Name: 通过水射流技术注射猪脂肪组织衍生的基质细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解无针水射流技术用于猪脂肪组织基质细胞注射的方法。该技术可实现精准递送，评估细胞活力与弹性，为细胞治疗和再生医学提供微创新方案。

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感谢原始出版物的共同作者们提供的帮助与支持。

猪的脂肪组织样本由图宾根大学实验外科研究所提供。所有实验程序均获得当地动物福利主管部门批准，实验动物许可编号为CU1/16。
1. 猪脂肪组织来源基质细胞的分离
<ol>
	<li>将来自实验外科研究所的猪脂肪组织置于50 mL离心管中运送至实验室。</li>
	<li>在无菌操作台内将组织转移至无菌培养皿中，使用两把手术刀（10号）将其切碎成小片段并捣成糊状。 
	注意：也可使用剪刀来获得小片段。片段越小，越有利于后续消化。
	<ol>
		<li>将切碎的组织片段/糊状物转移至50 mL离心管中，加入5 mL消化液，在37 °C摇床中孵育30分钟。消化液成分为含1%牛血清白蛋白（BSA）（储存液：1 % (w/v) BSA溶于PBS）和0.1% I型胶原酶的PBS溶液。 
		注意：消化液需现配现用。摇床采用圆周振荡模式，转速为25–500 rpm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为终止孵育，加入10 mL生长培养基[DMEM低糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose, DMEM-LG）、2.5% HEPES钠盐溶液（1 M）、10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺（200 mM）、1%青霉素-链霉素（10000 U/mL青霉素；10,000 µg/mL链霉素）和1%两性霉素B（250 µg/mL）]。 
	注意：生长培养基可预先配制。在细胞培养用培养基制备过程中，抗生素和抗真菌药物对于防止污染至关重要。</li>
	<li>将离心管在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>用10 mL移液器吸取含有脂肪细胞的上清液（因密度较低而浮于液体上层），弃去。</li>
	<li>将剩余的基质部分通过带有无重金属聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的100 µm细胞筛过滤，以截留脂肪组织碎片，仅获得细胞悬液。</li>
	<li>将过滤后的细胞悬液在室温下以630 × g离心7分钟。</li>
	<li>用2 mL PBS重悬细胞沉淀，洗涤细胞一次。</li>
	<li>再次将细胞悬液在室温下以630 × g离心7分钟。</li>
	<li>离心后，将细胞沉淀用每瓶10 mL生长培养基重悬，接种至75 cm2细胞培养瓶中。 
	&#8203;注意：根据PBS洗涤后细胞沉淀的大小，可将细胞接种至1至4个培养瓶中。</li>
</ol>
2. 猪脂肪组织来源基质细胞的培养
<ol>
	<li>当细胞达到70%融合度时，进行收获和传代。</li>
	<li>用10 mL PBS洗涤细胞两次，并彻底吸除PBS。 
	注意：此步骤旨在去除残留的生长培养基，后者含有10%胎牛血清（FBS）。FBS中含有多种蛋白酶抑制剂，可能影响后续胰蛋白酶消化的效果。</li>
	<li>每瓶加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞脱落。</li>
	<li>将培养瓶置于37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞是否已脱落。 
	注意：有时细胞脱落需要更长时间，此时可将培养瓶在37 °C继续孵育，最长不超过5分钟。</li>
	<li>加入3 mL生长培养基以终止孵育和消化过程。 
	注意：如上所述，生长培养基中含有10% FBS，其中的蛋白酶抑制剂可中止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将脱落的细胞转移至离心管中，在室温下以630 × g离心7分钟。</li>
	<li>用10 mL生长培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>以每75 cm2培养瓶接种3 × 105个细胞的密度进行接种。</li>
</ol>
3. 使用钙黄绿素-AM 标记细胞
注意：注射到尸体组织中的细胞使用绿色荧光膜通透性活细胞染料和红色荧光膜不通透性活力指示剂进行染色，以确认所提取的细胞与注射的细胞一致，而非尿道组织碎片。
<ol>
	<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
	<li>每 75 cm2 培养瓶中加入 5 mL 染料溶液。染料溶液由含 2 µM 绿色荧光膜通透性活细胞染料和 4 µM 红色荧光膜不通透性活力指示剂的培养基组成。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除并弃去染料溶液。</li>
	<li>再次用 10 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入培养基，并通过荧光显微镜记录绿色和红色荧光信号。
	<ol>
		<li>将 75 cm2 培养瓶置于显微镜载物台上，使用 10x 物镜，选择无荧光滤光片，并确保透射光路处于激活状态。 
		注意：这些步骤均需在显微镜上手动操作。</li>
		<li>与步骤 3.6.1 同时，打开软件程序。</li>
		<li>在 Locate 选项卡下点击 Live 按钮，以获取载物台上培养瓶中细胞的实时图像，并使用粗调和微调旋钮对焦。 
		注意：当 Live 按钮被激活后，右侧视野将显示实时图像。</li>
		<li>在子选项卡 Microscope Components 中，选择正确的物镜（10x）。</li>
		<li>在子选项卡 Camera 中，勾选 Auto Exposure。</li>
		<li>点击 Snap 按钮，拍摄第一张透射光图像。</li>
		<li>通过菜单栏中的 Graphics 选项卡并选择 Scale Bar，插入比例尺。</li>
		<li>通过菜单栏中的 Files 选项卡并选择 Save as czi，保存图像。</li>
		<li>为拍摄荧光图像，将滤光片更换为适用于绿色或红色荧光的滤光片，并选择反射光路。 
		注意：这些更改必须在显微镜上手动完成。</li>
		<li>再次在 Locate 选项卡下点击 Live 按钮，以获取细胞的实时图像。</li>
		<li>点击 Snap 按钮，拍摄第二张图像，分别采集绿色或红色荧光信号。</li>
		<li>通过菜单栏中的 Graphics 选项卡并选择 Scale Bar，插入比例尺。</li>
		<li>通过菜单栏中的 Files 选项卡并选择 Save as czi.，保存图像。</li>
		<li>对另一荧光通道重复步骤 3.6.9 至 3.6.13。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 准备尿道组织样本用于注射
<ol>
	<li>从猪体内解剖出尿道及其相连的膀胱。 
	注：实验所用尿道组织样本取自成年雌性长白猪的新鲜尸体样本。</li>
	<li>将样本置于装有湿冰的袋子中运送至实验室。 
	注：样本在进一步处理前应始终保持在冰上。未向样本中添加任何添加剂。</li>
	<li>将带有膀胱的尿道放置于一块海绵上，以模拟骨盆底的弹性。
	<ol>
		<li>利用膀胱来确定尿道的方向（近端、远端、背侧和腹侧）。此方法可行的原因在于输尿管以及固定膀胱于腹腔和骨盆腔内的三条韧带具有特定的解剖位置。这三条韧带包括位于膀胱两侧的两条膀胱侧韧带（vesicae lateralia ligaments）和起源于膀胱腹侧表面的膀胱中韧带（vesicae medianum）（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>借助导管从背侧纵向切开尿道。</li>
	<li>按照后续章节所述方法将细胞注射到打开的尿道中。</li>
</ol>
5. 使用Williams针在液体和组织样本中进行细胞注射
<ol>
	<li>按照步骤2所述收获细胞。</li>
	<li>与步骤2.9不同，将注射用细胞密度调整为每毫升2.4 × 106个细胞。 
	注意：若将细胞注射至组织样本中，请使用绿色荧光、可穿透细胞膜的活细胞染料对细胞进行标记。</li>
	<li>用注射器吸取细胞悬液，并连接Williams膀胱镜注射针（WN）。</li>
	<li>将针头置于含有2 mL培养基的15 mL离心管液面上方不远处，或插入打开的尿道组织中。两种情况下均手动注入250 µL细胞悬液。 
	注意：注入尸体尿道的细胞会形成注射隆起（注射丘）。</li>
	<li>对于注入培养基中的细胞，直接通过离心收集：室温下630 × g离心7分钟。</li>
	<li>对于注入尸体尿道的细胞，使用连接在注射器上的18G针头从注射隆起中抽吸回收细胞。</li>
	<li>将注射后回收的细胞转移至离心管中，并与注入培养基的细胞相同，于室温下630 × g离心7分钟。</li>
	<li>离心后，两种情况下均将细胞重悬于4 mL培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板测定细胞得率和活力。
	<ol>
		<li>将20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝溶液充分混合。</li>
		<li>取10 µL混合液分别加入血细胞计数板的两个计数室中。 
		注意：两个计数室均需加样并计数，以通过双样本提高统计准确性。</li>
		<li>在显微镜下计数四个角区的方格内的细胞。 
		注意：呈白色亮光（未染色）的细胞计为活细胞，呈蓝色亮光（染色）的细胞计为死细胞。</li>
		<li>计算每毫升细胞数量时，先计算两个计数室的平均值，将该数值除以2，再乘以104。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 通过水射流在液体和组织样本中进行细胞注射
<ol>
	<li>按照步骤2所述收获细胞。</li>
	<li>与步骤2.9和5.2不同，将注射用细胞密度调整为每毫升6 × 106个细胞。 
	注意：向组织样本中注射时，请使用带有绿色荧光、膜通透性的活细胞染料标记的细胞。</li>
	<li>将细胞悬液装入WJ装置的给药单元中。</li>
	<li>将注射喷嘴置于15 mL离心管中2 mL培养基液面上方不远处，或置于打开的尸体尿道组织上方不远处。</li>
	<li>在这两种情况下，均使用设备以高压阶段实现组织穿透，随后以低压阶段进行细胞注射，共注入100 µL细胞悬液。压力设置采用E60-10。 
	注意：注入尸体尿道的细胞会形成注射隆起（injection dome）。</li>
	<li>对于注入培养基中的细胞，直接通过离心收集，室温下630 × g离心7分钟。</li>
	<li>对于注入尸体尿道的细胞，使用连接在注射器上的18G针头从注射隆起中抽吸回收细胞。</li>
	<li>将注射后抽吸获得的细胞转移至离心管中，并与注入培养基的细胞一样，在室温下以630 × g离心7分钟。</li>
	<li>离心后，两种情况均将细胞重悬于4 mL培养基中。</li>
	<li>参照5.10节详细描述的方法，使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板测定细胞得率和活力。</li>
</ol>
7. 原子力显微镜（AFM）对细胞弹性的生物力学评估
<ol>
	<li>样品制备 
	注意：注射后回收的细胞将用于原子力显微镜（AFM）的进一步分析。此外，未注射的细胞作为对照组使用。
	<ol>
		<li>以每皿 5 × 105 个细胞的密度将细胞接种于组织培养皿中。 
		注意：每种实验条件各接种一皿。实验条件包括：对照组、将 WJ 或 WN 注入培养基中的 ADSCs，以及将 WJ 或 WN 注入尸体组织中的 ADSCs。</li>
		<li>将细胞在组织培养皿中于 37 °C 下孵育 3 小时。 
		注意：为避免细胞处于 G1 期或有丝分裂阶段带来的差异，我们在细胞接种后 3 小时进行 AFM 测量。</li>
		<li>在进行 AFM 测量前，立即用 3 mL 不含 L-谷氨酰胺的 Leibovitz L-15 培养基替换原有生长培养基。</li>
		<li>将组织培养皿放入 AFM 设备的样品台中，并开启设定为 37 °C 的培养皿加热器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AFM 准备及悬臂梁校准
	<ol>
		<li>使用专用于液体环境中测量的玻璃块，并将其固定在 AFM 持样架上。 
		注意：玻璃块的上表面必须平整，并与 AFM 持样架平行。</li>
		<li>小心地将悬臂梁放置在玻璃块表面，使探针 A 位于抛光光学平面之上。 
		注意：切勿划伤玻璃块的抛光光学表面，因为划痕可能导致测量中的干扰。探针 A 必须突出于抛光光学平面，否则 AFM 激光无法反射至光电探测器。</li>
		<li>使用镊子添加一个金属弹簧，以稳定悬臂梁在玻璃块上的位置。</li>
		<li>当悬臂梁固定在玻璃块上后，将玻璃块放置在 AFM 头部，并锁紧集成的锁定机构。</li>
		<li>将 AFM 头部安装到 AFM 设备上。 
		注意：弹簧必须朝向左侧才能正确安装。若方向错误，请调整玻璃块位置并重新校准 AFM 头部。</li>
		<li>初始化软件设置，同时打开软件、激光对准窗口和接近参数设置界面。此外，开启步进电机、激光光源和 CCD 相机。</li>
		<li>使用 CCD 相机识别悬臂梁探针 A 的位置。</li>
		<li>使用步进电机功能，降低悬臂梁直至其完全浸入液体介质中。</li>
		<li>当悬臂梁完全被介质覆盖后，使用调节螺丝将激光对准悬臂梁顶部。反射光束必须落在光电探测器中心，信号总和应达到 1 V 或更高，横向和纵向偏转应接近 0。 
		注意：可通过激光对准功能及信号数值监测是否对准中心。若信号值不正确，则需进一步调整。</li>
		<li>现在运行扫描仪的 Approach（接近） 程序，并使用 表 1 中列出的参数。</li>
		<li>当探针到达底部时，按下 Retract（回撤） 按钮，将悬臂梁回撤 100 µm。 
		注意：确保在进行接近操作的区域无细胞附着，否则会影响校准结果。</li>
		<li>根据以下参数设置 Run（运行） 参数：设定点 1 V，拉伸长度 90 µm，速度：5 µm/s，采样率：2000 Hz，延迟模式：恒定力模式。</li>
		<li>点击 Run 按钮，开始校准力-距离曲线测量。 
		注意：在软件中点击 Run 按钮后，将获得一条力-距离曲线。</li>
		<li>在软件中选择所获得校准力-距离曲线的回撤段线性拟合区域，并由软件计算弹簧常数。</li>
		<li>按照 Danalache 等人17 所描述的精确参数和步骤对悬臂梁进行校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量单个细胞的弹性
	<ol>
		<li>通过视觉识别一个细胞并对其进行聚焦。将计算机鼠标光标置于细胞中央。为提高测量精度，应将 AFM 探针定位在细胞核正上方。 
		注意：计算机鼠标用作视觉标记，以确定压痕的目标位置。</li>
		<li>现在聚焦于悬臂梁，并将其移动至鼠标光标所在位置。</li>
		<li>使用 表 2 中给出的参数，点击 Run 开始测量。 
		注意：使用悬臂梁校准所得的设定点参数。此外，每个细胞测量三次，至少测量 50 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理
	<ol>
		<li>按照 Danalache17 之前描述的精确步骤和参数处理数据。</li>
		<li>保存并导出文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>打开统计软件。</li>
	<li>选择 新建数据集 选项。 
	注意：将打开两个文件。一个是 &#34;DataSet&#34;，另一个是 &#34;Output&#34; 文件。</li>
	<li>选择 DataSet 文件，并打开 变量视图 选项卡。</li>
	<li>输入注射部位（采集液体或尸体组织）、类别（对照组、WJ 注射、WN 注射）和弹性模量的数值变量。</li>
	<li>在 数据视图 选项卡中，输入测量得到的弹性模量数据及其对应的注射部位和类别编号。</li>
	<li>通过菜单栏选择 分析 | 描述性统计，然后选择 探索性数据分析 来分析数据。</li>
	<li>将 弹性模量 选为因变量，将 类别 选入因子列表。 
	注意：结果将显示在 &#34;Output&#34; 文件中，包括一个用于结果部分的箱形图。</li>
	<li>要执行统计检验，请在菜单栏的 分析 选项下，选择 非参数检验 中的 独立样本。</li>
	<li>在新打开的文件中，保持 目标 和 设置 选项卡中的默认设置。</li>
	<li>打开 字段 选项卡，将 弹性模量 选为检验字段，将 类别 选为分组变量。</li>
	<li>点击 运行。 
	注意：结果将显示在 &#34;Output&#34; 文件中。本分析执行的是 Mann-U-Whitney 检验。</li>
	<li>将非参数检验的结果添加到探索性数据分析的箱形图中。</li>
	<li>通过在菜单栏中选择 文件，然后选择 保存 来保存文件。</li>
</ol>

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<li>Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Nuclear+Stiffness+on+Cell+Mechanics+and+Migration+of+Human+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393(2020).</li>
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<li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+%28SNAP%29+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5117(2017).</li>
<li>Costa, K. D., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+indentation%3A+implications+for+measuring+mechanical+properties+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).</li>
<li>Stolz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+elastic+modulus+of+porcine+articular+cartilage+determined+at+two+different+levels+of+tissue+organization+by+indentation-type+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86 (5), (2004).</li>
<li>Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+bovine+articular+cartilage+under+microscale+indentation+loading+from+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).</li>
<li>Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unroofing+Method+to+Observe+the+Cytoskeleton+Directly+at+Molecular+Resolution+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27472(2016).</li>
</ol>

作者J.K.、M.D、T.A.、A.S.、W.K. A. 无任何利益冲突需要披露。作者W.L.和M.D.E.是ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen公司的雇员，该公司是本研究所使用的ERBEJet2和WJ原型机的生产商。

在本研究中，我们演示并介绍了一种脐带华通胶（WJ）细胞递送操作的逐步实施方法，并采用一系列定量分析手段评估了WJ递送对细胞特性的影响，包括细胞活力和生物力学特性（即弹性模量，EM）。在进行WJ注射后，所收获细胞中85.9%保持存活。而在进行针头注射（WN注射）后，97.2%的细胞仍维持其活力。因此，WJ递送方法满足了临床应用的一项基本要求：递送后存活细胞比例超过80%18。尽管WJ方法已实现标准化和可重复性，但针头注射递送的效果则高度依赖于注射器和针头的尺寸与喷嘴规格、压力、流速以及实施注射操作的医师本身19。
在活体动物模型中采用 WJ 细胞递送的研究表明，通过调节喷射压力，可使穿透深度适应目标组织，从而适应特定的临床应用需求13,16。在可视控制下对活体动物进行经尿道细胞注射时，约有50%的治疗动物出现细胞错位或丢失20...

尿失禁（UI）是一种广泛存在的疾病，在欧洲人群中的患病率为1.8 - 30.5%1，主要特征是尿道括约肌功能障碍。从临床角度来看，当保守治疗或物理治疗无法缓解患者出现的症状时，通常会考虑手术治疗。
针对括约肌复合体功能障碍潜在再生修复的细胞治疗，正作为一种前沿方法用于尿失禁（UI）病理的治疗2,3。其主要目标是替换、修复并恢复受损组织的生物学功能。在UI的动物模型中，干细胞移植已在尿动力学结局方面显示出良好的应用前景2,4,5。干细胞因其具备自我更新和多向分化潜能，成为理想的细胞候选者，有助于受损组织的再生6。尽管具有广阔的再生潜力，细胞治疗的实际应用仍受到限制，主要在于细胞的微创递送在注射精度和靶区覆盖范围方面仍面临诸多挑战。尽管目前常用的细胞递送方式是通过针头-注射器系统进行注射7，但通常会导致移植后存活细胞数量显著不足，报道的细胞存活率低至1%–31%8。此外，通过针头注射递送细胞还被证实会影响移植细胞在靶组织中的定位、滞留率以及分布情况9,10,11。一种可行且新颖的解决方案是采用无针水射流技术进行细胞递送，以克服上述局限。
水射流（WJ）技术正作为一种新兴方法，可在尿道括约肌内通过膀胱镜在可视控制下实现细胞的高通量递送。12,13WJ 可在不同压力（E = 效应，单位为 bar）下进行细胞递送，压力范围从 E5 到 E8013第一阶段（组织穿透阶段），使用高压力（如 E60 或 E80）的等渗溶液，以松解目标组织周围的细胞外基质，并打开微小的相互连通的微腔。第二阶段（注射阶段），压力在数毫秒内迅速降低（如降至 E10），从而轻柔地将细胞输送至目标组织中。经过这两个阶段的递进式操作后，细胞在被推出时不会受到额外的组织阻力，而是随低压液流漂浮进入充满液体的海绵状区域。13. 在一个 离体 在通过脐静脉注射干细胞至尸体尿道组织的模型设置中，之后可从组织中抽吸并回收存活的细胞，并进一步扩增 体外13尽管Weber等人在2020年的一项研究证明了利用WJ递送无足迹心肌细胞至心肌组织的可行性和适用性14需要牢记的是，WJ 技术仍处于原型阶段。
以下实验方案描述了如何制备和标记猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSC），以及如何通过WJ&#160;技术和Williams膀胱镜针（WN）将这些细胞递送至捕获液和尸体组织中。细胞注射后，通过原子力显微镜（AFM）评估细胞活力和弹性。本方案通过逐步说明，提供了获取可靠数据的清晰而简洁的方法。讨论部分介绍了该技术的主要优势、局限性及未来展望。此处报道的WJ细胞递送方法及后续翻译后分析正在取代传统的针头注射，为靶组织的再生修复提供了稳定的细胞递送框架。在我们近期的研究中，已有证据表明，与传统针头注射相比，WJ递送的细胞定位更精确，且细胞存活率至少相当15,16。

<table><tbody><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner BioOne</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>1 mL BD Luer-LokTM 注射器</td><td>BD Plastik Inc</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Greiner BioOne</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner BioOne</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Corning Incorporated</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>AFM 探头</td><td>(CellHesion 200) JPK</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 数据处理软件</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 软件</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 系统 Cell Hesion 200</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>All-In-One-Al 悬臂梁</td><td>Budget Sensors</td><td>AIO-10</td><td>尖端 A，接触模式，形状：梁&lt;br/&gt; 力常数：0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)&lt;br/&gt; 共振频率：15 kHz (10 - 20 kHz)&lt;br/&gt; 长度：500 &amp;micro;m (490 - 510 &amp;micro;m)&lt;br/&gt; 宽度：30 &amp;micro;m (35 - 45 &amp;micro;m)&lt;br/&gt; 厚度：2.7 &amp;micro;m (1.7 - 3.7 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>两性霉素 B 溶液</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td>250 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>原子力显微镜 (AFM)</td><td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 18G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Gibco</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>悬臂梁</td><td>&amp;nbsp;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td><td>AIO-TL-10</td><td>尖端 A，k &amp;frac14; 0.2 N/m</td></tr><tr><td>C-chip 一次性血细胞计数板</td><td>NanoEnTek</td><td>631-1098</td><td></td></tr><tr><td>离心机：Rotina 420R</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I 型，粉末</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 - 低糖</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Feather 一次性手术刀（No. 10）</td><td>Feather</td><td>02.001.30.010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 钠盐溶液 (1 M)</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜（与 AFM 集成）</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>实验室袋</td><td>Brand</td><td>759705</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基（不含 L-谷氨酰胺）</td><td>Merck</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基（不含 L-谷氨酰胺）</td><td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>BE 17-605C1</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>LIVE/DEADTM 活/死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>本试剂盒中使用 Calcein AM 和 EthD-1。</td></tr><tr><td>显微镜软件：Zen 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜：AxioVertA.1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nelaton 导尿管（女性）</td><td>Bicakcilar</td><td>19512051</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10000 U/ml 青霉素&lt;br/&gt; 10000 &amp;micro;g/ml 链霉素</td></tr><tr><td>与 AFM 配套使用的培养皿加热器</td><td>Bruker</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>与 AFM 配套使用的培养皿加热器</td><td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>统计软件：SPSS Statistics 22</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿 - CellStar</td><td>Greiner BioOne</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>TPP AG</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝 0.4%&lt;br/&gt; 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>水射流设备：ERBEJET2</td><td>Erbe Elektromedizin GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Williams 膀胱镜注射针</td><td>Cook Medical</td><td>G14220</td><td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td></tr></tbody></table>

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

尿失禁（UI）是一种高度常见的疾病，其特征是尿道括约肌功能缺陷。再生医学的分支，特别是细胞治疗，是改善和恢复尿道括约肌功能的新型方法。尽管在临床实践中常规使用针头和注射器注射具有活性的功能细胞，但这些方法存在显著的缺点和局限性。在此背景下，无针水射流（WJ）技术是一种可行且创新的方法，可通过视觉引导的膀胱镜将活细胞注射至尿道括约肌中。在本研究中，我们使用WJ技术将猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSCs）递送至尸体尿道组织，并进一步研究了WJ递送对细胞得率和存活率的影响。我们还通过原子力显微镜（AFM）测量评估了其生物力学特性（即弹性）。结果显示，经WJ递送的pADSCs细胞弹性显著降低。与对照组相比，细胞存活率显著下降，但仍高于80%。

通过两种方法递送细胞后，采用WN方法递送的细胞存活率（97.2 ± 2%，n=10，p&lt;0.002）显著高于使用E60-10参数通过WJ注射的细胞存活率（85.9 ± 0.16%，n=12）（图2）。生物力学评估结果显示：使用捕获液进行WN注射的细胞，其弹性模量（EM；0.992 kPa）与对照组（1.176 kPa）相比无显著差异（图3A）；而WJ注射则导致细胞弹性模量显著降低（0.440 kPa，p&lt;0.001，图3B），降幅达40–50%。尽管在尸体尿道组织中进行的WN注射未引起细胞弹性模量的显著变化（图4A），但在组织样本中进行WJ注射后，弹性模量显著下降（从0.890 kPa降至0.429 kPa；p&lt;0.00，图4B），绝对EM值降低了51%。综上所述，结果表明，虽然WJ细胞递送能够满足临床应用中细胞递送后存活率...

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。

尿失禁（UI）是一种高度常见的疾病，其特征是尿道括约肌功能缺陷。再生医学……

与传统的针头注射相比，水射流注射技术可将活性成分（如液体、纳米颗粒、微粒、包封药物甚至活细胞）更精确地递送至不同靶向组织。微创治疗方法需要通过预先选择注射压力，将药物精确定位在靶向组织的特定预设层次。我们目前的研究重点是针对压力性尿失禁的细胞治疗。然而，该技术已扩展应用于严重心肌梗死后感染性心肌组织的再生。目前，该技术仅能由经验丰富的研究人员或持有执照的医生在临床前研究中应用。由于该技术是为未来的临床应用而开发，因此不适用于常规的实验室操作。首先，将从成年雌性长白猪体内解剖出的带有连接膀胱的尿道放置于一块海绵上，该海绵可模拟下盆底的弹性。然后利用膀胱确定尿道的方向。由于输尿管以及三条韧带的位置关系，膀胱被固定于腹腔和盆腔内，因此可以实现尿道方向的判断。正确放置尿道后，在导管辅助下沿背侧纵向切开尿道。将猪脂肪组织来源的基质细胞密度调整至每毫升2.4 × 10⁶个细胞，用绿色荧光膜通透性活细胞染料对细胞进行标记，然后用注射器吸取细胞悬液，并连接Williams膀胱镜注射针。随后，可将针头悬于15毫升离心管中生长培养基液面以上约2毫升处，或将针头插入开放的尿道组织内。在这两种情况下，手动注射 250 微升细胞悬液。从注射穹顶将细胞注入尸体尿道。通过离心直接收集注入培养基中的细胞。对于注射到尸体尿道中的细胞，使用连接在注射器上的18号针头从注射穹顶中吸出细胞。将吸出的细胞转移至离心管中，通过离心形成细胞沉淀。将两份细胞沉淀均重悬于4 mL培养基中。为确定细胞产量和活力，将 20 微升细胞悬液与 20 微升台盼蓝充分混合。然后将 10 微升该混合液加入血细胞计数板的每个计数室中。在显微镜下计数四个角区方格内的所有细胞。将未染色的白细胞计为活细胞，将染成蓝色的细胞计为死细胞，然后计算每毫升的细胞数量。若通过无针水射流进行注射，需将猪脂肪组织来源的基质细胞密度调整为每毫升6×10⁶个细胞。按照之前的方法进行标记，并将细胞悬液注入无针水射流装置的给药单元中。然后将注射喷嘴置于15毫升离心管中约两毫升培养基液面上方不远处，或置于开放的尿道组织上方不远处，在两种情况下均注入100微升细胞悬液。先使用高压以实现组织穿透，随后采用低压阶段进行细胞注射。注入尸体尿道的细胞会形成注射隆起。通过离心直接收集注入中膜的细胞。对于注入尸体尿道的细胞，需从注射隆起中抽吸出来。将吸取的细胞转移至离心管中，并按照之前所示方法通过离心收集细胞。离心后，用四毫升培养基重悬两个细胞沉淀。将注射后回收的细胞以每皿5 × 10⁵个细胞的密度接种于组织培养皿中。在37摄氏度孵育三小时后，且在进行原子力显微镜（AFM）测量前，将培养基更换为3毫升不含L-谷氨酰胺的Leibovitz L-15培养基。为测量单个细胞的弹性，需先通过肉眼识别一个细胞并对其进行聚焦。然后将计算机鼠标定位在细胞中央，为提高测量精度，将A

injection-porcine-adipose-tissue-derived-stroma-cells-via-waterjet

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过水射流技术注射猪脂肪组织衍生的基质细胞

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem...

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。...

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

本文介绍了一种制备脂肪组织来源的基质血管组分的方案，并将其应用于骨关节炎患者，通过再生类似软骨的组织以改善膝关节功能。...

用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

本文介绍一种通过系列机械处理（包括乳化和多次离心）从脂肪组织中获取基质血管组分的实验方案。...

脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

机械分离的基质血管组分（SVF）与纤维蛋白水凝胶联用，可为具有多种适应症的活性脂肪来源基质细胞提供一种简便且高效的载体，适用于组织工程或伤口愈合等用途。本文介绍了一种用于转化研究和临床应用的机械法SVF（mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建物的制备方法。...

机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。...

脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

本文介绍了一种可将自体脂肪组织转化为多种具有不同理化特性和功能的脂肪组分物质的实验方案。...

创新的脂肪组织分选技术：将脂肪转化为特化组分

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

了解无针水射流技术用于猪脂肪组织基质细胞注射的方法。该技术可实现精准递送，评估细胞活力与弹性，为细胞治疗和再生医学提供微创新方案。

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

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