用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片
2022年4月11日
该协议描述了一种简单的微流控芯片设计和微加工方法，用于在连续食物供应的情况下生长秀 丽隐杆线虫 长达36小时。生长和成像设备还可以在发育过程中对细胞和亚细胞过程进行数天的间歇性长期高分辨率成像。
这种技术的主要优点是动物可以在设备内自由生长，并且可以被捕获以进行高分辨率成像。该设备可以重复使用多次。在制造设备时，清洁度是能够制造无尘设备以避免设备运行过程中泄漏的最重要因素。
在文字处理软件中使用矩形开始为流动层设计图案一，为控制层设计图案二，并在激光绘图仪的帮助下在聚酯基薄膜上打印最小特征尺寸为8微米的光掩模。将硅片切成高度和宽度为 2.5 厘米的正方形片。用20%氢氧化钾清洁一分钟，然后用去离子水冲洗晶片。
将一个晶圆用于流动，另一个用于控制层。用 14 P-S-I 压缩氮气干燥碎片，然后在 120 摄氏度的热板上脱水四小时。冷却后取一块硅片，将其放在旋转编码器的卡盘上，然后打开真空以将晶圆固定到位。
将大约 20 微升六甲基二硅烷放在硅片上，并使用自旋编码器以 500 R-P-M 涂覆 5 秒，然后以 3000 R-P-M 涂覆 30 秒。为了获得特定于流动层的约40微米的均匀光刻胶厚度，请使用自旋编码器在硅晶片上涂覆约1.5毫升负光刻胶5秒，然后2000 R-P-M30秒。用六甲基二硅烷和负光刻胶对硅片重复涂层，以获得特定于控制层的约40微米的均匀光刻胶厚度。
或者，为了将流动层的厚度增加到大约80微米，对于老年动物，用大约1.5毫升的负光刻胶涂覆硅晶片，使用自旋编码器在500 R-P-M下5秒，然后2000 R-P-M涂覆30秒。将先前涂有光刻胶的硅胶片在65摄氏度的热板上烘烤一分钟，然后用95摄氏度烘烤10分钟。冷却后，将软烘烤的硅胶片放在U-V照明器的曝光台上，光刻胶涂层表面朝向U-V灯。
使用200瓦灯将两块分别暴露在U-V下15秒，通过带有图案1和图案2的光掩模，分别获得流动和控制层。如前所述，烘烤两个暴露的硅胶片，涂层朝上。冷却片后，通过将硅胶片浸泡在光刻胶显影液中 20 分钟来显影图案。
一旦图案可见，用纯异丙醇冲洗碎片，然后用氮气轻轻吹干。将硅胶片放在干燥器中，涂层表面朝上。通过将 50 微升纯 T-C-P-F-O-S 倒在载玻片上，将碎片暴露在硅烷蒸气中。
将载玻片放入干燥器内并孵育两个小时。通过将弹性体基料与固化剂混合并在不断搅拌三分钟的情况下，在塑料杯中制作P-D-M-S。将 P-D-M-S 混合物在干燥器中脱气 30 分钟以去除所有气泡。
将控制层硅晶片放入培养皿中，并在硅片上倒入五毫米厚的P-D-M-S混合层。在 P-D-M-S 倾倒过程之后，重复对 P-D-M-S 混合物进行脱气。将带有流动层的硅晶片面向旋转车，施加 200 至 500 毫托的真空压力。
将大约一毫升的 P-D-M-S 倒在硅晶片上。使用旋涂机对其进行编码，以获得大约 80 微米厚的层。用旋涂的 P-D-M-S 烘烤两个硅晶片，并在热空气对流烤箱中以 50 摄氏度的 P-D-M-S 层倒入 6 小时。
冷却后，使用锋利的刀片从控制层周围的硅片上切下五毫米厚的P-D-M-S层，然后将其从硅基板上剥离。在 P-D-M-S 块的储液器上使用 Harris 打孔机打出两个直径约 1 毫米的孔，将固定通道和隔离通道入口连接到气体管线以进行 P-D-M-S 膜偏转。将带有旋涂 P-D-M-S 层的硅片放在图案一上，P-D-M-S 涂层表面朝上放在塑料托盘上。
将带有图案二的冲孔 P-D-M-S 块放在托盘上，模制面朝上。将塑料托盘放在等离子清洁剂内，并通过施加低真空将两个 P-D-M-S 表面暴露在 18 瓦的空气等离子体下两分钟。取出两个等离子处理块，通过将图案一和图案二的等离子处理表面压在一起来轻轻地粘合块。
在热空气对流烤箱中在 50 摄氏度下烘烤粘合图案两个小时。将粘合的器件从烤箱中取出后，将其从具有图案一和图案二的硅晶片中切出，并使用哈里斯打孔机在流动层的入口和出口储液器上打孔。将粘合的 P-D-M-S 块，流动层朝上放在塑料托盘上，并在同一托盘上保持干净的盖玻片。
将盖玻片中的块暴露在 18 瓦空气等离子体下两分钟。调整真空压力以查看紫色腔室。将等离子暴露的P-D-M-S块放在盖玻片上，并在50摄氏度的烤箱中烘烤粘合结构两个小时。
将设备存放在洁净室中，以备将来进行任何实验。拿起设备，将其放在体视显微镜上并连接管子。将微柔性管连接到压缩氮气管和另一端的三通连接器。
将三通连接器中的一管和二管分别连接到隔离膜中的疏水阀。将两个微柔性管连接到三通旋塞阀的两个出口。将两个管子的另一端连接到一个 8 毫米长的 18 号针上。
使用微量移液器通过入口口用M-9缓冲液填充流动层。通过连接到针头的末端用去离子水填充两个试管。将两根针插入连接隔离膜和捕获膜的打孔中。
在14 P-S-I处打开氮气调节器，从一号管转动三通阀，通过控制层中的微流体通道（即捕集膜和隔离膜）将水推入设备。使用三通旋塞阀释放压力，一旦通道充满水并注好底漆。通过流经流道的其他介质去除气泡。
该图显示了P-S-3-2-3-9的图像，该动物生长在微流体芯片内，每8至10小时固定一次以捕获荧光图像。表达模式的变化代表了时间基因调控的一个例子，其中相同的基因在不同的发育阶段在不同的细胞中表达。秀丽隐杆线虫单个 W-D-I-S-5-1 基因型的成像显示，每个 P-V-D 神经元分别在 L-2、晚期 L-2、L-3 和 L-4 发育阶段包括初级、次级和第四级突，具有月经状分支树突结构。
图中比较了P-V-D发育和设备生长的动物，以及在N-G-M平板上生长的动物。蠕虫发育不同阶段的S-P和Q-P数量随着年龄的增长而增加。秀丽隐杆线虫用三毫摩尔左旋咪唑滴剂治疗，以引起高分辨率成像所需的足够麻痹。
当从N-G-M平板上生长的类似分期动物测量并使用琼脂载玻片上的三毫摩尔左旋咪唑成像时，S-P值没有显着差异。此外，两个P-V-C细胞体之间的距离，一个存在于尾部，第二个存在于外阴附近，随着它们在装置中生长的动物和在N-G-M板上生长的动物中分开而增加。该图代表来自微流体装置内生长的动物的触摸受体神经元的高分辨率图像。
蒙太奇代表了连续时间点的整个P-L-M-R神经元过程，突出了线粒体和神经元过程。该图表示总神经元过程长度，观察到该长度以每小时10.4微米的斜率增加。该微制造装置使用在高压氮气存在下偏转的薄P-D-M-S膜来固定并将秀丽隐杆线虫固定到位以进行高分辨率成像。
该程序可以对秀丽隐杆线虫中的细胞和亚细胞过程进行纵向研究，这些过程需要长时间的间歇性观察。
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概述
本协议概述了一种用于在持续食物供应下培养秀丽隐杆蚯蚓（C. elegans）长达36小时的微流控芯片设计和制造方法。它还便于在发育过程中对细胞过程进行长期高分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微流控
- 发育生物学
背景
- 该技术允许秀丽隐杆蚯蚓在设备内自由生长。
- 可以在动物被困时进行高分辨率成像。
- 设备可以多次重复使用。
- 制造过程中保持清洁至关重要，以防止泄漏。
研究目的
- 开发用于研究秀丽隐杆蚯蚓的微流控装置。
- 实现长期持续食物供应和成像。
- 便于观察细胞和亚细胞过程。
使用的方法
- 使用软件中的矩形形状设计流动和控制层。
- 使用激光绘图仪打印光罩。
- 将硅晶圆切割成2.5厘米的正方形。
- 用氢氧化钾清洁晶圆并用去离子水冲洗。
主要结果
- 该设备成功支持秀丽隐杆蚯蚓的生长。
- 在发育过程中实现高分辨率成像。
- 该方法允许多次使用该设备。
- 保持清洁对设备功能至关重要。
结论
- 这种微流控芯片设计对研究秀丽隐杆蚯蚓很有效。
- 它提供持续的食物供应并实现长期成像。
- 该方法可以适应各种发育研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables longitudinal imaging of C. elegans without anesthetic interference, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening workflows. By allowing repeated high-resolution imaging of the same animal over developmental timepoints, it improves predictive confidence in early discovery assays. The system provides a disease-relevant system for studying neuronal growth, vulval development, and dendritic arborization with translational biomarker alignment potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through time-lapse imaging of neuronal process growth and subcellular events in individual animals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by capturing temporal gene regulation patterns and developmental progression without confounding anesthetic effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by maintaining animal health and enabling continuous food supply during extended culture.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent immobilization via elastomeric membrane deflection using nitrogen gas pressure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by imaging dendritic arborization in PVD sensory neurons across L2-L4 stages.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by generating quantitative dependent variable measurements such as neuronal process length increase (10.4 μm/hour).
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by enabling repeated imaging sessions that support mechanistic de-risking and predictive confidence in target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by immobilizing animals for high-resolution imaging of cellular and subcellular events over time.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through time-lapse imaging of developmental phenomena such as vulval formation and neuronal branching.
- Analytics: Enables measurement of dependent variables like neuronal process length and subcellular localization to compare conditions and track progression.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling developmental processes relevant to human neurodevelopment and disease.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability due to cleanable PDMS design and standard worm handling compatibility, reducing per-assay cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through longitudinal imaging, target validation via subcellular resolution, and reduction of mechanistic ambiguity in developmental pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability enabled by single-pressure-line operation and no external valves.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through device reuse, and reduced late-stage biological risk by detecting developmental defects early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative imaging readouts and developmental trajectory alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, photolithography, and PDMS bonding techniques.
- Needs access to spin coaters, UV illuminators, plasma cleaners, and nitrogen gas pressure control systems.
- Demands cross-team standardization of chip preparation, priming, and worm loading protocols for consistent results.
- Requires adaptation considerations when scaling to different worm strains or developmental stages due to channel geometry constraints.
- Practical limitations include the need for dust-free fabrication to prevent leakage and careful handling to maintain membrane integrity during repeated use.
