DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化
2022年7月22日
DetectSyn 是一种无偏倚、快速的荧光检测方法，可测量不同处理条件或疾病状态下突触（突触前和突触后连接）相对数量的变化。该技术利用邻近连接技术，既可用于培养的神经元，也可用于固定组织。
DetectSyn 利用邻位连接测定技术，快速识别突触的变化。我们还提供了一套分析结果的实验方案。DetectSyn 的主要优势在于，能够在可分析的大范围组织区域内快速获得结果。
首先，使用塑料巴斯德吸管小心吸除封闭液，注意不要扰动细胞。然后，用Parafilm包裹一个大型塑料培养皿内壁。接着用镊子将盖玻片小心转移至Parafilm上。
加入 60 微升一抗溶液至盖玻片顶部，确保抗体溶液不会溢出盖玻片边缘。为提供湿度并防止样本在孵育过程中干燥，向较小的培养皿中加入超纯水，并小心将盖玻片置于其中。然后盖上较大的培养皿，于室温下孵育培养的细胞 1 小时。
加入一抗孵育后，用镊子小心地将盖玻片上的一抗溶液轻敲至纸巾上，然后将盖玻片转移回盛有500 µL PBS的原24孔板中。随后在轨道摇床上以温和振荡的方式用PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。最后一次洗涤结束后，将盖玻片重新转移回大培养皿中，并在盖玻片上方加入40 µL二抗溶液。
盖上培养皿，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。进行连接反应时，在保持连接酶处于冷块中的同时，用连接反应缓冲液将连接酶按 1:40 稀释，并立即向盖玻片中加入 40 微升连接酶混合液。盖上培养皿，将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
扩增时，使用扩增缓冲液在预冷的冰盒上稀释聚合酶1280。然后向盖玻片上加入40微升扩增混合液，将样品在37摄氏度下孵育100分钟。接着进行封片，取三微升封片介质滴加到载玻片上。
轻敲盖玻片以去除多余的洗涤缓冲液，将带有细胞的一面朝下放入封片剂中。用少量透明指甲油密封盖玻片四周，以固定其位置。对于切片组织的封片，小心将组织切片转移至预处理的载玻片上，并将其展平。
然后在组织切片上滴加 5 至 10 微升封片剂。将玻璃盖玻片覆盖在组织切片上，并用透明指甲油密封盖玻片，操作方法如前所示。使用共聚焦显微镜进行数字成像时，调节每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。
确保荧光信号未过饱和。对于培养的神经元，在 ND 采集选项卡中，单击“保存到文件”。然后在“浏览”下选择一个文件以保存图像，并输入文件名。
接下来，在 Z 选项卡下选择“由范围定义的对称模式”选项。将焦点置于最佳图像的双平面，然后单击“相对”按钮，将此焦平面设为 z 轴堆栈的中心。接着，将范围设置为 5 µm，步长为 1 µm，并勾选“在 Z 轴移动期间关闭活动快门”。
在“波长”选项卡下，选择光学配置中已预先设置好采集参数的光学按钮名称，然后点击“立即运行”。对于切片组织，从采集菜单中选择“扫描大图像”，然后在捕获面板中选择已预先配置好采集参数的光学按钮。同时，在此面板中选择正确的物镜。
接下来，在区域面板和目镜下方，使用方向键设置感兴趣区域（ROI）的边界。然后点击“保存大图至文件”，并为图像创建保存路径和文件名。最后，在设置面板中，确保已勾选“多通道采集”。
然后在光学配置下选择具有先前设置的采集参数的光学按钮名称。在 ImageJ 中，通过进入图像菜单，点击“调整”，然后选择“阈值”来打开阈值选项。如果图像是暗背景，请选择“暗背景”选项。
接下来，根据先前确定的优化阈值设置，调整阈值的上限和下限，然后点击应用。对于培养的细胞，使用 MAP2 通道并结合自由手绘 ROI 工具，为每个神经元（包括树突和胞体）绘制 ROI。对于切片组织，在切片图像内使用自由手绘工具绘制一个包含目标区域的 ROI。
然后，通过打开“分析”菜单并点击“测量”来获取感兴趣区域（ROI）的面积。为了检测每个感兴趣区域内的 puncta 数量，使用自动检测工具（如颗粒分析）。在“分析”菜单中选择“分析颗粒”，并定义 puncta 的大小直径。
接下来，从显示下拉菜单中选择“叠加掩膜”选项，然后勾选“显示结果”选项并点击“确定”。为了将 puncta 数量除以单个 ROI 的面积，将每个图像的结果从弹出的结果窗口复制并粘贴到电子表格中。明确标注数据所对应的文件和样品，并将 ROI 的面积除以 puncta 的数量。
最后，为了将结果归一化至对照样品，需计算对照样品结果的平均值，并将所有样品的测定结果除以该对照平均值。GABAB受体激动剂巴氯芬（baclofen）对于快速抗抑郁药物Ro-256981在体外发挥药效是必需的。突触形成的增加表现为白色斑点数量的增多。
在没有巴氯芬的情况下，突触形成未见增加。在体内实验中，腹腔注射速效抗抑郁药后，与生理盐水对照组相比，突触形成有所增加。尽管在技术对照图像中出现了一些 puncta，但它们的大小通常与白色标记所示不同，相较于其他图中较大的 puncta 而言。
此外，这些突触斑点的位置并不相同，一些突触斑点出现在胞体内也证明了这一点。DetectSyn 能够识别由于疾病状态或药物处理引起的突触变化。该方法有助于为研究影响突触发育或退化相关疾病的任何领域提供见解。
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概述
DetectSyn 是一种快速荧光检测方法，旨在测量不同处理或疾病状态下突触参与程度的变化。该方法利用邻近连接技术，可应用于培养的神经元和固定组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光检测
背景
- DetectSyn 利用邻近连接扩增技术。
- 该方法可快速识别突触变化。
- 适用于大范围组织区域。
- 提供结果分析的标准操作流程。
研究目的
- 用于测量不同条件下突触数量的变化。
- 提供对突触活动的快速且无偏倚的评估。
- 促进突触生物学及相关疾病的研究。
使用的方法
- 邻近连接杂交技术。
- 荧光成像技术。
- 应用于培养的神经元和固定组织。
- 结果分析方案。
主要结果
- DetectSyn 可提供快速的结果。
- 能够有效分析大范围的组织区域。
- 可量化突触参与程度的变化。
- 结果可用于评估治疗效果或疾病状态。
结论
- DetectSyn 是神经科学研究中一种有价值的工具。
- 它有助于加深对突触变化的理解。
- 该方法的速度和效率是其显著优势。
常见问题
行业应用价值
DetectSyn 通过实现对大面积组织中突触密度变化的快速、无偏定量，解决了神经科学药物研发中的一个关键瓶颈。该技术能力支持中枢神经系统治疗药物的靶点验证和机制去风险化，特别是在突触完整性作为关键生物标志物的抑郁症和神经退行性疾病研究项目中。该方法的可及性和可扩展性增强了从体外模型到临床前组织分析的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化突触前和突触后蛋白的并置关系，直接反映突触的形成或消除，从而实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过无偏检测疾病状态或药物活性所诱导的突触变化，提供功能性靶点验证。
- 预测价值：通过生成与环路水平功能结果相关联的突触密度的定量、代表性数据，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：通过建立培养神经元和固定组织中突触密度的基线指标，为下游筛选准备经过验证的生物系统。
- 可重复性：采用基于阈值的颗粒分析方法，提供单位面积内标准化的定量斑点计数，从而实现在不同实验间对化合物进行可靠评估。
- 可扩展性：支持对大面积组织区域进行高内涵分析，相较于小样本量的电子显微镜方法，可提高统计效能并减少取样偏差。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：与重度抑郁障碍和阿尔茨海默病模型中的突触病理相一致，突触丢失是这些疾病的标志性特征。
- 转化连续性：将体外研究结果与离体组织分析相衔接，通过一致的突触密度读数支持基于风险评估的推进决策。
- 机制性风险降低：明确所观察到的表型效应是否涉及真实的突触重塑，而非间接的神经元变化，从而提高靶点可信度。
流程与工作流整合
DetectSyn 适用于从早期靶点验证到先导化合物发现，再到临床前药效测试的整个发现流程，其中突触密度作为神经元环路完整性的机制性生物标志物。
- 发现生物学：通过直接测量突触的形成或消除作为靶点结合的功能性读出，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：通过定量、无偏倚的突触斑点检测实现检测就绪性，标准化多孔板格式中的突触密度测量。
- 分析：生成相对于对照组归一化的突触密度值（斑点数/面积），提供可在不同条件下评估处理效应的可比较指标。
- 转化研究：将培养神经元数据与固定组织切片相连接，在临床前验证阶段保持突触测量的一致性。
- 企业级复用：作为可在神经科学项目间复用的平台能力，减少重复的方法开发，并支持跨研究的数据比较。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低化合物或疾病模型对突触效应的作用机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的成像、阈值设定和颗粒分析流程，提升实验的标准化程度和可重复性，使大多数实验室均可开展相关研究。
- 战略价值：提供早期具有生物学意义的突触数据，有助于在中枢神经系统（CNS）项目中做出更可靠的“推进/终止”决策，降低后期投入风险。
- 项目组合影响：基于突触密度变化实现风险调整后的优先级排序，突触密度是一种经过转化验证的生物标志物，与重度抑郁症（MDD）、阿尔茨海默病及其他神经精神疾病具有相关性。
实施注意事项
- 需要具备免疫荧光、邻近连接实验操作以及荧光显微镜优化方面的专业知识。
- 依赖于共聚焦成像系统以及ImageJ等图像分析工具，用于基于阈值的斑点检测。
- 为获得可重复的结果，需在不同操作者和实验场所之间对抗体配对、孵育条件和感兴趣区域（ROI）的定义进行标准化。
- 应用于不同模型系统（如原代神经元、诱导多能干细胞来源的神经元、组织切片）时，需验证抗原可及性及信噪比。
- 实际局限性包括对特定突触前和突触后蛋白靶标的依赖性，以及在致密神经网中可能存在的空间位阻问题，如原始文献中关于斑点大小和定位对照所述。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Primary Antibody Incubation
1:29
Sample Washes, Secondary Antibody Incubation, Ligation, Amplification, and Mounting
3:49
Digital Imaging with a Confocal Microscope
5:49
Image Analysis
7:41
Results: Increased Synapse Formation by Rapid Antidepressants in the Presence of GABAB Agonists
8:42
Conclusion
