准和多色流式细胞术，帮助研究人员深入分析T细胞输出的生化调控机制。

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我们感谢实验室成员以及肯尼迪风湿病学研究所社区成员在科学讨论中给予的建设性意见，特别感谢我们的流式细胞术设施负责人 Jonathan Webber。本研究由惠康信托主要研究基金（100262Z/12/Z）、欧洲研究理事会高级资助（SYNECT AdG 670930）以及肯尼迪风湿病学研究信托基金（KTRR）资助（以上三项均授予 MLD）。PFCD 获得欧洲分子生物学组织长期奖学金（ALTF 1420-2015，与欧盟委员会联合资助 LTFCOFUND2013, GA-2013-609409）及玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划的支持，并获得牛津-百时美施贵宝奖学金资助。

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
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<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
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<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
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<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

BSLB 是研究 T 细胞受模拟 APC 膜刺激后颗粒产物的多功能工具。该方法具有高度灵活性，可重构复杂或简化的膜组成，用于研究配体及其信号对 tSV 和大分子攻击颗粒及其组分分泌的影响。我们已在多种 T 细胞上验证了该技术，包括预激活的 TH、CTL、Treg 和 CART15。本方案同样适用于检测新分离的静息态 T 细胞的突触颗粒释放。使用新分离 T 细胞的一个局限性在于，这些静息态细胞群产生的跨突触颗粒谱型不同，这与其细胞表面组成相关（详见 15）。
作为一个简单的流式细胞术检测方案，我们推荐使用抗TCR克隆IP26、抗CD81克隆5A6、抗穿孔素（PRF1）克隆B-D48或抗CD40L克隆24-31，以及含ATTO 390或ATTO 565的脂质（使BSLB具有内在荧光）。为帮助区分单个细胞、单个BSLB以及共轭复合物，我们建议使用抗CD4克隆OKT4和/或抗CD45克隆HI30，尽管这些分子在细胞表面高度表达，但仅以有限程度转移至BSLB上（有关荧光染料及其他已验证抗体的更多细...

免疫突触（IS）是一种在发生物理接触的细胞界面处形成的、关键的分子结构，可促进邻近细胞间信息的调控性交换。文献中已描述了多种不同的免疫突触，越来越多的证据表明，这些分子枢纽是细胞网络的一种保守特征。多种免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，均通过形成短暂的接触来交换信息1。多组学研究正在推动人们对驱动致病性细胞网络、并表达功能未知的表面蛋白的新型白细胞和基质细胞亚群的理解。作为合成性抗原呈递细胞，BSLB可直接用于研究单个蛋白质在T细胞整合激活信号（即抗原和共刺激/共抑制信号）过程中的功能作用，以及由此引发的效应分子颗粒（被称为第四信号）的释放。
本文描述了使用BSLBs模拟模型APC表面组成时所需的实验方案及关键的技术要点。文中提供了对APC表面免疫受体及其他表面蛋白进行定量测量的方案，以及根据这些测定结果重建含生理相关数量蛋白的合成APC的方案。随后介绍了T细胞与BSLB共培养的操作步骤，以及利用流式细胞术对跨突触颗粒转移进行定量检测的方案。尤为突出的是，BSLBs有助于研究一类源自质膜的tSV亚群，即突触外泌体（SEs）。该体系可富集T细胞受体（TCR）+) SEs 在 TCR 被激活后释放2 并被BSLBs高效捕获3，是评估抗原激动特性和模拟膜组分的优良读出指标。CD63+ 活化T细胞还会释放外泌体和超分子攻击颗粒（SMAPs），这些颗粒可被BSLBs捕获。它们可作为T细胞活化以及随之发生的胞吐和溶解性颗粒分泌的额外检测指标。胞吐囊泡向T细胞相互作用极的动员也有助于细胞因子（如IL-2、IFN-）的方向性释放&#947;，以及在激活后产生的IL-104,5,6,7,8尽管T细胞释放的细胞因子也可在BSLBs上被检测到，但目前正开发一项更为专门的研究，以验证免疫突触处细胞因子释放的定量分析。
要探究特定膜组分如何影响T细胞的突触输出，首先需要明确目标膜组分的生理密度。基于流式细胞术的细胞表面蛋白定量是本方案中的关键步骤，其实现需要满足两个条件：1）使用已知每抗体所标记荧光染料分子数（F/P）的抗体；2）采用标准微球作为参照，以便根据测得的平均荧光强度（MFIs）插值推算荧光染料分子的数量。
这些基准标准包含五种微球群体，每种微球含有逐渐增加的等效可溶性荧光染料分子数（MESF），覆盖了任意荧光检测的动态范围。这些标准微球群体可产生离散的荧光峰，通过简单的线性回归即可将任意荧光单位转换为MESF。所得MESF值随后与抗体的F/P值结合使用，用于计算每个细胞（或后续步骤中的BSLB）上结合分子的平均数量。将检测到的分子平均数与估计的细胞表面积相结合，即可计算出以分子/µm2表示的生理密度。该定量方案也可适用于T细胞表面蛋白密度的测量，以及介导同型T细胞突触（即T-T突触9）形成的膜组分的生化重建。如有需要，还可通过使用每分子标记已知数量荧光染料的重组靶标来进一步估算抗体结合的价态。随后，通过同时比较结合的荧光蛋白数量与定量抗体的数量（使用两种不同的定量荧光染料和MESF标准），即可计算同一BSLB群体中抗体结合的价态。
重建抗原呈递细胞（APC）膜需要在二氧化硅微珠上组装支撑脂双层（SLB）1。可通过含有不同磷脂种类的脂质体储备液构建多功能的脂双层基质，从而实现利用不同结合化学性质的重组蛋白进行锚定（脂质体的制备详见10）。一旦确定了相关配体在细胞表面的生理密度（或多种密度），即可采用相同的流式细胞术方案来估算为支撑脂双层（BSLB）包被目标生理密度所需重组蛋白的浓度。可单独或联合使用两种不同的锚定系统。
首先，含有终浓度为 12.5 mol% 的 Ni2+-结合磷脂的 SLB 足以为每平方微米提供约 10,000 个 His 标签结合位点10，该体系可有效将市售蛋白修饰至 BSLB 上，前提是这些蛋白的生理密度不超过此最大负载容量。第二种负载系统利用含生物素的磷脂（以 mol% 计）通过链霉亲和素桥接，负载生物素化的抗 CD3e Fab（或 HLA/MHC 单体）。结合这两种 BSLB 修饰方法，可灵活定制作为合成 APC 的 BSLB。对于高度复杂的 APC 表面组成，可通过提高磷脂的 mol% 及蛋白浓度，以负载满足特定研究问题所需的多种蛋白。一旦确定了蛋白的工作浓度和生物素化磷脂的 mol% 比例，即可构建 BSLB，用于通过多参数流式细胞术检测 T 细胞的突触输出。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404C-25mg</td><td>氯仿中的18:1 DGS-NTA(Ni)</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; PIPETMAN L 多通道 P8x200L，20-200 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-25mg</td><td>&amp;nbsp;18:1 (&amp;Delta;9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC）的氯仿溶液</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>DOPE ATTO 390</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 488</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 488-165</td><td>DOPE ATTO 488</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 565</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 565-165</td><td>DOPE ATTO 565</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽酰生物素)（钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C-25mg</td><td>氯仿中的18:1生物素酰化PE</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 黄色吸头 10 x 96 个/盒，堆叠式包装</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon&amp;reg;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5.00 &amp;plusmn; 0.05 &amp;micro;m 非功能化二氧化硅微珠</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>SS05003</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板，U型底，带盖，组织培养处理，无热原</td><td>Costar&amp;reg;</td><td>3799</td><td>用于BSLB与细胞的流式细胞术染色及共培养。</td></tr><tr><td>96孔细胞培养板，V型底，带盖，组织培养处理，无热原</td><td>Costar&amp;reg;</td><td>3894</td><td>用于悬浮细胞或微珠的流式细胞术染色。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）</td><td>赛默飞世尔科技，英吉瑞&amp;trade;</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）</td><td>Thermo Fisher Scientific，Invitrogen&amp;trade;</td><td>A37573 和 A20006</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>用于流式细胞术生物样本的管内常规染色</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何品牌</td><td></td><td>用于保护细胞和 BSLB 免受光照</td></tr><tr><td>抗人 CD154（CD40L），克隆 24-31</td><td>BioLegend</td><td>310815 和 310818</td><td>Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。</td></tr><tr><td>抗人 CD185（CXCR5） Brilliant Violet 711，克隆号 J252D4</td><td>BioLegend</td><td>356934</td><td>用于图1E所示扁桃体细胞的定量流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗人 CD19 Brilliant Violet 421，克隆 HIB19</td><td>BioLegend</td><td>302234</td><td>用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗人 CD2，克隆 RPA-2.10</td><td>BioLegend</td><td>300202</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD2，克隆 TS1/8</td><td>BioLegend</td><td>309218</td><td>Brilliant Violet 421 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD252（OX40L），克隆 11C3.1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD28，克隆 CD28.2</td><td>eBioscience</td><td>16-0289-85</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD317（BST2，PDCA-1），克隆 26F8</td><td>赛默飞世尔科技，英潍捷基</td><td>53-3179-42</td><td>Alexa Fluor 488 偶联物，我们发现该克隆的背景比克隆 RS38E 更干净。</td></tr><tr><td>抗人 CD38，克隆 HB-7</td><td>BioLegend</td><td>356624</td><td>Alexa Fluor 700 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD38，克隆 HIT2</td><td>BioLegend</td><td>303514</td><td>Alexa Fluor 647 标记物</td></tr><tr><td>抗人 CD39，克隆 A1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD4 Brilliant Violet 650，克隆号 OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317436</td><td>用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗人 CD4，克隆 A161A1</td><td>BioLegend</td><td>357414 和 357421</td><td>PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD4，克隆 OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317414 和 317422</td><td>PE/Cy7 和 Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD40，克隆 5C3</td><td>BioLegend</td><td>334304</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD40，克隆 G28.5</td><td>BioLegend</td><td></td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD45，克隆 HI30</td><td>BioLegend</td><td>304056 和 368516</td><td>Alexa Fluor 647 和 APC/Cy7 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD47，克隆号 CC2C6</td><td>BioLegend</td><td>323118</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD54（ICAM-1），克隆 HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD63（LAMP-3），克隆 H5C6</td><td>BioLegend</td><td>353020 和 353015</td><td>PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD73，克隆 AD2</td><td>BioLegend</td><td>344002</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 CD80，克隆 2D10</td><td>BioLegend</td><td>305216</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD81，克隆 5A6</td><td>BioLegend</td><td>349512 和 349502</td><td>PE/Cy7偶联物分别使用Alexa Fluor 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）进行体外标记。</td></tr><tr><td>抗人 CD82，克隆 ASL-24</td><td>BioLegend</td><td>342108</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD86，克隆 IT2.2</td><td>BioLegend</td><td>305416</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD8a，克隆 HIT8a</td><td>BioLegend</td><td>300920</td><td>Alexa Fluor 700 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 CD8a，克隆 SK1</td><td>BioLegend</td><td>344724</td><td>Alexa Fluor 700 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 HLA-A/B/C/E，克隆 w6/32</td><td>BioLegend</td><td>311414 和 311402</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记</td></tr><tr><td>抗人 HLA-DR，克隆 L243</td><td>BioLegend</td><td>307656 和 307622</td><td>Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。</td></tr><tr><td>抗人 ICAM-1，克隆 HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 ICOS，克隆 C398.4A</td><td>BioLegend</td><td>313516</td><td>Armenian Hamster IgG</td></tr><tr><td>抗人 ICOSL，克隆 MIH12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 ICOSL，克隆 MIH12</td><td>eBioscience</td><td>16-5889-82</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室内部进行标记</td></tr><tr><td>抗人 LFA-1，克隆 TS1/22</td><td>BioLegend</td><td>自行制备</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 OX40，克隆 Ber-ACT35（ACT35）</td><td>BioLegend</td><td>350018</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 PD-1，克隆 EH12.2H7</td><td>BioLegend</td><td>135230 和 329902</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记</td></tr><tr><td>抗人 PD-L1，克隆 29E.2A3</td><td>BioLegend</td><td>329702</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 PD-L2，克隆 24F.10C12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>抗人 PD-L2，克隆 MIH18</td><td>BioLegend</td><td>345502</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>抗人 TCRab，克隆 IP26</td><td>BioLegend</td><td>306712 和 306714</td><td>Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。</td></tr><tr><td>抗人 CD156c (ADAM10)，克隆 SHM14</td><td>BioLegend</td><td>352702</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD317（BST2，Tetherin），克隆 RS38E</td><td>BioLegend</td><td>348404</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 同型对照，克隆 HTK888</td><td>BioLegend</td><td>400902</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>BD 细胞仪设置与追踪微球</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司（BD）</td><td>641319</td><td>定量流式细胞术前对仪器性能的检测轨迹</td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司（BD）</td><td>23-14523-00</td><td>采集软件</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;氯化钙</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>无水，BioReagent，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 &amp;ge;96.0%</td></tr><tr><td>牛乳酪蛋白，适用于蛋白激酶底物（脱磷酸化后），纯化粉末</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>ThermoFisher Scientific，Invitrogen&amp;trade;</td><td>12321D</td><td>用于去除体积小于 2 mL 的 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-15</td><td>赛默飞世尔科技，英坦奇&amp;trade;</td><td>12301D</td><td>用于去除 Dynabeads&amp;trade; 人源 T 细胞激活剂 CD3/CD28，体积小于 15 mL</td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，一次性装</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>A3160801</td><td>需在56℃加热灭活30分钟 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva, GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02</td><td>用于淋巴细胞分离的多糖与二碘异酞酸钠无菌溶液</td></tr><tr><td>可固定的活力染料 eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td>用于分析过程中排除死细胞</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司（BD）</td><td>版本 10.7.1</td><td>分析软件</td></tr><tr><td>Grant Bio MPS-1 多板摇床</td><td>Keison Products</td><td>MPS-1</td><td>在染色过程中混合细胞，或在染色或蛋白负载过程中混合 BSLB（作为轨道振荡的替代方法）</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液（1 M）</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，N-(2-羟乙基)哌嗪-N&amp;prime;-(2-乙烷磺酸)，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>用于配制 HBS/HAS 或 HBS/BSA 缓冲液。BioPerformance Certified， &amp;ge;99.5%（滴定），适用于细胞培养</td></tr><tr><td>HERACell 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 孵育箱，150 L，电抛光不锈钢</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026282</td><td>用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。</td></tr><tr><td>Hula Mixer&amp;reg; 样品混合器</td><td>赛默飞世尔科技，生命技术公司</td><td>15920D</td><td>用于混合BSLB、脂质母液、封闭溶液、蛋白母液以及小规模抗体染色的垂直式可调角度实验室混匀仪。</td></tr><tr><td>人血清白蛋白，30% 水溶液</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>12667-M</td><td></td></tr><tr><td>人源 TruStain FcX Fc 受体阻断液</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>用于阻断生物相关样本中 Fc 受体的 Fc 受体阻断液</td></tr><tr><td>Innovatis CASY 细胞计数器与分析仪 TT</td><td>Biovendis Products GmbH</td><td></td><td>基于电流排斥法对细胞进行计数，并测定细胞大小与体积。</td></tr><tr><td>氯化钾，KCl</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>粉末，BioReagent，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;氯化镁</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td>生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养</td></tr><tr><td>适用于 24 个 1.5/2.0 mL 离心管的微型管插件</td><td>Keison Products</td><td>P-2-24</td><td>Grant Bio MPS-1 多孔板摇床用微量管插件</td></tr><tr><td>微型孵育器</td><td>Labnet International&amp;nbsp;</td><td>I5110A-230V</td><td>在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>最低必需培养基非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技，吉布科</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG多克隆抗体对照</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>PP54</td><td>用作小鼠 IgG 捕获珠标准品上结合抗体检测的阳性对照</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1，κ 同种型，克隆 MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400129, 400112, 400130, 400144, 400128 和 400170</td><td>Alexa Fluor 488、PE、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC/Cyanine7 和 Brilliant Violet 785&amp;nbsp; 分别形成共轭物。</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1, k 同种型，克隆 X40</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司（BD），Horizon</td><td>562438</td><td>BV421偶联物</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 &amp;kappa; 同型对照，克隆号 P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-82</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a, k 同种型，克隆 MOPC-173</td><td>BioLegend</td><td>400240</td><td>Alexa Fluor 647 偶联物</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b, k 同种型，克隆 MPC-11</td><td>BioLegend</td><td>400330 和 400355</td><td>Alexa Fluor 647 和 Brilliant Violet 785 偶联物</td></tr><tr><td>多孔 6 孔组织培养板，经真空气体等离子体处理</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>用于培养和扩增纯化的 CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 和 CD8&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;磷酸氢二钠</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl，氯化钠</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>NiSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;硫酸镍(II)</td><td>默克，Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td>用于饱和 NTA 位点；在封闭过程中加入</td></tr><tr><td>青霉素链霉素 [+]10,000 单位青霉素；[+] 10,000 &amp;micro;g/mL 链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4，无菌</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>10010</td><td>无 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 或 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 添加</td></tr><tr><td>聚醚砜（PES）滤器单元</td><td>赛默飞世尔科技 Nalgene</td><td>&amp;nbsp;UY-06730-43</td><td>低蛋白吸附的亲水性聚醚砜（PES）膜有助于过滤高蛋白含量的溶液</td></tr><tr><td>PURESHIELD 氩气 ISO 14175-I1-Ar</td><td>BOC有限公司</td><td>11-Y</td><td>为保护储存于 +4 ℃ 的脂质储备液 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>纯化的链霉亲和素</td><td>BioLegend</td><td>280302</td><td></td></tr><tr><td>量子 Alexa Fluor 488 MESF 微球</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>488</td><td>用于插值测定细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 488分子数的基准微球</td></tr><tr><td>量子 Alexa Fluor 647 MESF 微球</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>647</td><td>用于插值细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 647分子的基准微球</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 IgG κ轻链，克隆株 OX-20</td><td>赛默飞世尔科技，英维特罗根</td><td>SA1-25258</td><td>使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记</td></tr><tr><td>重组人 IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1×）；不含 L-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>人类B细胞富集鸡尾酒混合液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15064</td><td>分离B细胞以测定纯化细胞群体中蛋白质的密度</td></tr><tr><td>Rosette 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15022C.1</td><td></td></tr><tr><td>罗塞特人 CD4+CD127low T 细胞富集混合液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15361</td><td>CD4+ CD127 预富集&lt;sup&gt;低&lt;/sup&gt; 用于通过FACS下游分离Treg的T细胞。</td></tr><tr><td>Rosette 人 CD8+ T 细胞富集混合液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1×）；不含酚红</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>11835-063</td><td>在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;酚红-free 培养基可降低细胞在流式细胞术和显微镜检测中的自发荧光。</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific，Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sprout迷你离心机</td><td>FisherScientific，Heathrow Scientific LLC</td><td>120301</td><td>用于在1.5 mL Eppendorf管中洗涤二氧化硅微珠和BSLB的台式微量离心机。</td></tr><tr><td>无菌带盖 5 mL 聚苯乙烯圆底试管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads 补偿微球</td><td>ThermoFisher Scientific，invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱，7K MWCO</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技&amp;trade;</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

制备用于研究t细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

抗原提呈细胞（APC）通过与T细胞的直接接触传递三种活化信号：1）抗原，2）共刺激/共抑制信号，3）可溶性细胞因子。T细胞在活化后会释放两种效应颗粒：跨突触囊泡（tSVs）和超分子攻击颗粒，分别用于传递细胞间信使并介导细胞毒性作用。这些颗粒会被与T细胞直接接触的抗原提呈细胞迅速内化，导致其表征极为困难。本文介绍了构建和使用珠支持的脂双层（BSLB）作为抗原提呈细胞（APC）模拟物以捕获和分析这些跨突触颗粒的实验方案。同时描述了细胞表面蛋白密度的绝对定量方法、以生理相关水平重建BSLB的技术，以及通过流式细胞术追踪T细胞突触颗粒释放的流程。该方案可进一步拓展用于研究单个蛋白、复杂配体混合物、病原体毒力因子以及药物对各类T细胞效应输出的影响，包括辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞以及表达嵌合抗原受体的T细胞（CART）。

通过流式细胞术进行细胞表面蛋白质的绝对定量 
重建呈现生理配体密度的合成细胞样脂质双层结构（BSLB）需要估算模型细胞亚群上的总蛋白密度。为重建 BSLB，应包含在目标信号通路中可能发挥作用的任何相关配体，以及支持 BSLB 与细胞之间黏附和功能性相互作用的蛋白，例如 ICAM-1 和共刺激分子（如 CD40、CD58 以及 B7 受体 CD80 和 CD86）。根据具体研究问题，还可添加其他蛋白，包括共刺激分子如 ICOSL3、PD-L1 和 PD-L215。对于其他分子，可通过定量流式细胞术直接分析细胞来确定其分子密度，进而用于 BSLB 的重建。对于直接偶联抗体，BioLegend 为每一批号抗体提供荧光染料与蛋白（F/P）比值。抗体也可由实验室自行标记，并通过分光光度法测定 F/P 比值，这在缺乏商业化的特定荧光染料偶联抗体时提供了一种替代方案。由于我们使用相同的抗体来校准细胞和 BSLB 表面重组蛋白的数量，因此无需校正抗体结合价态，因其保持恒定。若需确定抗体结合价态，可使用已知 F/P 值的...

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

抗原提呈细胞（APCs）向发生物理接触的T细胞提供三种激活信号：1）抗原，2）共刺激/共抑制，3）可溶性细胞因子。T细胞在激活后释放两种效应颗粒：跨突触囊泡（tSVs）和超分子攻击颗粒，分别负责传递细胞间信使和介导细胞毒性。这些颗粒会迅速被与T细胞发生接触的抗原提呈细胞内吞，导致其表征极为困难。本文介绍了构建和使用珠载脂双层（BSLBs）作为抗原提呈细胞（APC）模拟物以捕获和分析这些跨突触颗粒的实验方案。同时描述了细胞表面蛋白密度的绝对定量方法、将生理水平的蛋白密度重组至BSLBs中的技术，以及通过流式细胞术追踪T细胞突触颗粒释放的流程。该方案可适用于研究单个蛋白、复杂配体混合物、病原体毒力因子及药物对T细胞效应输出的影响，包括辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞以及表达嵌合抗原受体的T细胞（CART）。

对免疫突触输出的研究在很大程度上局限于显微镜技术。BSLBs 扩展了可用于研究 T 细胞免疫突触输出的工具集，包括流式细胞术、显微镜、蛋白质组学和 RNA 测序技术。因此，BSLBs 可用于解决多种免疫学问题，并用于鉴定 T 细胞输出的组成及其生化调控机制。这包括例如嵌合抗原受体的研究、抑制特定信号通路的药物，或目的基因的遗传敲除。本方案最关键的步骤之一是优化用于追踪目标跨突触颗粒所需的蛋白质校准和多色流式细胞术检测面板。这需要系统性地调整蛋白质浓度、抗体浓度以及仪器设置。首先，用 1,000 µL PBS 稀释 1 µL 微球溶液。使用血细胞计数板对微球进行计数，并计算每毫升的微球浓度。然后，计算每个滴定点获得 500,000 个最终 BSLB 所需的二氧化硅微球体积。将所需体积的二氧化硅微球转移至一个无菌的1.5毫升微量离心管中。用一毫升无菌PBS洗涤二氧化硅微球三次，并对微球进行离心。制备三份含有最终12.5摩尔百分比含镍磷脂的脂质体母液混合物。使用脂质体母液重悬经洗涤的二氧化硅微球。然后，通过移液枪轻轻吹打总体积的一半进行混匀。采用无菌操作技术，向管中加入氩气或氮气以置换空气，从而在混合过程中保护脂质免受氧化。向0.4毫摩尔的脂质储备液中通入氩气。使用无菌技术储存和操作该储备液。将BSLBs转移至垂直混合器中，在室温下以每分钟10转的转速进行轨道混匀，持续30分钟。随后，使用台式微型离心机在室温下离心15秒，使珠粒沉淀。通过加入1毫升含5% BSA和100 µM硫酸镍的溶液，封闭已形成的BSLBs，以饱和BSLBs上的NTA位点。用HBS-HSA缓冲液洗涤三次，以去除过量的封闭液。取一个新的U型底或V型底96孔板，对蛋白质进行两倍系列稀释。将制备好的BSLB重悬于一定体积的缓冲液中，使100微升HBS-HSA缓冲液中含有500,000个BSLB。然后取另一个U型底或V型底96孔板，将100微升BSLB悬液转移至各孔中，确保每孔含有500,000个BSLB。将第二块板在室温下以300×g离心两分钟。弃去上清液，并将蛋白滴定板中的100微升体积转移至含有沉淀BSLB的板中。轻轻混匀，移液时避免产生过多气泡。用铝箔包裹以避光，并在室温下以1,000 RPM孵育30分钟。然后，用 HBS-HSA 缓冲液洗涤平板三次，每次加入缓冲液后在室温下以 300 × g 离心两分钟。洗涤后计数细胞，并用突触转移实验培养基将细胞稀释至终浓度为每毫升 250 万个。一旦 BSLB 上负载了蛋白质混合物，用 HBS-HSA 缓冲液洗涤 BSLB 两次，以去除未结合的过量蛋白质。将每孔 500,000 个 BSLB 重悬于 200 微升 HBS-HSA 缓冲液中。每孔取 100 微升 BSLB 转移至新的 U 型底 96 孔板中，以制备复孔，使每孔 BSLB 的终数量为 250,000 个。在室温下以 300×g 离心 2 分钟，沉淀 BSLB。弃去上清液，然后用 100 µL T 细胞悬液重悬 BSLB。轻轻混匀以避免产生气泡。将共培养物在 37 °C 下孵育 90 分钟。避免光照，并先将共培养物在室温下孵育至少15分钟以降温。在室温下以500×g离心共培养物5分钟。弃去上清液，并在室温下用不含钙离子和镁离子的含2% BSA的PBS重悬共培养物以进行封闭。将细胞置于冰上45分钟，并避免光照。使用预冷的、经0.22微米滤膜过滤的含2% BSA的PBS作为染色缓冲液，配制抗体主混合液。该主混合液可提供额外的封闭作用。将共培养物在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，然后使用多通道移液器将细胞重悬于含有优化抗体浓度的染色主混合液中。包括同型对照标记的细胞和BSLBs、荧光及非荧光BSLBs，以及单独染色的细胞和BSLBs。通过上下吹打一半体积的方式轻轻混匀。置于冰上避光孵育30分钟。使用预冷的含2% BSA的PBS缓冲液将细胞和BSLBs洗涤两次，随后在4°C条件下以500 × g离心5分钟。离心后，检查沉积在孔底部的共培养物。然后将洗涤后的共培养物重悬于 100 µL PBS 中，并立即上机检测。对侧向散射光启用对数刻度，并对侧向散射光和前向散射光启用飞行时间参数。获取 MESF 标准品，确保其弱荧光组和最强荧光组均处于仪器的线性检测范围内。随后获取补偿样本，计算补偿值，并将补偿矩阵应用于实验。每种定量通道至少采集并保存 20,000 个总 MESF 标准事件。避免使用FACS鞘液或类似溶液重悬MESF微球，因为这些溶液含有会破坏荧光染料的盐类和醇类，导致荧光峰变宽并增加误差。使用高通量进样器进行采集时，将仪器采集模式设为标准模式，样本采集体积设为80 µL。样本流速为每秒2至3 µL，混样体积设为50 µL，混样速度为每秒150 µL，每孔混样次数为3至5次。每个样本至少获取 10,000 个单个 BSLB。最后，导出 FCS 文件。此处展示了扁桃体 B 细胞和辅助性 T 细胞表面 ICAM-1 的定量流式细胞术测量示例。代表性图像描述了分析从人腭扁桃体中分离的单个 CXCR5 B 细胞和滤泡辅助性 T 细胞的设门策略。该连续设门策略可识别连续采集时间窗口内的单个活细胞事件。此处展示了双联体、ICAM-1 的细胞表面表达水平与相应同型对照的 FMO 对照，以及用相关同型抗体标记的细胞群的 FMO 对照。此处展示了在重叠的MESF群体直方图中，对不同标准MESF群体的门控及MFI测量结果。这些数值代表了每个五个MESF群体的MFI值。同时展示了MESF群体中MESF相对于cMFI的线性回归结果。该斜率从扁桃体B细胞在TFH中表面ICAM-1的流式细胞术数据中提取结合到细胞上的MESF。转换为绝对分子密度需执行以下简单的数学运算。代表性图像显示了用密度递增的重组单体ICAM-1（12个组氨酸）重建的BSLBs的流式细胞术分析结果。此处展示了 ICAM-1 参考浓度与实测密度的回归分析结果。利用该回归斜率可计算实现细胞密度所需的靶蛋白浓度。流程图展示了 T 细胞与 BSLB 共培养、重建模型膜以及后续通过流式细胞术检测颗粒转移的关键步骤。用于在连续采集时间窗口内识别单个BSLB和细胞的设门策略如图所示。本方案中最重要的方面之一是，为了保证实验结果的可重复性，每次更换蛋白质或脂质储备液时，都需要进行新的校准分析。为了发现不同T细胞亚群分泌的新有效分子，还可通过荧光激活细胞分选对BSLB进一步分离，并进行转录组和蛋白质组分析。牛津大学的同事们已利用该技术研究并证实了新的受体-配体相互作用，同时还研究了基因敲除对T细胞免疫突触输出的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

制备珠状支持脂质双分子层研究T细胞免疫突触的颗粒输出

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。本文中，我们展示了将已知可调控突触形成的细胞黏附蛋白锚定于脂质双层膜上层，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察突触形成的方法。...

用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

本视频介绍了在涂有脂质双层的微球上研究 septin...

球形支撑脂双层实验：一种在微球上观察Septin组装的技术

本视频展示了一种在支撑脂质双层（SLB）上可视化自然杀伤（NK）细胞免疫突触形成的实验技术。首先，将荧光标记的NK细胞活化受体配体与SLB结合，随后加入NK细胞进行孵育。接着，对细胞进行聚合肌动蛋白和含穿孔素的杀伤颗粒染色。该方法可利用受激发射损耗（STED）显微镜实现对突触形成过程的可视化观察。...

在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

一种用于研究T细胞与支撑性平面脂双层相互作用的体外技术

本视频展示了通过珠载脂质双层膜重建合成抗原呈递细胞的方法，及其在评估活化T细胞所产生突触输出中的应用。...

利用珠载脂质双层研究T细胞的突触输出

支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。...

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。...

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。...

支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

本方案描述了一种利用平面脂质双层研究原代多克隆人T细胞形成突触界面能力的技术。我们采用该技术展示了来源于淋巴结和外周血的人原代T细胞在突触形成能力上的差异。...

外周血和淋巴组织来源的人原代T细胞突触界面评估

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

了解利用珠状支持脂质双分子层研究T细胞免疫突触颗粒输出的方法。该方案通过优化蛋白质校准和多色流式细胞术，帮助研究人员深入分析T细胞输出的生化调控机制。

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

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