Name: 用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片制作方法。该装置支持连续供食长达36小时，并可进行高分辨率细胞过程成像，适用于发育生物学和神经科学研究。

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感谢NCBS的CIFF成像中心提供共聚焦显微镜的使用权限，该设施由印度科技部纳米技术中心（DST - Centre for Nanotechnology，项目编号：SR/55/NM-36-2005）资助。感谢DBT（SPK）、CSIR-UGC（JD）、DST（SM）、DBT（SM）提供的研究经费，转盘共聚焦显微镜由DAE-PRISM 12-R&amp;#38;D-IMS-5.02.0202（SPK和Gautam Menon）资助，以及HHMI-IECS资助项目编号55007425（SPK）。HB101、PS3239 和 wdIs51 菌株由秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。S.P.K. 在Mike Nonet实验室构建了jsIs609菌株。

1. 生长与成像装置的制备
<ol>
	<li>SU8模具制备
	<ol>
		<li>使用文字处理软件（或计算机辅助设计CAD软件）中的矩形形状设计图案1（流体层）和图案2（控制层），并通过激光绘图仪将光掩模打印在聚酯基薄膜上，最小特征尺寸为8 µm（图1）。</li>
		<li>将硅片切割成2.5 cm × 2.5 cm的片状，并用20% KOH清洗1分钟。随后用去离子水（DI水）冲洗硅片。分别取一片硅片用于流体层和控制层。 
		警告：KOH具有腐蚀性，操作时应小心谨慎。</li>
		<li>用14 psi的压缩氮气吹干硅片，然后在热板上于120 °C下脱水4小时。在进行下一步之前，将两片硅片冷却至室温。</li>
		<li>取其中一片硅片，放置于匀胶旋涂仪的卡盘上，并开启真空以固定硅片。在硅片表面滴加约20 µL六甲基二硅氮烷（HMDS），使用旋涂仪以500转/分钟（rpm）旋转5秒，随后以3,000 rpm旋转30秒进行涂覆。 
		警告：此步骤应在黄光下进行。室内禁止使用白光。</li>
		<li>为获得约40 µm的均匀光刻胶厚度（专用于流体层，适用于早期幼虫L1至L3阶段的成像），在硅片上使用旋涂仪涂覆约1.5 mL负性光刻胶-1，先以500 rpm旋转5秒，再以2,000 rpm旋转30秒。</li>
		<li>对第二片硅片重复步骤1.1.4和1.1.5，以获得约40 µm的均匀光刻胶厚度（专用于控制层）。</li>
		<li>或者，为使流体层厚度增加至约80 µm以适应较年长的动物，可在硅片上使用旋涂仪涂覆约1.5 mL负性光刻胶-2，先以500 rpm旋转5秒，再以2,000 rpm旋转30秒。该厚度适用于L3阶段至成虫阶段的动物。 
		警告：操作硅片时应仅持握边缘，避免损坏旋涂层。此步骤期间应保持白光关闭。</li>
		<li>将涂有光刻胶的硅片（流体层和控制层）置于热板上，先在65 °C下烘烤1分钟，再在95 °C下烘烤10分钟。烘烤完成后冷却至室温。 
		注意：烘烤后的硅片可在下一步前存放一天。应避光保存，避免暴露于白光下。</li>
		<li>将预烘后的硅片放置于紫外曝光仪的曝光台上，使光刻胶涂层面向紫外灯。分别使用200 W紫外灯通过带有图案1和图案2的光掩模，对两片硅片各自曝光15秒，以分别获得流体层和控制层。 
		警告：佩戴安全护目镜，避免直接暴露于紫外光下。此阶段室内禁止开启白光。</li>
		<li>将两片曝光后的硅片涂层朝上放置，先在65 °C下烘烤1分钟，再在95 °C下烘烤10分钟。在进入下一步前冷却至室温。</li>
		<li>将硅片浸入光刻胶显影液（显影剂与异丙醇按1:3稀释）中显影20分钟。图案显现后，用纯异丙醇（IPA）冲洗硅片，并用14 psi氮气轻轻吹干。 
		警告：此化学处理应在通风良好的环境中进行，避免人体暴露。仅在特征显影并用IPA冲洗后方可使用白光。</li>
		<li>将硅片放入干燥器中，涂层面向上。通过在小塑料杯或载玻片上滴加50 µL纯三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，使硅片暴露于硅烷蒸气中。将杯子或载玻片置于干燥器内，孵育2小时。 
		警告：避免直接接触硅烷蒸气。硅烷蒸气处理必须始终在密闭容器中进行。 
		注意：如有需要，显影后的硅片可在下一步前存放1-2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS芯片制备
	<ol>
		<li>在塑料杯中按10:1的比例混合弹性体基质与固化剂制备PDMS。持续搅拌3分钟，充分混合。混合过程会在PDMS混合物中产生大量气泡。</li>
		<li>将PDMS混合物置于干燥器中脱气30分钟，以去除所有气泡。 
		警告：在将PDMS倒入模具前，必须确保混合物中的气泡完全去除，否则可能导致器件缺陷或功能异常。</li>
		<li>将带有控制层（图案2）的硅片放入培养皿中。小心地在硅片上倾倒约5 mm厚的PDMS混合物，避免产生气泡。</li>
		<li>将PDMS混合物再次置于干燥器中脱气，以去除倾倒过程中新形成的气泡。</li>
		<li>将带有流体层（图案1）的硅片置于旋涂仪卡盘上，施加200-500 mTorr的真空压力以固定硅片。在硅片上滴加约1 mL PDMS，使用旋涂仪以500 rpm旋转5秒，再以1,000 rpm旋转30秒，形成约80 µm厚的PDMS层。</li>
		<li>将两片带有旋涂PDMS层和倾倒PDMS层的硅片置于热风对流烘箱中，在50 °C下烘烤6小时。烘烤完成后，静置至室温冷却。</li>
		<li>使用锋利刀片沿控制层（图案2）区域从硅片上切下5 mm厚的PDMS层，并小心剥离硅基底。</li>
		<li>使用Harris打孔器在PDMS块的储液池处打两个直径约1 mm的孔，用于连接固定通道和隔离通道的入口至气体管线，以实现PDMS膜的形变控制。</li>
		<li>将带有旋涂PDMS层的硅片（图案1，流体层）PDMS涂层面向上，放置于塑料托盘中。将已打孔的PDMS块（图案2，控制层）也放置于托盘中，模制面朝上。</li>
		<li>将塑料托盘放入等离子清洗仪中，在低真空（200-600 mTorr）条件下对两个PDMS表面施加18 W空气等离子体处理2分钟。抽真空至腔体呈现亮紫色为止。此步骤应在低光照条件下进行，以便观察等离子体颜色变化。</li>
		<li>取出经等离子处理的两块PDMS，轻轻按压使图案1和图案2的等离子处理面贴合在一起。将键合后的结构在热风对流烘箱中于50 °C下烘烤2小时。</li>
		<li>从烘箱中取出键合完成的器件。从带有图案1和图案2的硅片上切割下键合器件，并使用Harris打孔器在流体层的进样口和出样口储液池处打孔。</li>
		<li>将键合后的PDMS块（流体层朝上）放置于塑料托盘中。在同一托盘上放置一块洁净的盖玻片（#1.5）。对PDMS块和盖玻片同时进行18 W空气等离子体处理2分钟。调节真空压力以观察到紫色腔体。 
		注意：此步骤应在低光环境下进行，以便观察等离子体颜色变化。清洁盖玻片时，先用IPA清洗，再用14 psi氮气吹干。</li>
		<li>将经等离子处理的PDMS块置于盖玻片上方，将键合结构在50 °C烘箱中烘烤2小时。将制备完成的器件存放于洁净环境中，以备后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS 膜预处理
<ol>
	<li>取设备并将其置于体视显微镜下，连接管路。将一根微柔管（内径约5 mm，外径约8 mm）一端连接至压缩氮气管线，另一端连接三通接头。三通接头的管路1和管路2将分别连接至捕获膜和隔离膜。</li>
	<li>将两根微柔管（内径约1.6 mm，外径约5 mm）连接至三通旋塞阀的两个出口端口，另两端分别连接到一段长8 mm的18 G针头。</li>
	<li>通过入口端口使用移液器向流体层中加入M9缓冲液。通过连接针头的一端向两根管路中充满去离子水。将两根针头插入打孔位置，分别连接隔离膜和捕获膜。</li>
	<li>打开氮气调压阀至14 psi，旋转三通阀使气体通过控制层中的微流控通道（即捕获膜和隔离膜）将水推入装置中，切换至管路1。</li>
	<li>等待水流完全充满通道，确保两个通道内均无气泡存在。当通道完全充满水后，即视为已完成引液（priming）。</li>
	<li>当通道充满水并完成引液后，通过三通旋塞阀释放压力。引液过程可能导致流体层中产生气泡，可通过向流道中通入额外培养基的方式去除气泡。</li>
</ol>
3. C. elegans 的培养与同步化
注意：C. elegans 品系：本研究使用了以下转基因品系 PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)])，用于观察外阴发育32；jsIs609 (mec7p::MLS(线粒体基质定位信号)::GFP)33，用于触觉感受神经元（TRN）发育及线粒体运输成像；以及 wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+))，用于追踪PVD神经发育34。线虫培养与保种均按照标准 C. elegans 实验流程进行35。
<ol>
	<li>培养 秀丽隐杆线虫 在含有线虫生长培养基（NGM）的培养皿中 E. coli 以OP50为食物来源，在22 °C下培养 秀丽隐杆线虫 通过将少量雌雄同体线虫或带有少量线虫的琼脂块反复转移至含有OP50菌苔的新NGM平板上，对菌株进行传代培养。</li>
	<li>3至5天后，检查NGM平板上动物的生长情况 秀丽隐杆线虫 卵。从一个培养皿中收集并转移约30个卵至含有OP50菌苔的新鲜NGM培养皿中。</li>
	<li>为同步用于成像的动物，每隔2小时将培养板中未孵化的卵全部转移至新的培养板，并在22 °C下继续培养。每块培养板上约有15–20个卵孵化。</li>
	<li>在孵化后14-16小时和28-30小时分别选取幼虫2期（L2）和幼虫3期（L3）的动物。将动物转移至微流控装置中进行成像。按照下一节所述添加食物供应，以维持动物在装置内的长期生长和成像实验。</li>
</ol>
4. 生长与成像微流控装置内秀丽隐杆线虫（C. elegans）的培养
<ol>
	<li>将生长与成像微流控装置安装在倒置显微镜上，在连接隔离膜和固定膜后，使用低倍镜（4x 或 10x）观察模式2。确保通道内充满洁净的蒸馏水。</li>
	<li>在无菌条件下，使用10 mL 1 M 柠檬酸钾（pH 6.0）、10 mL 微量金属溶液、3 mL 1 M CaCl2 和 3 mL 1 M MgSO4 配制1 L新鲜S培养基。切勿对S培养基进行高压灭菌。</li>
	<li>实验开始前10分钟，用生长培养基（S培养基）填充流道。避免流道中产生任何气泡。如有需要，可额外通入培养基以去除气泡。</li>
	<li>使用移液器吸取10 µL S培养基，从NGM平板上挑选一个处于所需发育阶段的个体，将其通过入口孔推入流道中。</li>
	<li>使用低倍物镜监测动物在流道中的位置。通过入口或出口通入额外培养基，推动动物并将其定位在两个隔离膜之间的受限区域。</li>
	<li>打开三通旋塞阀，向隔离通道施加14 psi压力，使膜向下压入流道。 
	注：膜部分封闭流道，将动物活动限制在两个隔离膜之间的区域。</li>
	<li>从划线平板上挑取单个 E. coli OP50 菌落，接种至250 mL LB液体培养基（含2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母提取物、1.25 g NaCl，溶于H2O）中。将接种后的培养物在37 °C下过夜培养。</li>
	<li>将500 µL OP50培养物分装至1.5 mL无菌离心管中，将原液及分装样品在4 °C下保存2周。</li>
	<li>在1.3 x g 条件下离心5分钟，收集OP50菌体沉淀。用1 mL新鲜S培养基重悬沉淀（稀释至0.5倍浓度），室温保存3–4天。使用该稀释后的OP50在微流控装置内喂养 C. elegans。</li>
	<li>在入口和出口储液池上方各滴加一滴S培养基，以减少流道中S培养基的蒸发。</li>
	<li>用10 µL移液器吸取稀释后的OP50溶液。将装有OP50溶液的微尖端从移液器上取下，并将其压入入口储液池中。然后将另一支装有10 µL食物溶液的移液器尖端插入出口储液池。</li>
	<li>用手指对尖端头部施加压力，确保食物溶液连续流动且无气隙。每天更换一次装有OP50溶液的移液器尖端，所用溶液不得超过3–4天。</li>
	<li>在两个尖端中额外加入20–30 µL食物溶液。通过向移液器尖端添加或移除食物溶液，调节浓度梯度以推动流道中的动物，并调整动物在捕获膜下的位置以便成像。</li>
	<li>通过明场图像监测细菌流动情况，确保细菌持续通过流道中部分关闭的隔离膜。 
	&#8203;注：若无细菌流动，动物可能会消耗两个隔离膜之间流道区域内的可用细菌。若通道中无细菌或无流动，应更换入口和出口处的两个移液器尖端，替换为装有新配制食物溶液的新尖端。</li>
</ol>
5. C. elegans 固定与成像
<ol>
	<li>C. elegans 在捕获膜下的固定
	<ol>
		<li>在低倍镜下定位生长通道中的单个线虫。调节连接进样和出样储液池的两根微移液管尖端中食物溶液的高度。利用流动通道中的静水压差，将线虫推向所需方向。</li>
		<li>将线虫置于捕获膜的中心位置，并使用低倍物镜（4×）监测其游泳行为。</li>
		<li>转动三通旋塞，缓慢增加捕获通道内的压力。使线虫在捕获膜下沿生长通道边界壁呈伸直姿势被固定。 
		警告：避免以 Z 形或 U 形弯曲的方式将线虫横跨在流动通道中捕获。这会导致线虫身体受到更大的挤压压力，造成永久性健康损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C. elegans 成像及从膜上释放
	<ol>
		<li>将装置搬运并装载到显微镜载物台上。设置倒置显微镜至所需的成像参数，配备所有必要的光学组件（物镜、光源、荧光滤光片和探测器），用于高分辨率明场、微分干涉对比（DIC）或荧光成像（补充图1）。</li>
		<li>采集单张或多张延时荧光图像，以捕捉细胞和亚细胞事件。</li>
		<li>使用60×、数值孔径（NA）为1.4的物镜、波长为488 nm的激光（激光功率7%–10%）、CCD相机，在转盘共聚焦显微镜上对C. elegans神经元进行成像，记录其发育过程中的变化。利用显微镜配套软件进行延时成像，以每秒4帧的速度采集图像（补充图1）。</li>
		<li>图像采集完成后，释放捕获压力，并在低倍镜（4×和10×）下监测线虫的运动行为。保持线虫限制在隔离膜所定义的区域内（实验全程保持隔离膜压力为14 psi）。</li>
		<li>调节两根微移液管尖端中食物溶液的体积，以维持生长通道内缓慢的重力驱动食物流。通过调节进样端和出样端微移液管中食物溶液的液面高度差（通常为1–5 mm）来实现该流动。</li>
		<li>通过观察生长通道中细菌的流动模式，在明场下可视化流体流动。 
		注意：若无流动，线虫会吃掉现有的OP50细菌，通道将变得清晰，数小时后线虫会因饥饿而受损。饥饿的线虫通常会产生较强的自发荧光，在采集延时荧光图像时易于观察到。此类情况会对线虫生理状态产生不利影响，实验中应予以避免。</li>
		<li>在预定时间间隔后重复步骤5.2.1–5.2.3，以对同一线虫个体在多个时间点采集荧光、DIC或明场图像。</li>
		<li>当从同一线虫个体在多个期望时间点完成图像采集后，释放隔离和捕获压力。用M9缓冲液冲洗通道，并通过进样储液池将线虫推出。从储液池中回收线虫，将其转移至新鲜的NGM平板上，进行后续健康监测。</li>
		<li>用M9缓冲液多次冲洗通道以去除细菌。用70%乙醇（用蒸馏水稀释）冲洗流动通道。使用注射器推动空气吹干通道。将装置存放在干燥无尘的环境中，以便将来重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析与统计
	<ol>
		<li>使用FIJI ImageJ软件进行TIFF图像分析。在Fiji ImageJ中打开来自wdIs51线虫的PVD延时图像的TIFF文件。通过选择图像选项卡 &#62; 图像栈 &#62; Z 投影，从显示主分支的Z层栈中提取最佳平面图像。</li>
		<li>浏览整套图像序列，找到能够通过线虫图像帧的重叠区域完整覆盖整个神经突的特定图像帧。从FIJI工具栏中选择插件 &#62; 分析 &#62; 细胞计数器，将弹出一个用于编号不同分支并对每个选定神经元进行计数的窗口。</li>
		<li>选择初始化 &#62; 计数器 &#62; 类型1，然后标记二级分支；再选择类型2并标记四级分支，点击结果窗口查看所有分支的计数（补充图2）。该方法可显示已计数的分支。</li>
		<li>打开下一张重叠图像，继续计数剩余分支。此过程可防止重复计数，确保每个神经突仅被计数一次。识别并计数早期幼虫阶段C. elegans中存在的初级分支总数。对较老线虫的二级和四级神经突图像进行类似分析。 
		注意：成虫阶段存在大量支配体壁肌的神经突，计数可能较为困难。务必确保每个神经突仅被计数一次。</li>
		<li>通过从wdIs51线虫的PVD细胞体（CB）到PVC细胞体（CB）绘制分段线，计算两者之间的距离。对于四龄幼虫（L4）阶段的线虫，细胞体间距较远，使用60×物镜成像时无法在同一视野中同时看到。</li>
		<li>从图像栈中选择重叠图像，使用ImageJ中的图像选项卡 &#62; 图像栈 &#62; Z 投影，覆盖从头到尾的整个线虫长度。沿PVD与PVC细胞体之间的神经突绘制分段线。</li>
		<li>使用ImageJ &#62; 分析 &#62; 测量功能测量所有分段线的长度。将各段长度相加，计算每个时间点PVD与PVC细胞体之间的总距离。</li>
		<li>对于jsIs609线虫中触觉感受神经元（TRNs）的神经突长度分析，将图像载入Fiji。从细胞体到第一个线粒体的中心点，沿后侧微管（PLMs；可通过可溶性GFP观察）绘制分段线，计算该线段长度作为第一段距离值。</li>
		<li>从第一个线粒体中心到第二个线粒体中心绘制分段线。重复此过程，依次连接每对线粒体，直至神经突末端。将所有线段长度相加，计算总神经突长度。</li>
		<li>进行细胞谱系分析时，将所有阴道发育图像载入Fiji，并从多层Z平面的延时图像中提取细胞对焦最清晰的图像。</li>
		<li>数据以均值±标准误（SEM）表示。对于两个以上样本，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）计算统计学显著性；对于两组样本，采用双样本t检验。以p值&#60;0.05（*）、p值&#60;0.005（**）和p值&#62;0.05（ns，无显著性）表示显著性水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying%2C+phenotyping%2C+and+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192(2015).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li>
<li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).</li>
<li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NemaLife+chip%3A+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).</li>
<li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biostable%2C+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+materials+chemistry+B%22%5BJournal%5D)">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li>
<li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices%3A+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+ResearchPart+A%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li>
<li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li>
<li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+PDMS+%28polydimethylsiloxane%29+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PloS One. 7 (12), 51499(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+for+Caenorhabditis+elegans+vulval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells.</a> Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).</li>
<li>Fatouros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Tau+aggregation+in+a+novel+caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).</li>
<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+and+cell-speci+fi+c+expression+pro+fi+ling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
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<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+fates+are+distinguished+by+a+transcriptional+switch+that+regulates+dendrite+branch+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization.</a> Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).</li>
<li>Shrestha, B. R., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+morphogenesis%3A+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li>
<li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-16%2FJIP3+and+UNC-76%2FFEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

S.M. 和 S.P.K. 是一项关于微流控培养与成像装置的待审批专利的发明人（专利申请号 640/CHE/2011）。

本文介绍了一种用于培养的简易微流控装置的制备与使用方案 秀丽隐杆线虫 在持续供应食物的条件下对单个动物在发育过程中进行高分辨率成像的方法已有描述。该 fabrication 过程简单，可在非无菌环境中进行，但 fabrication 步骤中必须保持无尘环境。灰尘颗粒的存在会导致两个结合面接触不良，从而引起键合效果差，并在高压应用时导致装置泄漏 秀丽隐杆线虫 被固定。在所有制备的装置中，95%的装置适用于实验。少数装置（5%）因制备或使用过程中键合不当而失效。通过在无尘环境中进行制备过程，可减少键合失败的情况。&gt; 1,000级洁净室），全球多所学术机构均可提供。为清除流道中的细菌培养物并实现装置重复使用，每次实验后需将酒精通入装置进行冲洗。 
本方案展示了一种采用简单设计的光刻 fabrication 工艺，该设计可轻松修改以适应不同发育阶段和体型的 C. elegans。此外，通过增加流动层和捕获层的尺寸3，该装置设计还可适用于其他模式生物，如斑马鱼和 Drosoph...

Caenorhabditis elegans 已被证明是研究细胞生物学、衰老、发育生物学和神经生物学的有力模式生物。其优势包括通体透明、生命周期短、易于培养、细胞数目恒定、与人类多个基因具有同源性以及遗传背景研究充分，这些特点使得 C. elegans 成为开展基础生物学发现和应用研究的常用模型1,2。通过对单个个体进行反复的长期观察，有助于深入理解细胞的生物学和发育过程。传统方法通常将 C. elegans 麻醉于琼脂垫上并在显微镜下成像。然而，麻醉剂对动物健康产生的不利影响限制了其在长期及重复间歇性成像中的应用3,4。近年来，微流控技术的进步及其在无需麻醉且对 C. elegans 几乎无健康危害的固定方法中的应用，使得对同一个个体育行短时间或长时间的高分辨率成像成为可能。
微流控芯片已被设计用于 秀丽隐杆线虫'5 高通量筛选6,7,8，捕获与分配9药物筛选10,11高分辨率成像下的神经元刺激12，以及对动物的高分辨率成像12,13,14. 还开发了用于固定在载玻片上的超薄微流控片材15长期研究 秀丽隐杆线虫 已使用低分辨率的动物液体培养生长图像来观察其生长情况、钙动力学以及药物对其行为的影响16,17,18,19，其寿命与衰老20长期研究采用高分辨率显微镜来评估突触发育21神经元再生22，以及线粒体添加23长期高分辨率成像及细胞命运与分化追踪已在多通道装置中实现24,25在数小时的时间尺度上，会发生多种细胞及亚细胞事件，需要在个体发育过程中的不同时间点对其进行捕获，以表征该过程中的所有中间步骤，从而理解细胞动态变化 体内为了对器官发生、神经元发育和细胞迁移等生物过程进行成像，需要在多个时间点将动物以相同的方向固定。我们此前已发表了一种高分辨率成像的方案 秀丽隐杆线虫 超过36小时，以确定线粒体沿触觉感受神经元（TRNs）的添加位置23.
本文提供了一种基于微流控技术的重复高分辨率成像方法的实验方案。该装置具有单一流体通道，最适合在每个装置中对单个动物进行重复成像。为了提高通量并同时成像多个动物，可将多个装置连接至同一条压力管线，但需使用独立的三通连接器分别控制每个装置中的单个动物。该设计适用于需要高分辨率延时成像的研究，例如胚胎后发育过程、细胞迁移、细胞器运输、基因表达研究等。然而，对于需要平行培养和成像大量晚期发育阶段动物的应用（如寿命和衰老研究），该技术可能存在局限性。本装置采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体制造，因其具备良好的生物稳定性26、生物相容性27,28、透气性29,30以及可调节的弹性模量31。该双层装置可在微流控通道中实现动物在持续供给食物条件下的生长，并利用氮气驱动PDMS膜压缩来捕获并固定单个C. elegans。本装置是在先前发表的设计基础上的改进版本，其优势在于可在持续供给食物的条件下，在微通道内对同一动物进行长期培养与成像3。新增的隔离膜网络结构以及宽度为2 mm的捕获膜，能够高效地固定处于发育过程中的动物。该装置已被用于观察神经元发育、阴门发育以及感觉PVD神经元中的树突分支形成。动物在装置中生长良好，未见不良健康影响，并可多次被固定，从而便于在个体发育过程中重复成像其亚细胞事件。
整个实验方案分为五个部分。第一部分描述了用于线虫培养和成像芯片的器件制备过程。第二部分描述了如何建立压力系统，以驱动PDMS膜变形，从而固定并分离单个C. elegans。第三部分描述了如何在线虫培养基（NGM）平板上同步C. elegans，以便进行器件成像。第四部分描述了如何将单个线虫加载到器件中，并在微流控器件内培养数天。第五部分描述了如何在多个时间点固定单个线虫，使用不同物镜采集高分辨率图像，并利用Fiji软件进行图像分析。

<table><tbody><tr><td>18 号针头</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td><td>18 号</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-30600-02</td><td>带鲁尔锁的 Masterflex 接头</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Andor Technology</td><td>EMCCD C9100-13no</td><td></td></tr><tr><td>电路板薄膜</td><td>Fine Line Imaging, Colorado, USA</td><td></td><td>设计以每英寸 65,024 点（DPI）打印</td></tr><tr><td>鼓风干燥箱</td><td>Meta-Lab Scientific Industries, India</td><td>MSI-5</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Blue stat 显微镜盖玻片</td><td></td><td>22 mm × 10 克</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Hi media</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harris uni-core 打孔器 1 mm</td><td>Qiagen</td><td>Z708801</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>&amp;nbsp;IKA</td><td>RCT B S 22</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>26895</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>ZEISS</td><td>LSM 5 LIVE</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>Tarsons</td><td></td><td>使用 0.5–10 &amp;micro;L 微量移液器吸头供给食物</td></tr><tr><td>负性光刻胶-1</td><td>Microchem</td><td>SU8-2025</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>负性光刻胶-2</td><td>Microchem</td><td>SU8-2050</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>氮气</td><td>本地供应商</td><td>商用氮气</td><td>气瓶容积为 7 立方米</td></tr><tr><td>PDMS（固化液）</td><td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td><td>&amp;nbsp;Sylgard 固化液</td><td>固化剂</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Praveen Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma, NY, USA</td><td>&amp;nbsp;PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>剃刀和刀片</td><td>Lister 外科刀片</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅弹性体（基底）</td><td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td><td>Sylgard 184 基底</td><td>弹性体基底</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>内径 1.59 mm、外径 3.18 mm 的塑料管</td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>University Wafer, MA, USA</td><td>[100] 晶向，直径 4 英寸</td><td>从直径 100 mm 的晶圆上切割出小片（2 mm &amp;times; 2 mm）</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>SPS-Europe B.V., 荷兰</td><td>SPIN 150</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Perkin Elmer ultra-view VOX 系统</td><td>CSU-X1-A3 N</td><td>该系统配备四种激光（405/488/561/640 nm），并由 Volocity 软件包控制。</td></tr><tr><td>SU8 显影液</td><td>Microchem, MA, USA</td><td>SU8 Developer</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td><td>448931</td><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气有毒</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td><td></td><td>200 瓦准直紫外光源</td></tr><tr><td>Volocity 软件</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td>图像分析</td></tr></tbody></table>

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 已被证明是研究发育和细胞生物学过程的有价值模型系统。理解这些生物学过程通常需要对同一只动物进行长期且反复的成像。传统的在琼脂垫上进行的固定方法会带来较长的恢复时间，对动物健康产生不利影响，因此不适合在长时间内对同一只动物进行重复成像。本文介绍了一种微流控芯片的设计、制备方法以及芯片上的 秀丽隐杆线虫 培养方案，以及对单个动物中发育过程进行长期成像的三个实例。该芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，并键合在盖玻片上，利用氮气驱动弹性膜偏转，从而在玻璃基底上固定动物。实现完全固定后 秀丽隐杆线虫 以无麻醉的方式实现对细胞及亚细胞事件的稳定延时成像。通道结构具有较大的横截面，允许线虫在两个部分密封的隔离膜内自由移动，同时可在持续供给食物的条件下于通道中生长。利用这一简易芯片，可在线虫于通道内生长的过程中，对其发育过程中的多种现象进行成像观察，例如神经元突起生长、阴门发育以及PVD感觉神经元的树突分支形成。该长期培养与成像芯片仅需一条压力管路，无需外部阀门，使用低成本的流体耗材，并兼容标准的线虫操作流程，易于被其他实验室采用 秀丽隐杆线虫.

装置表征： 生长与成像装置由两层通过不可逆等离子体键合技术键合在一起的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层构成（图1）。流体层（图案1）长度为10 mm，高度为40 µm或80 µm，可用于在液体培养条件下培养线虫（图1A）。捕获层（图案2）具有一个宽2 mm的膜结构（图1B），用于在高分辨率成像过程中固定线虫。捕获层的掩膜设计还包含一对隔离膜，用于在连续成像时间点之间限制线虫在流道某一段区域内的移动。该装置的捕获膜结构源自我们先前的成像装置3。当前装置（图1C,L）新增了隔离膜，并将捕获膜的宽度增加至2 mm，从而可在多个时间点高效固定同一只线虫。
为测试该装置，使用微移液器将洁净的蒸馏水注入连接捕获膜的微流控通道中（<strong cl...

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）长达36小时。该生长与成像装置还能够在数天内实现对发育过程中细胞及亚细胞事件的间歇性长期高分辨率成像。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）已被证明是研究发育和细胞生物学过程的有价值模式系统。理解……

该技术的主要优势在于，动物可以在装置内自由生长，并可被捕获以进行高分辨率成像。该装置可多次重复使用。在制作装置时，清洁度是最重要的因素，以确保制备出无尘的装置，避免在装置运行过程中发生泄漏。使用文字处理软件，采用矩形形状设计流体层的图案一和控制层的图案二，并借助激光绘图仪将光掩模打印在聚酯薄膜上，最小特征尺寸为八微米。将硅晶圆切割成高和宽均为2.5厘米的方形片。用20%的氢氧化钾清洗一分钟，然后用去离子水冲洗晶圆。使用一个晶圆作为流体层，另一个作为控制层。先用14 P-S-I的压缩氮气吹干晶圆碎片，然后在加热板上120摄氏度条件下脱水干燥四小时。冷却后，取一片硅片，将其放置在匀胶机的卡盘上，并开启真空以固定晶圆。取约 20 微升六甲基二硅烷置于硅片上，使用匀胶机以 500 转/分钟旋转 5 秒，随后以 3000 转/分钟旋转 30 秒进行涂覆。为获得针对流体层、厚度约为 40 微米的均匀光刻胶层，取约 1.5 毫升负性光刻胶一，使用匀胶机以 500 转/分钟旋转 5 秒，随后以 2000 转/分钟旋转 30 秒，涂覆于硅片上。对第二片硅片重复六甲基二硅烷和负性光刻胶一的涂覆步骤，以获得针对控制层、厚度约为 40 微米的均匀光刻胶层。或者，为了使较年老动物的流动层厚度增加至约80微米，可在硅片上涂覆约1.5毫升的负性光刻胶二，使用旋涂仪以500转/分钟旋涂5秒，随后以2000转/分钟旋涂30秒。将先前涂有光刻胶的硅片置于热板上，在65摄氏度下烘烤1分钟，随后在95摄氏度下烘烤10分钟。冷却后，将软烘后的硅片放置于紫外光照仪的曝光台上，使涂有光刻胶的表面朝向紫外灯。分别将两块样品通过带有图案一和图案二的光掩模，使用200瓦灯泡进行紫外线照射15秒，以分别获得流体层和控制层。将曝光后的两块硅胶样品按先前所述方法烘烤，涂覆层朝上。冷却后，将硅胶样品浸入光刻胶显影液中20分钟，以显影出相应图案。当图案可见后，用纯异丙醇冲洗各部件，并用氮气轻轻吹干。将硅胶部件放入干燥器中，使涂层表面朝上。通过在玻璃载片上滴加50微升纯T-C-P-F-O-S，使部件暴露于硅烷蒸气中。将载玻片放入干燥器中，孵育两小时。在塑料杯中将弹性体基质与固化剂混合，制备PDMS，并持续搅拌三分钟。将PDMS混合物置于干燥器中脱气30分钟，以去除所有气泡。将控制层硅片放入培养皿中，并在硅片上浇注一层5毫米厚的聚二甲基硅氧烷（P-D-M-S）混合液。浇注P-D-M-S后，再次对P-D-M-S混合液进行脱气处理。将带有流体层的硅片置于匀胶机载物台上，并施加200至500毫托的真空压力。在硅片上倒入约一毫升的P-D-M-S。使用旋涂机旋涂，形成约80微米厚的涂层。将经旋涂和直接浇注P-D-M-S的两片硅片置于热对流烘箱中，在50摄氏度下烘烤六小时。冷却后，使用锋利刀片从硅片周围控制层外切割下五毫米厚的P-D-M-S层，并将其从硅基底上剥离。使用Harris打孔器在P-D-M-S块的储液区打两个直径约一毫米的孔，以将固定通道和隔离通道的入口连接至气体管路，用于P-D-M-S膜的形变控制。将带有旋涂P-D-M-S层的硅片放置在塑料托盘上的图案一位置，P-D-M-S涂层面向上。将带有图案二的打孔P-D-M-S块放置在托盘上，使模制面朝上。将塑料托盘放入等离子清洗仪内，施加低真空，用18瓦的空气等离子处理两个P-D-M-S表面，持续两分钟。取出经等离子处理的两个块体，轻轻按压图案一和图案二的等离子处理面，使其紧密贴合在一起。将键合好的图案置于热对流烘箱中，在 50 摄氏度下烘烤两小时。从烘箱中取出键合好的器件后，使用硅片将带有图案一和图案二的部分切割下来，并使用哈里斯打孔器在流体层的进样口和出样口储液池处打孔。将键合好的 P-D-M-S 块体放置在塑料托盘上，流体层朝上，并在同一托盘上放置一块干净的盖玻片。将盖玻片上的块体暴露于18瓦的空气等离子体中处理两分钟。调节真空压力，直至观察到紫色的腔室。将经过等离子体处理的P-D-M-S块体置于盖玻片上，并将键合后的结构放入烘箱中，在50摄氏度下烘烤两小时。将设备存放在洁净的容器中，以备后续实验使用。取出设备，置于体视显微镜下，并连接管路。将一根微柔管一端连接至压缩氮气源，另一端连接三通接头。将三通连接器的管路一和管路二分别连接至隔离膜中的捕集装置。将两根微柔性管连接至三通旋塞阀的两个出口端口。将这两根管的另一端连接至一根长度为八毫米、规格为18号的针头。使用微量移液器通过入口端向流体层中加入M-9缓冲液。通过与针头相连的一端向两根管中加入去离子水。将两根针头插入打孔处，连接隔离膜和捕获膜。打开氮气钢瓶的减压阀至14 psi，转动三通阀从第一根管路通气，使水通过控制层中的微流控通道（即捕获和隔离膜）进入装置。当通道充满水并完成预灌注后，通过三通旋塞释放压力。通过流动通道持续通入额外培养基以去除气泡。该图展示了秀丽隐杆线虫 P-S-3-2-3-9 品系在微流控芯片内生长并每隔 8 至 10 小时被固定以获取荧光图像的结果。表达模式的变化代表了时间依赖性基因调控的一个实例，即同一基因在发育的不同阶段于不同细胞中表达。对秀丽隐杆线虫 W-D-I-S-5-1 基因型个体的成像显示，在 L-2、晚期 L-2、L-3 和 L-4 发育阶段，每个 P-V-D 神经元均呈现出类似烛台的分支状树突结构，分别包含初级、次级、三级和四级分支过程。本图比较了在P-V-D培养基、设备培养的动物以及在N-G-M平板上培养的动物的发育情况。在线虫发育的不同阶段，S-P和Q-P的数量随年龄增长而增加。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）经一滴3毫摩尔的左旋咪唑处理，以引起足够的麻痹，满足高分辨率成像的要求。当使用N-G-M平板培养并在含3毫摩尔左旋咪唑的琼脂载玻片上成像时，来自相似发育阶段动物的S-P值无显著差异。此外，两个P-V-C细胞体之间的距离——其中一个位于尾部，另一个靠近阴门——随着在装置内培养和在N-G-M平板上培养的动物发育而逐渐增大。该图展示了在微流控装置内生长的动物中触觉感受神经元的高分辨率图像。该图像序列展示了 P-L-M-R 神经元突起在不同时间点的完整动态过程，其中突出显示了线粒体和神经元突起。图中曲线表示神经元突起总长度随时间的变化，其增长斜率为每小时 10.4 微米。该微加工装置利用一层薄的 P-D-M-S 膜，在高压氮气作用下发生形变，从而将秀丽线虫（C-elegans）固定在原位，以实现高分辨率成像。该方法可实现对秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞及亚细胞过程的长期纵向研究，适用于需要在较长时间内进行间歇性观察的实验。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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了解用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片制作方法。该装置支持连续供食长达36小时，并可进行高分辨率细胞过程成像，适用于发育生物学和神经科学研究。

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片秀丽隐杆线虫

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