Name: DetectSyn:一种快速、无偏倚的荧光方法，用于检测突触密度的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解DetectSyn荧光检测方法，利用邻近连接技术快速识别突触密度变化。该方法适用于培养神经元和固定组织，为神经科学研究提供高效、无偏倚的突触分析工具。

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本工作由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所R01 NS105005（KRG）和NS105005-03S1（KRG）、美国国防部陆军医学研究与材料司令部W81XWH-14-1-0061（KRG）、美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所R01AA016852、美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所T32AA007565（CFH）、FRAXA研究基金会资助（CFH）以及阿尔茨海默病协会AARG-NTF-21-852843（KRG）、AARF-19-614794-RAPID（KRG）资助&#160;支持。&#160;

从动物中分离细胞和组织的过程遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定，并已获得维克森林大学机构动物护理和使用委员会的批准
注意：本方案适用于已根据特定实验范式和要求进行处理和固定的样品。为演示目的，采用快速抗抑郁治疗诱导的突触形成来展示该突触检测技术6先前在盖玻片上培养、经处理、用4%多聚甲醛（PFA）固定并保存在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中的神经元将用于突出显示 体外 操作步骤。先前切好的海马组织（25 µm 从小鼠获取脑组织切片时，将使用经冰 PBS 和 4% PFA 经心脏灌注并随后保存在防冻剂中的脑组织（厚度为……）。该流程用于展示切片操作步骤。详见11,12 有关如何培养神经元或经心脏灌注啮齿类动物的更多信息，请参见 图1 以获取该实验步骤的图示说明。
<img alt="抗体孵育过程示意图，步骤包括连接、聚合及温度细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63139/63139fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：DetectSyn 检测法的图示说明。在对细胞膜进行通透处理后，Synapsin1 和 PSD95 的一抗会结合到这些突触蛋白上。随后，带有寡核苷酸标签的二抗结合至一抗。如果 Synapsin1 和 PSD95 之间的距离在 40 nm 以内（如突触处），则寡核苷酸之间会发生相互作用，并扩增出荧光标记。该荧光信号可通过标准显微镜成像并进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63139/63139fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 清洗样品
<ol>
	<li>在轨道摇床上，用 500 µL 的 1x PBS + 0.75% 甘氨酸轻轻振荡洗涤样品，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，以去除残留的 PFA 或冷冻保护剂。</li>
</ol>
2. 封闭并通透样本
<ol>
	<li>在1x PBS中配制封闭和通透溶液（10%正常驴血清，0.25% Tween 20），用量需足够用于封闭、一抗和二抗孵育步骤。</li>
	<li>向24孔板中的样品（例如盖玻片或游离切片）加入500 µL封闭和通透溶液。确保每个孔中的样品不同，并做好适当标记，以防止样品混淆。</li>
	<li>将样品在室温（RT）下孵育，培养细胞孵育60分钟，组织切片孵育2小时。使用旋转摇床进行轻柔振荡。</li>
</ol>
3. 在一抗中孵育样品
<ol>
	<li>用封闭缓冲液配制一抗：
	<ol>
		<li>配制突触后密度蛋白95（PSD95；1:500，兔多克隆抗体）、Synapsin1（1:500，鼠单克隆抗体）、MAP2（1:400，鸡多克隆抗体）</li>
		<li>准备一份阴性对照样品，省略其中一种突触相关抗体（例如，不加PSD95抗体）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用塑料巴斯德吸管小心吸除封闭液，尽量彻底去除，但避免扰动细胞或撕裂组织。</li>
	<li>对于培养细胞：
	<ol>
		<li>将大号塑料培养皿用Parafilm膜铺底，用镊子小心将盖玻片转移至膜上。</li>
		<li>小心地在每个盖玻片上加入60 µL一抗溶液，注意避免液体溢出盖玻片边缘。</li>
		<li>为保持湿度、防止样本在孵育过程中干燥，可在小号培养皿中加入超纯水，并将小号培养皿小心放置在盖玻片周围。</li>
		<li>盖上大号培养皿，于室温孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于组织切片：
	<ol>
		<li>在24孔板中，向漂浮的切片中小心加入250 µL一抗溶液。</li>
		<li>盖上孔板，于4 °C在摇床上轻柔振荡孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 洗涤样本，然后与二抗孵育
<ol>
	<li>用封闭缓冲液配制二抗：
	<ol>
		<li>配制驴抗小鼠（1:5）、驴抗兔（1:5）、驴抗鸡（1:400）二抗。</li>
		<li>在此步骤中，可通过制备省略抗小鼠或抗兔二抗的次级分装样本来获得额外的技术对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于培养细胞：
	<ol>
		<li>用镊子小心地将盖玻片上的初抗溶液轻敲至纸巾上，吸除残留液体。</li>
		<li>用镊子小心地将盖玻片转移回其原始的24孔板中，每孔加入500 µL 1x PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于组织切片：
	<ol>
		<li>用塑料巴氏吸管小心移除初抗溶液。尽量彻底清除，但避免撕裂组织。</li>
		<li>加入500 µL 1x PBS</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1x PBS中于旋转摇床上轻柔振荡洗涤样本，每次10分钟，共洗3次。在此期间，将所有洗涤缓冲液恢复至室温。
	<ol>
		<li>在此期间，更换大培养皿中的Parafilm膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于培养细胞：
	<ol>
		<li>用镊子小心地将盖玻片转移回已铺有Parafilm膜的大培养皿中。</li>
		<li>小心地在盖玻片表面加入40 µL二抗溶液。注意避免将二抗溶液溢出盖玻片边缘。</li>
		<li>如有需要，向较小的培养皿中添加更多超纯水，并小心地将小培养皿围绕盖玻片放置。</li>
		<li>盖上大培养皿的盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于组织切片：
	<ol>
		<li>小心地向24孔板中自由漂浮的切片加入250 µL二抗溶液。</li>
		<li>盖上孔板盖子 
		注意：从此时起，应用铝箔包裹板的顶部，以避免样本暴露于光线下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本在37 °C下孵育1小时。</li>
</ol>
5. 连接反应
<ol>
	<li>将连接反应原液用分子级水按1:5比例稀释混匀。</li>
	<li>同第4节操作，小心转移盖玻片，并从切片组织中移除二次混合液。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液A清洗样品
	<ol>
		<li>对于培养细胞，每次5分钟，洗涤2次；对于切片组织，每次10分钟，洗涤2次。两种情况下均使用旋转摇床进行轻柔振荡。</li>
		<li>在此期间，更换大培养皿中的Parafilm膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保持连接酶处于冰上，将其按1:40比例加入第5.1步的连接反应原液中。在将连接酶加入样品前立即完成该稀释步骤。</li>
	<li>同第4节操作，在加入连接酶前，尽可能彻底移除样品中的洗涤缓冲液A。</li>
	<li>对于培养细胞：将盖玻片重新转移回铺有Parafilm膜的培养皿中。向每片盖玻片上加入40 µL连接反应混合液，在盖玻片周围放置盛有少量水的小型培养皿，并盖上大培养皿的盖子。</li>
	<li>对于切片组织：向每个孔中加入250 µL第5.4步制备的连接反应混合液，并盖上培养板盖子。</li>
	<li>将样品在37 °C条件下孵育30分钟。</li>
</ol>
6. 扩增
<ol>
	<li>将扩增原液用分子级水按1:5比例混合。</li>
	<li>与第4节相同，小心转移盖玻片，并从切片组织中去除连接反应混合液。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液A洗涤样品
	<ol>
		<li>对于培养细胞，每次2分钟，洗涤2次；对于切片组织，每次10分钟，洗涤2次。两种情况下均使用旋转摇床进行轻柔振荡。</li>
		<li>在此期间，更换大培养皿中的Parafilm膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将聚合酶加入样品前立即进行此稀释操作。保持聚合酶置于冰上，然后将其稀释
	<ol>
		<li>对于培养细胞，将聚合酶用步骤6.1中的扩增原液按1:80比例稀释。</li>
		<li>对于切片组织，将聚合酶用步骤6.1中的扩增原液按1:40比例稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与步骤4相同，在加入聚合酶前尽可能彻底去除样品中的洗涤缓冲液A。</li>
	<li>对于培养细胞：将盖玻片放回铺有Parafilm膜的培养皿中。向每片盖玻片上加入40 µL来自步骤6.4.1的扩增混合液，在盖玻片周围放置盛有少量水的小型培养皿，然后盖上大培养皿。在37 °C下孵育100分钟。</li>
	<li>对于切片组织：向每个孔中加入250 µL来自步骤6.4.2的扩增混合液，并盖上培养板。在37 °C下孵育2小时。 
	注意：在此期间，准备并标记载玻片。</li>
</ol>
7. 封片
<ol>
	<li>与步骤4相同，小心转移盖玻片，并从切片组织中去除扩增混合液。</li>
	<li>在旋涡振荡器上轻轻振荡，用500 µL洗涤缓冲液B清洗样品，每次10分钟，共清洗两次。</li>
	<li>在旋涡振荡器上轻轻振荡，用500 µL含1%的洗涤缓冲液B清洗样品1分钟。</li>
	<li>对于培养细胞：
	<ol>
		<li>在载玻片上滴加3 µL封片介质</li>
		<li>轻敲盖玻片以去除多余的洗涤缓冲液，然后将盖玻片（细胞面朝下）放入封片介质中。用少量透明指甲油封固盖玻片边缘，使其固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于切片组织：
	<ol>
		<li>小心将一片组织切片转移至预处理的载玻片上，并调整位置使其平展。根据切片大小，在组织切片上滴加5–10 µL封片介质（用量取决于切片大小）</li>
		<li>小心将玻璃盖玻片覆盖在组织切片上，并沿边缘用少量透明指甲油封固，以固定盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下分析前至少等待15分钟，或于-20 °C保存。</li>
</ol>
8. 使用共聚焦显微镜获取数字图像
<ol>
	<li>优化所有处理组样本的采集参数（例如激光功率、增益、偏移量），确保优化过程降低背景噪声并增强信号，同时避免荧光信号强度过度饱和。确定参数后，在所有获取的图像中应用相同的采集设置。 
	注意：以下采集参数可用于尼康A1共聚焦显微镜与尼康NIS-Elements AR软件。</li>
	<li>将载玻片置于载物台上，通过目镜使用DAPI找到样品的焦平面。</li>
	<li>单击以关闭目镜端口 眼接口 并选择光学配置按钮以调整设置。</li>
	<li>调节每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。确保荧光信号不会过度饱和，具体参见步骤8.5-8.6。</li>
	<li>使用荧光信号的伪彩色来监测过饱和现象。在实时图像底部，右键单击标有当前所用荧光通道的标签。</li>
	<li>接下来，选择 通道着色 并选择一种伪彩色，例如 彩虹暗色 以热图样伪彩显示荧光强度。在 Rainbow Dark 模式下，较冷色调表示荧光强度较低，较暖色调表示荧光强度较高。</li>
	<li>当所有荧光通道均优化完成后，右键单击先前选择的光学配置按钮并选择 分配当前相机设置 此按钮。</li>
	<li>验证所选设置是否足以满足每个处理组的随机样本。如果所选设置导致任何样本过饱和，请重复步骤8.4以消除过饱和现象。</li>
	<li>对于培养的神经元，执行步骤 8.10-8.16。</li>
	<li>通过目镜寻找一个树突与其他树突重叠最少的神经元。</li>
	<li>关闭眼孔，使用DAPI通道观察所选神经元的细胞体。双击胞体中心，使神经元位于视野中央。</li>
	<li>使用MAP2通道，通过实时扫描找到MAP2信号的最佳焦平面。</li>
	<li>在……之下 ND采集 标签，单击 保存到文件 并选择一个文件以保存图像 浏览然后，输入文件名。</li>
	<li>在……之下 Z 标签，选择 由范围定义的对称模式 选项。将焦点设置到最佳的 MAP2 层面，然后单击 相对按钮 将此焦平面设置为z轴堆栈的中心。</li>
	<li>设置范围至 5 µm 与 1 µm 步骤，并确保检查 Z轴移动期间关闭主动快门. 在 波长 选项卡，选择之前已配置采集设置的光学按钮名称 光学相干断层扫描然后，单击 立即运行.</li>
	<li>每盖玻片/处理组重复步骤 8.1.10–8.1.15，约 10 个神经元。</li>
	<li>对于组织切片，执行步骤 8.18-8.22。</li>
	<li>通过目镜寻找目标区域。例如，定位海马体的CA1区。</li>
	<li>关闭眼端口，使用MAP2通道通过实时扫描找到MAP2信号的最佳焦平面。</li>
	<li>在……之下 获取 菜单，选择 扫描大图接下来，选择先前已配置采集设置的光学按钮名称 捕获 在打开的面板中选择相应的选项，并确保在此面板中选择正确的物镜。</li>
	<li>在……之下 区域 面板和目镜，使用箭头键设置感兴趣区域的边界。接下来，单击 保存大尺寸图像到文件 并为图像创建保存路径文件名。</li>
	<li>在……之下 设置 面板，确保 多通道捕获 检查后，选择先前已配置采集设置的光学按钮名称 光学相干断层扫描. 
	注意：大图像的z轴堆叠是可行的，但会增加扫描时间。</li>
</ol>
9. 分析
<ol>
	<li>与采集设置类似，使用所有处理组的样本优化阈值设置。确保阈值优化聚焦于降低背景噪声并增强信号，同时避免荧光信号强度过度饱和。确定这些设置后，按照步骤 9.2–9.3 所述，在所有用于分析的图像中应用相同的阈值设置。</li>
	<li>在 ImageJ 中，阈值选项位于菜单 图像 &gt; 调整 &gt; 阈值 下。如果图像具有暗背景，请选择 暗背景 选项。</li>
	<li>接下来，根据先前确定的优化阈值设置，调整阈值的上限和下限，然后点击 应用。</li>
	<li>对于培养的细胞，使用 MAP2 通道和自由手绘感兴趣区域（ROI）工具，为每个神经元（包括树突和胞体）绘制 ROI。对于切片组织，在切片图像内使用自由手绘工具绘制 ROI，以圈定感兴趣的区域（例如海马 CA1 区的辐射层）。</li>
	<li>获取 ROI 的面积。在 ImageJ 中，通过菜单 分析 &gt; 测量 测量面积。</li>
	<li>使用 ImageJ 中的自动检测工具（如颗粒分析）按照步骤 9.7–9.9 检测每个 ROI 内的斑点数量。</li>
	<li>在菜单 分析 &gt; 分析颗粒 中找到颗粒分析选项。首先定义斑点的大小直径，通常为 0.1–3 µm²。</li>
	<li>接下来，从“显示”下拉菜单中选择“叠加掩膜”选项，并勾选“显示结果”选项，然后点击“确定”。</li>
	<li>如果在选定的直径范围内未能检测到斑点，请调整范围，直到该分析能够检测到所有斑点。务必对所有图像使用相同的颗粒分析设置。</li>
	<li>按照步骤 9.11–9.13，将每个 ROI 内的斑点数量除以其对应的 ROI 面积。</li>
	<li>将 ImageJ “结果”弹出窗口中每幅图像的结果复制并粘贴到电子表格中。</li>
	<li>首先确认数据来自哪个文件和样本，然后用 ROI 面积除以斑点数量。</li>
	<li>随后清除 结果 弹出窗口中的数据，并重复步骤 9.2–9.12。</li>
	<li>将结果归一化至对照样本：计算对照样本的结果（斑点数量/ROI 面积）的平均值，然后将所有样本的结果除以该对照平均值，得到归一化结果。此时对照样本的新平均值应等于 1。</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+understanding+of+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

DetectSyn 是一种快速检测方法，利用邻近连接技术检测彼此距离在 40 nm 以内的蛋白质，从而实现对突触形成的检测。该技术改进了现有的荧光检测方法，后者仅能作为突触形成的间接测量手段。DetectSyn 可检测位于彼此 40 nm 范围内（即突触间隙内）的突触蛋白所发生的可量化变化。此外，与其他用于测量突触并被经典视为金标准的技术（如电子显微镜和阵列断层成像）相比，DetectSyn 更具成本效益且耗时更短。
DetectSyn 是一种高度可定制的技术。只要蛋白对之间的距离在 40 nm 以内，任何突触蛋白对均可用于鉴定特定类型突触的形成。尽管这一技术具有广泛的应用前景，但在使用时必须注意对抗体进行验证，包括优化封闭和一抗孵育条件，并需通过其他方法（如免疫荧光）进一步验证实验结果。建议在不使用 DetectSyn 的独立实验中进行这些辅助性验证实验，以减少抗体结合之间的竞争（例如，在同一实验中使用山羊抗 PSD95 和小鼠抗 PSD95 可能因竞争而降低结合效率）。此外，应选择来自不同宿主的一抗，例如山羊抗 PSD95 和兔抗 Synapsin1。若两种一抗来自同一宿主，则...

突触是神经元之间信息传递的基本单位1。同一脑区内的神经元之间存在大量突触，这些突触形成神经回路，介导行为的产生2。突触由一个神经元的突触前终末组成，该终末释放神经递质或神经肽，将信号传递给另一个神经元的突触后受体。突触前信号的总和决定了突触后神经元是否产生动作电位，并将信息传递给其他神经元。
突触病理学（synaptopathology）是指突触的破坏，常见于神经体积减少的疾病和障碍中，例如阿尔茨海默病和重度抑郁症，导致神经回路无法再以最佳状态运行3,4,5。恢复突触密度可能是这些疾病潜在治疗方法起效的基础。例如，最近的研究表明，增加突触数量是快速抗抑郁药物产生行为疗效的机制之一6。为了快速筛选可能治疗突触病理学的方法，研究人员需要能够迅速识别突触数量变化的技术。
目前的方法要么耗时且昂贵（如电子显微镜、阵列断层扫描），要么仅研究突触后变化，而未纳入突触前参与情况（如树突棘分析、免疫荧光/共定位分析）。诸如DiI等染料或GFP等荧光蛋白有助于可视化神经元并表征突触后树突棘。然而，树突棘分析依赖研究人员自定义的比例来确定形态，这可能降低可重复性7。此外，不同类型的树突棘与功能性突触之间的关系仍在探索中8。树突棘的形成可能是短暂的，可能反映突触后可塑性，但这些树突棘可能在与突触前神经元稳定形成突触之前即被消除9。
共定位分析相较于树突棘分析能更准确地反映突触情况，因为可以对突触前和突触后蛋白进行免疫染色。然而，突触蛋白的共定位值可能较低，原因是这些蛋白彼此相邻但并不总是持续重叠。因此，由于蛋白并非完全重叠，共定位技术可能无法准确测量突触形成的改变，从而遗漏重要信息。最后，尽管电子显微镜（EM）和阵列断层成像均可提供高分辨率的突触图像，但二者均耗时较长。电子显微镜还需要专用设备，且研究人员在单次实验中仅能观察较小体积的组织。虽然阵列断层成像能够优雅地在超薄切片上同时筛查多种蛋白，并可与电子显微镜结合使用10，但该技术可能过于耗时费力，不适合需要快速扫描突触形成变化的实验研究。
DetectSyn 是 Duolink 邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）的一种特定应用。PLA 分析可用于普遍检测蛋白质-蛋白质相互作用。DetectSyn 通过扩增位于彼此 40 nm 范围内的标记型突触前和突触后蛋白所发出的荧光信号，实现对突触后结构的间接测量。当突触蛋白之间的距离在 40 nm 以内（例如处于突触间隙中）时，携带 DNA 探针的二抗便会杂交形成环状 DNA。该杂交形成的环状 DNA 可表达荧光探针，随后通过标准的荧光显微镜技术进行扩增与检测（见图 1）。关键的是，与电子显微镜（EM）和阵列断层成像技术相比，该技术无需特殊设备，所需时间与常规免疫组织化学实验大致相同。因此，该技术的可及性使得非高强度研究型机构的研究人员也能参与突触病理学研究。此外，该技术可在单次实验中同时检测多个脑区的突触密度变化，从而更全面地反映疾病或治疗所引起的突触改变。

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>自行配制的 PBS 同样适用。</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>对于组织切片，预灭菌的孔板可能并非必需。</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗 MAP2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>其他透明指甲油同样适用。</td></tr><tr><td>冷块</td><td>Fisher Scientific</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>计算机工作站</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦或荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡 FITC 抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 驴抗小鼠 PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 驴抗兔 MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 原位检测试剂（远红）</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>包含连接反应原液、扩增反应原液、连接酶和聚合酶。</td></tr><tr><td>Duolink 原位封片介质（含 DAPI）</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 原位洗涤缓冲液（荧光）</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td>包含洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B；将洗涤缓冲液 B 用二水合 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释至 1% 得到 1% 洗涤缓冲液 B。</td></tr><tr><td>细头画笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9691026</td><td>可使用貂毛，型号 00 或 000，也可在工艺用品店购买。</td></tr><tr><td>Fisherbrand 盖玻片：矩形</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545MP</td><td>对于已接种在玻璃盖玻片上的培养神经元，无需使用盖玻片。</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015</td><td>对于已接种在玻璃盖玻片上的培养神经元，Superfrost 载玻片可能并非必需。</td></tr><tr><td>冷冻冰箱，-20&amp;deg;C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>例如 NIS Elements、ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>大培养皿，100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>分子级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Synapsin1 抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>工作体积范围为 3 &amp;micro;L 至 500 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>精密镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 PSD95 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab18258</td><td>其他抗体组合经优化后也可能适用。</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>小培养皿，60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

突触是神经元之间进行通讯的位点。神经回路的强度与突触密度相关，而突触的破坏是重度抑郁症（MDD）和阿尔茨海默病等疾病状态的特征。传统研究突触数量的技术包括荧光标记物的基因表达（如绿色荧光蛋白（GFP））、填充神经元的染料（如碳菁染料DiI）以及树突棘标记物的免疫荧光检测（如突触后密度蛋白95（PSD95））。这些间接技术的主要局限在于仅能识别突触后变化。然而，突触是由突触前终末与突触后树突棘共同构成的连接结构。测量突触形成或消除的金标准依赖于耗时的电子显微镜或阵列断层成像技术，这些方法需要专门培训和昂贵设备。此外，仅能评估有限数量的神经元，并以此代表整个脑区的变化。DetectSyn是一种快速荧光技术，可用于检测疾病状态或药物活性引起的突触形成或消除的变化。DetectSyn利用快速邻近连接检测技术，识别相邻的突触前和突触后蛋白，并结合标准荧光显微镜成像，该技术在大多数实验室中均可实现。对所产生的荧光斑点进行荧光检测，可实现实验的快速且无偏倚分析。相较于电子显微镜，DetectSyn能分析更大的区域，而非仅限于少数荧光标记的神经元，因而结果更具代表性。此外，DetectSyn适用于 体外 培养的神经元和固定的组织切片。最后，提供了一种分析该技术所采集数据的方法。总体而言，DetectSyn 提供了一种检测不同处理或疾病状态下突触密度相对变化的流程，相较于传统技术更具可及性。

修改自Heaney等人6的数据用于展示一项预期突触形成增加的实验（详见6以获取更多信息及对机制的深入讨论）。先前研究表明，快速抗抑郁药物需激活抑制性代谢型受体GABAB（γ-氨基丁酸B型受体）才能发挥疗效13。此外，既往数据表明，快速抗抑郁药物可增加突触后标记物14；因此，本研究使用DetectSyn来验证快速抗抑郁药物通过增加突触数量而发挥疗效的假设。
在培养的神经元中，测试了四种条件。首先，如上方面板所示， 图2A，培养的神经元在与实验对照组相同的条件下用溶剂处理。然而，为提供DetectSyn检测的技术对照，省略了PSD95一抗（参见 图1 了解各组分如何对信号产生贡献）。接下来，在对照组中，神经元再次用溶剂处理，但同时加入PSD95和Synapsin1的一抗。随后，培...

DetectSyn 是一种无偏倚、快速的荧光检测方法，可测量不同处理条件或疾病状态下突触（突触前和突触后连接）相对数量的变化。该技术利用邻近连接技术，既可用于培养的神经元，也可用于固定组织。

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

突触是神经元之间进行通信的部位。神经回路的强度与突触密度相关，而突触的破坏是……

DetectSyn 利用邻位连接测定技术，快速识别突触的变化。我们还提供了一套分析结果的实验方案。DetectSyn 的主要优势在于，能够在可分析的大范围组织区域内快速获得结果。首先，使用塑料巴斯德吸管小心吸除封闭液，注意不要扰动细胞。然后，用Parafilm包裹一个大型塑料培养皿内壁。接着用镊子将盖玻片小心转移至Parafilm上。加入 60 微升一抗溶液至盖玻片顶部，确保抗体溶液不会溢出盖玻片边缘。为提供湿度并防止样本在孵育过程中干燥，向较小的培养皿中加入超纯水，并小心将盖玻片置于其中。然后盖上较大的培养皿，于室温下孵育培养的细胞 1 小时。加入一抗孵育后，用镊子小心地将盖玻片上的一抗溶液轻敲至纸巾上，然后将盖玻片转移回盛有500 µL PBS的原24孔板中。随后在轨道摇床上以温和振荡的方式用PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。最后一次洗涤结束后，将盖玻片重新转移回大培养皿中，并在盖玻片上方加入40 µL二抗溶液。盖上培养皿，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。进行连接反应时，在保持连接酶处于冷块中的同时，用连接反应缓冲液将连接酶按 1:40 稀释，并立即向盖玻片中加入 40 微升连接酶混合液。盖上培养皿，将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。扩增时，使用扩增缓冲液在预冷的冰盒上稀释聚合酶1280。然后向盖玻片上加入40微升扩增混合液，将样品在37摄氏度下孵育100分钟。接着进行封片，取三微升封片介质滴加到载玻片上。轻敲盖玻片以去除多余的洗涤缓冲液，将带有细胞的一面朝下放入封片剂中。用少量透明指甲油密封盖玻片四周，以固定其位置。对于切片组织的封片，小心将组织切片转移至预处理的载玻片上，并将其展平。然后在组织切片上滴加 5 至 10 微升封片剂。将玻璃盖玻片覆盖在组织切片上，并用透明指甲油密封盖玻片，操作方法如前所示。使用共聚焦显微镜进行数字成像时，调节每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。确保荧光信号未过饱和。对于培养的神经元，在 ND 采集选项卡中，单击“保存到文件”。然后在“浏览”下选择一个文件以保存图像，并输入文件名。接下来，在 Z 选项卡下选择“由范围定义的对称模式”选项。将焦点置于最佳图像的双平面，然后单击“相对”按钮，将此焦平面设为 z 轴堆栈的中心。接着，将范围设置为 5 µm，步长为 1 µm，并勾选“在 Z 轴移动期间关闭活动快门”。在“波长”选项卡下，选择光学配置中已预先设置好采集参数的光学按钮名称，然后点击“立即运行”。对于切片组织，从采集菜单中选择“扫描大图像”，然后在捕获面板中选择已预先配置好采集参数的光学按钮。同时，在此面板中选择正确的物镜。接下来，在区域面板和目镜下方，使用方向键设置感兴趣区域（ROI）的边界。然后点击“保存大图至文件”，并为图像创建保存路径和文件名。最后，在设置面板中，确保已勾选“多通道采集”。然后在光学配置下选择具有先前设置的采集参数的光学按钮名称。在 ImageJ 中，通过进入图像菜单，点击“调整”，然后选择“阈值”来打开阈值选项。如果图像是暗背景，请选择“暗背景”选项。接下来，根据先前确定的优化阈值设置，调整阈值的上限和下限，然后点击应用。对于培养的细胞，使用 MAP2 通道并结合自由手绘 ROI 工具，为每个神经元（包括树突和胞体）绘制 ROI。对于切片组织，在切片图像内使用自由手绘工具绘制一个包含目标区域的 ROI。然后，通过打开“分析”菜单并点击“测量”来获取感兴趣区域（ROI）的面积。为了检测每个感兴趣区域内的 puncta 数量，使用自动检测工具（如颗粒分析）。在“分析”菜单中选择“分析颗粒”，并定义 puncta 的大小直径。接下来，从显示下拉菜单中选择“叠加掩膜”选项，然后勾选“显示结果”选项并点击“确定”。为了将 puncta 数量除以单个 ROI 的面积，将每个图像的结果从弹出的结果窗口复制并粘贴到电子表格中。明确标注数据所对应的文件和样品，并将 ROI 的面积除以 puncta 的数量。最后，为了将结果归一化至对照样品，需计算对照样品结果的平均值，并将所有样品的测定结果除以该对照平均值。GABAB受体激动剂巴氯芬（baclofen）对于快速抗抑郁药物Ro-256981在体外发挥药效是必需的。突触形成的增加表现为白色斑点数量的增多。在没有巴氯芬的情况下，突触形成未见增加。在体内实验中，腹腔注射速效抗抑郁药后，与生理盐水对照组相比，突触形成有所增加。尽管在技术对照图像中出现了一些 puncta，但它们的大小通常与白色标记所示不同，相较于其他图中较大的 puncta 而言。此外，这些突触斑点的位置并不相同，一些突触斑点出现在胞体内也证明了这一点。DetectSyn 能够识别由于疾病状态或药物处理引起的突触变化。该方法有助于为研究影响突触发育或退化相关疾病的任何领域提供见解。

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科研

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生物化学

DetectSyn:一种快速、无偏倚的荧光方法，用于检测突触密度的变化

谷氨酸能突触可从活动状态转换为沉默状态。我们证明了在分离培养的啮齿类动物神经元中，可通过可固定的FM1-43染料标记来显示活动性突触，同时结合vGluT-1抗体免疫染色以显示所有谷氨酸突触，从而可视化突触前活动状态。...

用光学显微镜研究突触前沉默突触

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。<br...

利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇...

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

我们描述了一种用于培养神经元中突触小泡（SV）循环的光学检测方法。将该方案与双重转染技术结合，可同时表达突触前标记物和目的蛋白，从而定位突触前位点及其突触小泡循环能力，并确定目的蛋白的作用。...

一种用于检测过表达突触前蛋白的培养神经元中突触小泡循环的光学检测方法

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS...

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

了解DetectSyn荧光检测方法，利用邻近连接技术快速识别突触密度变化。该方法适用于培养神经元和固定组织，为神经科学研究提供高效、无偏倚的突触分析工具。

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

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