Name: 使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解实时细胞代谢通量分析技术，用于监测成骨细胞的氧气消耗与细胞外酸化速率，评估ATP生成及线粒体活性。该方法结合代谢抑制剂与软件辅助成像，为骨生物学中的细胞能量学研究提供精准数据支持。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助项目 AR072123 和国家老龄化研究所（NIA）资助项目 AG069795（资助给 ERR）支持。

所有实验程序均依据范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会的指南和批准进行。
1. 试剂的准备与检测设置
<ol>
	<li>骨髓基质细胞的分离与培养（亦可参见前一篇文章）30).
	<ol>
		<li>配制完全α最低必需培养基（αMEM）细胞培养液，通过在含α改良的最低必需培养基中添加10% FBS（胎牛血清）、100 U/mL青霉素和 100 µg/mL 链霉素</li>
		<li>通过修剪0.6 mL微量离心管的末端，使其细胞可通过，并将其插入含有细胞的1.5 mL微量离心管中，以制备骨髓收集管 100 µL 完全αMEM</li>
		<li>使用 CO₂ 处死小鼠2 处理步骤如下：将动物放入 CO2 在密闭容器中持续5%异氟烷麻醉2-3分钟，或直至呼吸停止。小鼠意识丧失后，需等待至少1分钟，再将其从容器中取出并行颈椎脱位处死。</li>
		<li>使用无菌镊子和剪刀，剪开已处死小鼠的下腹部以制造一个小切口。分离小鼠的长骨（股骨、胫骨和髂嵴）。</li>
		<li>修整长骨以去除所有软组织。骨骼清理干净后，从远端和近端各截去约1-2 mm，以形成供骨髓冲洗通过的开口。 
		注意：此操作应谨慎进行，以避免丢失骨髓，同时使其充分冲出。</li>
		<li>将骨骼放入含有 100 µL 加入1×无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）以分离总骨髓。</li>
		<li>通过在10,000 x下离心冲洗骨髓 g 在室温下静置15-20秒。骨髓细胞将沉降至管底。</li>
		<li>重复离心，直至骨腔呈现白色且大部分骨髓成分已被去除。通过轻柔吹打，重悬骨髓混合细胞。</li>
		<li>将一只动物的细胞（包括股骨和胫骨）在75 cm²培养瓶中进行培养2 细胞培养瓶中加入10 mL细胞培养基，置于 37 °C 在含5% CO₂的细胞培养箱中2. 若合并 2-3 只动物的细胞，使用 150 cm2 细胞培养瓶（推荐）</li>
		<li>孵育混合细胞群体24-48小时后，吸除培养基中未贴壁的造血细胞群体，并用1×PBS洗涤贴壁细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓间充质干细胞接种与成骨分化
	<ol>
		<li>用足量的0.25%胰蛋白酶-EDTA（约3-4 mL）处理贴壁细胞，使其刚好覆盖培养瓶表面，随后在37°C下孵育3分钟 37 °C.</li>
		<li>向锥形离心管中加入6-7 mL完全αMEM培养基，通过轻柔吹打重悬贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。将BMSC悬液转移至锥形离心管中。</li>
		<li>移除 a 50 µL 取一份BMSC悬液并加入 50 µL 加入台盼蓝（1:1稀释）。通过移液计数排除染料的活细胞总数 10 µL 将此混合液滴加到血细胞计数板上，并在显微镜下观察。不要计数任何呈蓝色的死亡或不健康细胞（&lt;10% 细胞。</li>
		<li>根据细胞计数，计算为达到终浓度为 2.4 x 10⁵ 所需的含完全 αMEM 的细胞悬液的体积6 细胞/mL，每孔板总体积至少为10 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于细胞呼吸速率测量和条形码识别的Seahorse检测板设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：专为分析仪设计的细胞培养微孔板。（A）标示出四个用于背景校正的孔位A1、A12、H1、H12，这些孔中仅含有检测培养基，不含任何细胞。（B）位于板侧的条形码，用于通过成像读取仪和分析仪扫描识别该板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5" style="margin-left: 40px;">
	<li>将锥形管中的细胞在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，并重悬细胞至所需的终浓度 2.4 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞悬液转移至储液槽中，使用多通道移液器小心地重悬细胞，以确保细胞混合均匀。</li>
	<li>在 96 孔细胞培养微孔板中，每孔接种 2.5 × 104 个细胞，加入 80 µL 完全 αMEM 培养基。背景校正孔（A1、A12、H1、H12）不接种细胞，仅向这四个孔中加入培养基。 
	注意：用于检测的 BMSCs 需接种于专为分析仪和传感器盒设计的 96 孔细胞培养微孔板中。此类板的表面积与常规 96 孔板不同，每孔表面积为 0.106 cm2，约为标准 96 孔板的 40%。最佳接种密度根据细胞类型确定。通常，分析仪可检测每孔 0.5–4 × 104 个细胞。成骨细胞需相互接触以有效分化；因此，选择在 80 µL 完全 αMEM 中每孔接种 2.0 × 104–3.0 × 104 个 BMSCs。</li>
	<li>轻轻振荡微孔板，确保细胞在各孔中均匀分布，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。48 小时后在显微镜下观察细胞生长状态和汇合度。必要时更换细胞培养基。</li>
	<li>根据实验目的，当 BMSCs 达到 60%–80% 汇合度（通常为 48–72 小时）时，更换为成骨细胞分化培养基（完全 αMEM 中添加 5 mM β-甘油磷酸钠和 50 µg/mL L-抗坏血酸），以启动成骨细胞分化。</li>
	<li>若需分析未分化的基质细胞（第 0 天），则继续使用完全 αMEM 培养细胞。</li>
	<li>每隔一天更换一次成骨细胞分化培养基，并在显微镜下观察细胞状态，确保细胞健康，直至检测当天。建议在预定检测时间前 24 小时更换培养基，并保持一致的换液周期（推荐做法）。 
	注意：更换培养基时应将板轻轻倾斜一定角度，避免移液器头与细胞培养板接触，从而防止细胞单层结构被破坏。</li>
</ol>
2. 细胞外通量校准用传感器盒的制备
<ol>
	<li>在进行细胞外实验前，提前将试剂盒中的传感器盒进行水化处理。取出传感器盒（绿色板），并将传感器倒置放置。</li>
	<li>使用多通道移液器，向校准板的每个孔中加入 200 µL 的 H2O。小心地将传感器盒重新放回校准板上，并在室温下孵育过夜。 
	注意：制造商建议将传感器盒在不含 CO2 的 37 °C 培养箱中孵育过夜。然而，此条件下可能发生明显的蒸发。若出现此情况，可改为在室温下孵育传感器盒。此类板的孵育时间应不少于 4 小时，且不超过 72 小时。</li>
	<li>实验当天，弃去校准板中的 H2O，并加入 200 µL 校准液。在开始实验前，将校准板至少孵育 1 小时。</li>
</ol>
3. 实时细胞代谢通量分析仪培养基的制备
<ol>
	<li>使用酚红-free DMEM 培养基（推荐预先调节 pH 至 7.4）进行 BMSCs 的检测。</li>
	<li>通过在 DMEM 培养基中添加 1 mM 丙酮酸钠、2 mM 谷氨酰胺、10 mM 葡萄糖、200 nM 胰岛素和 50–200 µM 油酸-BSA，配制 80 mL 检测用完全培养基。</li>
	<li>将完全检测培养基置于 37 °C 水浴中孵育。</li>
</ol>
4. 传感器盒用化合物的制备
<ol>
	<li>将寡霉素A、鱼藤酮和抗霉素A在冰上解冻。使用前用移液器反复吹打以溶解化合物。</li>
	<li>向每支试管中加入3 mL已配制好的测定培养基，随后加入相应的化合物——试管A：26.4 µL的2.5 mM寡霉素A；试管B：3.1 µL的12.67 mM鱼藤酮 + 4.1 µL的9.4 mM抗霉素A + 30 µL Hoechst染料。</li>
	<li>将这些抑制剂的10倍浓度溶液加入对应的注射孔中。所需注射溶液的终浓度为：2 µM寡霉素A、1 µM鱼藤酮和4.1 µM抗霉素A。 
	注意：Hoechst染料加入最终注射孔中，用于细胞核的荧光染色，以便成像和归一化处理。这些浓度可根据细胞类型进行优化。</li>
	<li>将20 µL上述化合物加入含180 µL测定培养基的细胞中。</li>
</ol>
5. 为检测准备细胞培养微孔板
<ol>
	<li>从 37 °C 培养箱中取出细胞培养微孔板，并在显微镜下观察细胞状态。</li>
	<li>将检测培养基从水浴中取出。</li>
	<li>用 200 µL 检测培养基轻柔地清洗细胞两次，每孔加入 200 µL 检测培养基。 
	注意：在最终加入检测培养基后，微孔板进入分析仪前的时间至关重要。因此，在开始更换培养基前，应确保后续步骤可在 1 小时内完成。</li>
	<li>在显微镜下检查细胞，确保细胞仍贴附于孔底。</li>
	<li>确认 D5 和 E8 孔中的细胞保持贴壁状态并形成均一的单层，未在洗涤过程中被冲走。细胞成像软件将使用这两个孔设置自动对焦和自动曝光。 
	注意：制造商建议将微孔板置于不含 CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 1 小时；若选择自动成像，则可省略此步骤。例如，微孔板成像仪可在封闭腔室内维持相同条件，细胞可在明场下直接成像。</li>
</ol>
6. 实验检测与成像的设置
<img alt="用于细胞代谢数据分析的软件界面，显示代谢过程的模板选项。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：控制器软件。 软件可验证设备是否已连接，并将其设置为37 °C。可根据实验目标，从不同检测类型的模板文件中进行选择，以进一步定制使用细胞外通量分析仪开展的检测。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>在设备旁边的计算机上打开桌面软件。</li>
	<li>检查控制器软件左下角的连接状态。</li>
	<li>进入 Templates ，选择 XF ATP Rate Assay 模板文件或相应的检测模板。</li>
	<li>在屏幕顶部选择 Group Definitions，并定义分组。</li>
	<li>选择 Plate Map Layout，并根据已定义的分组分配孔位。</li>
	<li>核对仪器运行程序，确保所添加的化合物已正确列出，并填写项目信息以便后续参考。</li>
	<li>点击 Run Assay，系统将提示选择结果文件的存储位置。</li>
	<li>选择结果文件的保存位置。</li>
	<li>以检测日期命名文件，然后点击 Start Run。</li>
	<li>将传感器微孔板和工具板放置在托盘上，然后点击 I'm Ready 以开始校准。</li>
	<li>开始校准前，确保已移除微孔板盖，并将传感器微孔板以正确方向放置在工具板上。此步骤需要 10–20 分钟，完成后软件将显示 Load Cell Plate 对话框。</li>
</ol>
7. 获取明场图像
注意：此步骤为可选。若无成像设备，可跳至步骤8。
<img alt="细胞成像装置、荧光/明场扫描仪示意图、细胞计数数据显示、37°C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：细胞成像软件通过计算机与成像读取仪进行通信。 可在检测前后对微孔板中的细胞进行成像，并在检测后获得每孔的细胞计数，用于数据归一化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>在计算机上打开细胞成像软件。</li>
	<li>确保微孔板成像仪已开启，并且端口已连接至计算机。</li>
	<li>检查屏幕左下角的状态栏，确认温度已设置为 37 °C，且连接状态应以绿色高亮显示为就绪。</li>
	<li>扫描微孔板条形码以启动成像过程。</li>
	<li>为细胞板命名，然后点击 保存（此名称将用于保存明场和荧光图像）。点击 执行明场扫描。</li>
	<li>下一个界面为微孔板和扫描菜单，显示成像选项。在开始检测前，选择 开始明场扫描。</li>
	<li>将细胞培养微孔板连同板盖一起放入托盘架中，并将 A1 孔与 A1 标记对齐。点击 关闭托盘。</li>
	<li>下一个界面为明场图像采集界面，同时显示微孔板图谱。点击 扫描所有孔，系统将开始初始化，随后进行 30 至 35 分钟的扫描。</li>
	<li>明场扫描完成后，取出细胞培养微孔板并放入分析仪中进行检测。</li>
</ol>
8. 运行检测
<ol>
	<li>校准完成后，软件将显示加载细胞板对话框。</li>
	<li>单击打开托盘，将工具托盘更换为细胞培养微孔板。确保移除板盖，并将微孔板的A1孔置于正确方向。</li>
	<li>然后，单击加载细胞板以启动检测。传感器盒将保留在分析仪内，用于后续的加样操作。</li>
	<li>等待检测开始，并显示预计完成时间。</li>
	<li>检测完成后，软件将显示卸载传感器盒对话框。单击弹出，并从分析仪中取出细胞培养微孔板。</li>
	<li>小心取出传感器盒，并重新盖上细胞板盖。细胞现已准备好进行荧光成像和细胞计数。</li>
	<li>取出细胞板和传感器盒后，将出现检测完成对话框。</li>
	<li>单击查看结果以打开检测结果文件并立即进行数据归一化处理，或单击主页返回主界面。</li>
</ol>
9. 获取荧光图像并进行归一化处理
注意：此步骤是骨髓间充质干细胞（BMSCs）和成骨细胞标准化的可选但推荐方法。如果缺乏成像设备，则需要采用其他标准化方法，例如蛋白质或DNA的分离与定量。
<img alt="显微镜研究显示微尺度图像上的液滴形成和荧光模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：用于对实验数据进行归一化的成像软件所生成的代表性图像。（A）拼接的明场图像，显示整个孔内细胞的融合情况。（B）拼接的荧光图像，显示经Hoechst染色的成骨细胞细胞核，用于计数细胞数量以对实验结果进行归一化。这些成骨细胞为分化7天后的细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>检测完成后，使用手持式条形码扫描仪扫描平板条形码。如果该平板已成像，则无需重新命名。</li>
	<li>选择 荧光与细胞计数，将细胞板放置在托盘支架上，然后点击 关闭托盘。</li>
	<li>在图像采集窗口中，选择 扫描所有孔 以开始成像。荧光成像扫描整块板大约需要 15–20 分钟。观察绿色对勾标记，以确认扫描已完成。</li>
	<li>通过随机点击若干孔，在成像和细胞成像应用程序中查看荧光图像和细胞计数。 
	注意：屏幕右下角提供一个选项，用于查看被计数的细胞。此选项显示一幅掩膜图像，突出显示被计数的目标对象。</li>
	<li>荧光成像完成后，导出图像以供进一步参考。</li>
	<li>成像与细胞计数完成后，打开 结果 文件并点击 归一化。归一化界面将显示板布局，并提供导入细胞计数的选项。</li>
	<li>点击 导入 ，然后选择 应用，桌面软件将自动使用细胞计数对检测结果进行归一化处理。</li>
</ol>

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<li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer%3A+applications+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22GeroScience%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li>
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<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology+-+Series+A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>XF cell energy phenotype test. , Available from: 
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<li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidative+stress%3A+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).</li>
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<li>XF cell mito fuel flex test. , Available from: 
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<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li>
<li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004(2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22Normalization+of+agilent+seahorse+XF+data+by+in-situ+cell+counting+using+a+BioTek+cytation+5+application+note%22">Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note</a>. , (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实时细胞代谢通量分析仪可用于研究不同条件下细胞的能量代谢。本方案详细阐述了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的高效分离、在适宜细胞培养板中进行培养，以及向成熟成骨细胞分化的步骤，所获得的细胞可用于基于细胞外通量分析仪的多种检测。此外，还详细说明了实时细胞代谢通量检测的关键步骤，包括传感器微孔板的水化、加样孔的加载、检测操作、数据归一化及数据分析。该检测通过评估成骨细胞对不同线粒体和糖酵解抑制剂的反应，以解析细胞的生物能量学特征。本方案针对成骨细胞的细胞类型进行了专门优化，相较于仪器制造商的标准操作流程，提供了更可靠且精确的指导。本方案中的多个参数，包括细胞接种密度、化合物浓度、培养基中外源底物的添加以及缓冲能力等，均需根据特定的细胞类型及其背景进行优化。
细胞外通量分析仪可快速、可靠地检测细胞代谢功能 离体 培养的细胞。与其他生物学检测方法相比，该检测的总时长通常为60至120分钟。仪器通过维持预设的37 °C温度，保持细胞和生理条件的正常状态，从而在降低操作复杂性的同时实现高效且可重复的检测结果。通常在加入抑制剂之前，连续记录三到四次基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸...

成骨细胞形成骨骼的过程伴随着破骨细胞对骨骼的协调性破坏或吸收。成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡，是一种偶联过程，描述了骨转换或骨重塑，这对维持骨骼稳态至关重要。成骨细胞功能障碍会导致骨形成受损，进而引发多种疾病，包括骨质疏松症1,2,3. 离体/体外 骨髓基质干细胞（BMSCs）向成骨细胞前体及成熟成骨细胞分化，随时间推移在培养容器中形成并沉积矿化的骨基质4,5,6成骨细胞介导的骨形成需要大量的细胞能量。研究表明，胶原蛋白的合成与分泌高度依赖于细胞内的ATP:ADP比率；此外，矿化囊泡的运输与分泌过程可能也需要额外的ATP。7,8,9,10,11许多研究人员已经证实，成骨细胞生成过程及成骨细胞功能需要充足的能量供应，以满足骨形成过程中的代谢需求12,13,14,15,16因此，本方法的目标是利用实时细胞代谢通量分析仪，对小鼠原代基质细胞在成骨细胞分化过程中的生物能量状态进行表征。这些技术有助于深入理解骨骼稳态，最终可能为开发改善骨骼疾病的新治疗方案提供依据。
实时细胞代谢通量分析仪可用于测量活体成骨细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），分别对应线粒体ATP生成和糖酵解ATP生成。该方法学的基本原理在于，每消耗一个O₂分子所产生的ATP分子数，与通过糖酵解每产生一个乳酸分子所生成的ATP分子数之间存在确定的化学计量关系。+ 糖酵解过程中，葡萄糖转化为乳酸时会释放出氢离子，导致培养基 pH 值变化，该变化反映在细胞外酸化率（ECAR）数值中。相反，在三羧酸（TCA）循环期间，发生氧化磷酸化。 通过 线粒体产生 CO2 通过利用或消耗氧气，因此监测耗氧率（OCR）能够反映这一代谢过程。该分析仪可同时实时测量细胞外微环境中的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），在细胞生物能量学研究中具有巨大潜力6,17此外，这些检测方法操作相对简便，并可根据实验目的轻松进行定制。类似的技术已被用于进一步理解T细胞对免疫系统代谢的调控作用。18,19癌症起始与进展20，以及多种其他细胞类型在代谢综合征中的作用21,22.
与替代技术相比，实时代谢通量分析仪的优势包括：（1）能够实时测量活细胞的细胞生物能量学；（2）可用相对少量的细胞进行检测（最低仅需5,000个细胞）；（3）配备加样口，可在高通量96孔系统中平行施加多种处理；（4）采用无需放射性标记的自动细胞成像仪进行归一化处理18,23,24。以下方法旨在提供利用该分析仪在成骨细胞分化过程中对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞生物能量学进行监测的一般性但详细的描述。文中将包含常规检测方法；然而，与许多技术和方法一样，强烈建议各实验室根据自身实验需求确定具体操作细节。
检测方法的选择及可用的检测类型：目前有多种多样的检测试剂盒和试剂可用于研究细胞的生物能量代谢，同时确保实验结果的可靠性和可重复性。此外，配套的桌面软件还提供可轻松自定义的检测模板。用户可根据自身需求设定检测方案，以测量不同的代谢参数。这些检测方案可根据实验目标和/或科学问题以多种方式进行调整。例如，利用四个加样端口，可将多种化合物依次加入检测体系中，以分析细胞对各特定代谢通路的响应。
细胞能量表型检测：该检测用于测量活细胞的代谢表型及代谢潜能。该检测也推荐作为了解通路特异性代谢概况的第一步。通过注射寡霉素A（ATP合酶抑制剂）与羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP，线粒体解偶联剂）的混合物，以评估细胞的能量潜能。注射寡霉素A会抑制ATP的合成，导致糖酵解速率（ECAR）上升，使细胞能够满足其能量需求；而注射FCCP则因线粒体膜去极化，导致氧消耗率（OCR）升高。本质上，该检测可反映基础代谢呼吸状态，并在两次注射（即施加推力或应激）后，揭示细胞的代谢响应。基于这些参数，软件可随时间绘制出细胞的OCR和ECAR变化，并将细胞分类为有氧型、静息型、糖酵解型或高能量型状态25,26。
ATP 实时生成速率检测：该检测可同时测量细胞通过糖酵解和线粒体呼吸产生的 ATP。此方法可定量评估两条能量通路之间的代谢转换，并提供随时间变化的线粒体和糖酵解 ATP 生成速率数据。该检测首先获取基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）数据，随后通过注射寡霉素 A 计算线粒体 ATP 生成速率，以及通过注射鱼藤酮 + 抗霉素 A 混合物（完全抑制线粒体功能）计算糖酵解 ATP 生成速率，从而导致线粒体酸化17,27。
细胞线粒体应激测试（或细胞线粒体功能测试）：该测试通过检测ATP偶联呼吸来评估线粒体功能，定量分析细胞生物能量状态，识别线粒体功能障碍，并测量细胞对压力的反应。一次实验即可获得多个参数，包括基础呼吸能力、备用呼吸能力、ATP偶联呼吸、最大呼吸速率以及非线粒体氧消耗。该实验通过依次注射寡霉素A、FCCP（线粒体解偶联剂）以及鱼藤酮/抗霉素A抑制剂混合物，高效分析这些试剂对线粒体功能的影响28。
线粒体燃料灵活性测试：该方法通过检测三种主要线粒体燃料在有无其特异性抑制剂存在时的氧化情况，来测定线粒体呼吸速率。依次抑制葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸的氧化途径，有助于评估细胞对不同代谢通路的依赖性、代谢能力及代谢灵活性，从而揭示细胞如何利用不同通路满足能量需求。当线粒体无法通过氧化其他燃料来补偿被阻断通路的能量需求时，细胞即进入依赖状态。细胞的代谢能力通过先抑制另外两条替代通路，再抑制目标通路来计算。细胞的代谢灵活性反映了线粒体补偿被抑制通路燃料需求的能力，其数值通过从细胞代谢能力中减去依赖性得到。本实验使用三种不同的抑制剂，可单独使用或两两组合，以准确测定各项参数。2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙烯酸（UK5099）通过阻断糖酵解中的丙酮酸载体来抑制葡萄糖氧化；双-[2-(5-苯乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-基)]乙基硫醚（BPTES）抑制谷氨酰胺氧化通路；依托莫匹（etomoxir）抑制长链脂肪酸的氧化29。
<img alt="使用微孔板成像仪进行实时细胞代谢通量分析中，BMSC培养至成骨细胞分化过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：成骨细胞培养与制备用于分析的实验方法示意图。 小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）从长骨中分离后进行培养，并以每孔25,000个细胞的密度接种于96孔板中。当细胞达到80%–100%融合度时，开始使用成骨细胞特异性培养基培养，以启动其向成骨细胞的分化过程。在分化的不同阶段进行各项检测。检测前一天，对传感器微孔板条进行水化处理。在检测当天，根据实验需求将不同的抑制剂注入传感器微孔板条的加样孔中，并向96孔校准板中加入校准缓冲液。完成校准后，进行实时细胞代谢通量检测，随后使用微孔板成像仪对细胞培养板进行成像，以将实时细胞代谢通量分析仪的数据归一化至细胞数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙烯酸</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>双-2-(5-苯乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5 成像读板仪</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>微孔板成像仪</td></tr><tr><td>依托莫西钠盐水合物</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白-油酸复合物</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素 A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 100 mM 丙酮酸溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF DMEM 培养基</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>含 5 mM HEPES (pH 7.4) 的 DMEM 检测培养基，不含酚红、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸和 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>实时代谢通量分析仪</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>包含 XFe96 传感器微孔板、细胞培养微孔板和 Seahorse XF 校准液</td></tr><tr><td>The Cell imaging 1.1.0.11 软件</td><td>Agilent Technologies - BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave 软件 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

成骨细胞介导的骨形成是实现正常骨量积累和骨转换、维持骨骼稳态并最终预防骨折的关键过程。为了优化峰值骨量并应对多种肌肉骨骼疾病（如绝经后骨质疏松症、神经性厌食、1型和2型糖尿病），骨生物学领域已投入巨大努力，以全面表征成骨细胞在其分化全过程中的特性。鉴于成熟成骨细胞的主要功能是分泌基质蛋白和矿化囊泡，研究发现这些过程需要消耗大量的细胞能量，即三磷酸腺苷（ATP）。细胞总体能量状态通常被称为细胞生物能量学，其包含一系列代谢反应，通过感知底物的可利用性来生成ATP，以满足细胞需求。因此，本方法详细描述了分离原代小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）并利用实时细胞代谢通量分析仪，在成骨细胞分化的不同阶段监测其生物能量状态的过程。重要的是，这些数据表明，代谢谱在成骨细胞分化过程中发生显著变化。因此，使用这种生理相关性细胞类型对于充分理解细胞的生物能量状态如何调控其整体功能至关重要。

<img alt="显示ATP生成速率、线粒体呼吸、ECAR、OCR数据的细胞能量潜力图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：用于了解对照组与处理组细胞生物能量特征及其相应标准误差的常规检测代表性图示。（A）细胞能量表型检测。该图展示了对照组与两个处理组（n = 3）的糖酵解（ECAR）与线粒体呼吸（OCR）的关系。寡霉素A和FCCP刺激剂的加入提高了基础活性，以空心符号表示；实心符号表示细胞对不同刺激剂的反应。（B）实时ATP生成速率检测。ATP生成速率检测表明，对照组和处理组（n = 2）均通过糖酵解产生比氧化磷酸化更多的ATP。（...

实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。

成骨细胞介导的骨形成是维持骨骼稳态、实现正常骨量获取和骨转换的关键过程，最终……

该方法可用于测定细胞能量代谢，例如三磷酸腺苷（ATP）生成速率，也可用于实时确定细胞对特定代谢物的偏好性。首先，加入200微升XF校准液，并将实用板在检测前孵育至少一小时。使用添加了补充剂的XF DMEM培养基配制80毫升XF检测用培养基。将寡霉素A、鱼藤酮和抗霉素A置于冰上解冻。使用前用移液器反复吹打化合物，使其溶解。向标记为A和B的每支试管中各加入3毫升已配制的测定缓冲液。向试管A中加入26.4微升浓度为2.5毫摩尔/升的寡霉素A，向试管B中加入3.1微升浓度为12.67毫摩尔/升的鱼藤酮、4.1微升浓度为9.4毫摩尔/升的抗霉素A以及30微升Hook染料。将这些抑制剂的10倍浓度溶液加入相应的注射端口。最后，将20微升这些化合物加入含有200微升检测培养基的细胞中。从37°C的培养箱中取出细胞培养微孔板，在显微镜下观察细胞。从水浴中取出检测培养基。用 200 微升预热的检测培养基轻轻洗涤细胞两次，每孔加入 200 微升检测培养基。在显微镜下观察细胞，确保细胞仍贴壁生长。确保 D5 和 E8 孔中的细胞形成均一的单层贴壁，且在洗涤步骤中未被冲走。细胞成像软件使用这两个孔位来设置自动对焦和自动曝光。在设备旁边的计算机上打开桌面软件。在控制器软件的左下角检查连接状态。转到“模板”并选择XF ATP速率测定模板或相应的测定模板。在屏幕顶部选择“分组定义”并设置分组。选择孔板布局，并根据已定义的分组分配各孔。验证仪器程序。确保所添加的化合物已正确列出，并包含项目信息以供将来参考。点击“运行检测”。此时将提示选择结果文件的存储位置。请选择用于保存结果文件的位置，使用检测日期命名文件，然后点击“开始运行”。将传感器盒和工具板放置在托盘上，然后单击“我已准备就绪”以启动校准。在计算机上打开细胞成像软件。确保微孔板成像仪已开启，并且端口已连接至计算机。检查屏幕左下角的状态栏，确保温度已设置为 37 摄氏度，且连接状态应以绿色高亮显示为就绪。扫描培养板条形码以启动成像过程。为细胞板输入名称，然后点击保存。明场和荧光图像将保存在此处。点击“执行明场扫描”，在下一个界面中，平板与扫描菜单将显示成像选项。在开始检测前，请选择“开始明场扫描”。将细胞培养微孔板和板盖放置在托盘架上，并将A1孔与A1标记对齐。点击“关闭托盘”。下一个屏幕将显示明场图像采集及孔板图。单击“扫描所有孔”，扫描30至35分钟。校准完成后，软件将显示“加载细胞培养板”对话框。然后，单击“打开托盘”以将工具托盘更换为细胞培养微孔板。请注意，细胞培养板已放置在微孔板成像仪中。扫描完成后，取出细胞培养微孔板并放入分析仪中以进行检测。然后，单击“加载细胞板”以启动检测。等待检测开始，并显示预计完成时间。检测完成后，软件将弹出“卸载传感器盒和细胞板”对话框。单击“弹出”按钮，从分析仪中取出细胞培养微孔板。小心取出传感

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量学

提供了一种用于分析细胞线粒体功能的方法描述。该方法生成的线粒体功能谱可在一次实验中测量四个线粒体功能参数：基础呼吸速率、ATP偶联呼吸、质子漏和备用呼吸能力。...

使用C2C12成肌细胞的生物能量谱分析实验

本方案提供了一种利用细胞外通量分析法测定原代白血病细胞胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）的生化方法。对这些细胞代谢特征的评估有助于明确其代谢需求，从而实现个体化治疗。...

细胞外通量测定：一种用于测量细胞代谢特征的方法

来源：Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros...

活细胞和透化细胞中线粒体呼吸的氧通量测量

本视频展示了利用细胞外通量分析仪分析活化人自然杀伤（NK）细胞能量代谢的方法。电子传递链复合物的不同抑制剂会影响ATP合成，该过程通过氧消耗率（OCR）进行测量，从而提供关于细胞代谢和生物能量学的见解。...

利用细胞外通量分析仪实时监测人自然杀伤细胞的能量代谢

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了其健康状况和功能。本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法检测H-RPE实时代谢通量的优化方案。...

利用高分辨率呼吸测定法对原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学进行实时分析

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。...

中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

本文详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中提取巨噬细胞的方法，并进一步评估活细胞中代谢通量的实验流程。...

分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

我们提出了一种选择性通透细胞质膜的实验方案，可实现底物和抑制剂的靶向递送，从而在培养细胞中评估线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），克服了通常阻碍此类分析的质膜转运屏障。利用该技术，我们展示了OXPHOS功能如何受到毒蕈碱受体激动剂和拮抗剂的调节。...

胆碱能配体依赖性调节Digitonin透化的BE(2)-C神经母细胞瘤细胞中的氧化磷酸化偶联

我们提出了一种纳米光子学（量子点-荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的创新且强大的方法，用于研究聚电解质聚集体（polyplexes）的形成过程，该方法有望为未来基于核酸的治疗药物提供对聚集体更精确的控制，并实现均匀、可定制聚集体的合成。...

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

了解实时细胞代谢通量分析技术，用于监测成骨细胞的氧气消耗与细胞外酸化速率，评估ATP生成及线粒体活性。该方法结合代谢抑制剂与软件辅助成像，为骨生物学中的细胞能量学研究提供精准数据支持。

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

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