Name: 无需细胞分选即可从快速冷冻的异质组织样品中分离细胞类型特异性RNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习使用NuTRAP小鼠模型和GLP下拉技术从异质组织中分离细胞类型特异性核糖体结合RNA的方法。该技术无需细胞分选即可获取高质量RNA，适用于研究EGFP表达细胞中的基因表达差异。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R00HD082686项目资助。我们感谢内分泌学会暑期研究奖学金对H.S.Z.的支持。同时感谢袁康博士在小鼠品系繁育与种群维护方面的工作。

所有动物实验均遵循奥本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
注意：以下实验方案使用 P28 期 Gli1-CreERT2; NuTRAP 小鼠（Mus musculus）的一个睾丸（约 100 mg）。根据样本类型和组织数量，试剂的体积可能需要相应调整。
1. 组织采集
<ol>
	<li>使用 CO2 麻醉箱处死小鼠，用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。</li>
	<li>用剪刀打开下腹部并取出睾丸。&#160;立即使用液氮&#160;(LN2) 对睾丸进行速冻。</li>
	<li>将样品储存于 LN2 的气相中，直至使用。</li>
</ol>
2. 试剂与磁珠的制备
<ol>
	<li>配制匀浆储存液：加入 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40 和 1 mg/mL 肝素。将溶液储存于 4 °C，直至使用（最多可保存 1 个月）。</li>
	<li>使用前新鲜配制匀浆工作缓冲液（步骤 2.1）：向匀浆储存液中加入 DTT（终浓度：1 mM）、环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）、重组核糖核酸酶（终浓度：200 单位/mL）和蛋白酶抑制剂混合物（终浓度：1×），配制成所需体积的匀浆工作缓冲液。 freshly prepared working buffer on ice until use.</li>
	<li>配制低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液：
	<ol>
		<li>配制低盐洗涤缓冲液：混合 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl2、100 mM KCl 和 1% NP-40。使用前加入 DTT（终浓度：1 mM）和环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）。</li>
		<li>配制高盐洗涤缓冲液：混合 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl2、300 mM KCl 和 1% NP-40。使用前加入 DTT（终浓度：2 mM）和环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备蛋白 G 磁珠（材料表）：
	<ol>
		<li>每个样品需要 50 µL 蛋白 G 磁珠。将所需体积的磁珠转移至 1.5 mL 离心管中，将离心管置于磁力架上静置 30–60 秒，使磁珠与溶液分离。</li>
		<li>用移液器吸除上清液。每次用 1 mL 冰冷的低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，共洗涤三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织裂解与匀浆化
<ol>
	<li>向玻璃组织研磨器中加入 2 mL 冰冷的匀浆工作缓冲液（按步骤 2.2 新鲜配制）。迅速将冷冻样品放入研磨器中，使用松动的研杵在冰上研磨 30 次以匀浆组织。</li>
	<li>将匀浆液转移至一个 2 mL 圆底离心管中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至一个新的 2 mL 离心管中。取 100 µL 上清液保存至一个 1.5 mL 离心管中作为 &#34;输入&#34;样品。</li>
	<li>在 2 mL 离心管中，将上清液与抗 GFP 抗体（5 µg/mL；1:400）在 4 °C 条件下于翻转旋转仪（24 rpm）上孵育过夜。</li>
</ol>
4. 免疫沉淀
<ol>
	<li>将匀浆/抗体混合物转移至一个新的2 mL圆底离心管中，该离心管内含有步骤2.4中已洗涤的蛋白G磁珠。在4 °C下，使用翻转混合仪（24 rpm）孵育2小时。</li>
	<li>使用磁力架将磁珠与上清液分离。将上清液保留作为&#34;阴性组分&#34;。阴性组分包含：(1) EGFP阴性细胞中的RNA，以及(2) EGFP阳性细胞中未与核糖体结合的RNA。</li>
	<li>向磁珠中加入1 mL高盐洗涤缓冲液，短暂涡旋振荡离心管以洗涤磁珠。将离心管置于磁力架上。</li>
	<li>移除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤两次。此时磁珠上含有来自EGFP阳性细胞的磁珠-核糖体-RNA复合物。</li>
</ol>
5. RNA 提取
注意：以下步骤改编自RNA提取试剂盒（材料表）。将每个组分（即上样组、阳性组和阴性组）视为独立样本，并分别独立提取RNA。
<ol>
	<li>将4.4步骤中的磁珠与50 µL洗脱缓冲液（来自RNA提取试剂盒）在恒温混匀仪中孵育（42 °C，500 rpm）30分钟，以释放磁珠上的RNA。</li>
	<li>使用磁力架分离珠子，将含有珠子-核糖体-RNA复合物的上清液转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将试管在3000 x g条件下离心 g 2分钟，然后用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。此管含有 &#34;阳性组分&#34; TRAP 步骤的 
	注意：对于输入样品和阴性组分，使用1 mL裂解缓冲液从25 µL样品中提取RNA。在恒温混匀仪中孵育（42 °C，500 rpm）30分钟。</li>
	<li>预处理RNA纯化柱：用移液器将250 µL平衡缓冲液加入纯化柱中，在室温（RT）孵育5分钟。将纯化柱在16,000 x g下离心 g 1 分钟。</li>
	<li>移液&#160;等体积的70% EtOH加入到&#160;步骤5.3的上清液（阳性组分约50 µL 70% EtOH，输入组分和阴性组分各1 mL 70% EtOH）。用移液器反复吹打充分混匀。</li>
	<li>将步骤5.4中的混合物用移液器转移至柱中。</li>
	<li>以 100 x g 离心柱子 g 2 分钟，使 RNA 结合并吸附于柱中膜上，随后继续在 16,000 x g 立即弃去流出液。 
	注意：对于输入样品和阴性组分，每次向柱中加入 250 µL 混合物。重复步骤 5.6 和 5.7，直至用完所有混合物。</li>
	<li>用移液器将100 µL洗脱缓冲液1（W1）加入柱中，于8,000 x g离心 g 1 分钟。弃去滤液。</li>
	<li>将75 µL DNase溶液混合物直接移液至纯化柱膜中，在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将40 µL W1加入柱中，8,000 x g离心 g 30秒后弃去滤液。</li>
	<li>将100 µL洗脱缓冲液2（W2）移液至柱中，于8,000 x g离心 g 1 分钟。弃去滤液。</li>
	<li>用移液器将100 µL W2加入柱中，于16,000 x g离心 g 2 分钟。弃去流出液。将同一层析柱在 16,000 x g 1分钟，以在洗脱步骤前彻底去除洗涤缓冲液残留。</li>
	<li>将柱子转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将 12 µL 无 RNase 水直接移取至纯化柱膜上。移液枪头不应接触膜。室温孵育 1 分钟，然后以 1000 x g 离心 g 1分钟。然后以16,000 x g 孵育1分钟以洗脱RNA。</li>
</ol>
6. RNA 浓度与质量
<ol>
	<li>使用生物分析仪评估提取的RNA的质量和数量10。</li>
</ol>
7. 储存与进一步分析
<ol>
	<li>将RNA储存于-80 °C（最长可达1年），直至进行后续分析（例如微阵列、定量PCR（qPCR）和RNA测序等）。 
	注意：有关qPCR分析的详细信息，包括cDNA合成，请参见Lyu等人的研究11。qPCR所用引物列于材料表中。</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

全组织转录组分析的应用价值可能会受到限制，尤其是在研究结构复杂的异质性组织时。如何获取特定细胞类型的RNA，已成为充分发挥RNA-seq技术强大功能的迫切需求。分离特定细胞类型的RNA通常依赖于通过显微操作、荧光激活细胞分选（FACS）或激光捕获显微切割（LCM）来收集特定类型的细胞18。此外，其他现代高通量单细胞采集方法和仪器也已相继开发出来19。这些方法通常采用微流控技术对单个细胞进行条形码标记，随后进行单细胞RNA测序。细胞解离是获得悬浮细胞溶液的必要步骤，之后细胞悬液将通过细胞分选仪或微流控装置对每个细胞进行条形码标记。然而，在针对特定细胞类型的研究中，细胞解离步骤给这些方法带来了挑战，因为酶处理不仅会破坏组织结构，还会影响细胞活力和转录谱型20。此外，单细胞RNA-seq的成本通常较高，且需要现场配备专用设备。
最近，两项研究利用 NuTRAP 小鼠成功地从完整组织中分离出特定细胞类型的 RNA/DNA<sup ...

高通量方法（包括RNA测序（RNA-seq）和微阵列技术）使得在全基因组水平上研究基因表达谱成为可能。对于心脏、脑和睾丸等复杂组织而言，细胞类型特异性的数据相比使用整个组织的RNA能够提供更详细的分析结果1,2,3。为了克服细胞异质性的影响，自2010年代初期以来，研究人员开发了翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP）技术4。TRAP能够在不进行组织解离的情况下，从特定细胞类型中分离出与核糖体结合的RNA。该方法已被用于多种生物中的转译组（即正在被招募至核糖体进行翻译的mRNA）分析，包括在果蝇胚胎中靶向极为稀有的肌细胞群体5，研究模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不同类型的根细胞6，以及对哺乳动物内皮细胞进行转录组分析7。
TRAP 技术需要对模式生物的核糖体进行基因改造标记。Evan Rosen 及其同事近期开发了一种名为核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）的小鼠模型8，该模型自 2017 年起可通过杰克逊实验室获取。通过与表达 Cre 的小鼠品系杂交，研究人员可利用该 NuTRAP 小鼠模型直接从表达 Cre 的细胞中分离出与核糖体结合的 RNA 和细胞核，而无需进行细胞分选。在同时携带 NuTRAP 等位基因且表达 Cre 的细胞中，EGFP/L10a 标记的核糖体可通过亲和捕获实验分离正在翻译的 mRNA。在同一细胞中，被生物素连接酶识别肽（BLRP）标记且呈 mCherry 阳性的核膜，可通过亲和或基于荧光的方法实现细胞核的分离。同一研究团队还构建了另一种类似的小鼠品系，其核膜仅用 mCherry 标记而不含生物素标签8。这两种基因修饰小鼠品系使得研究人员能够同步分析特定类型细胞的表观基因组与转录组特征。
Hedgehog（Hh）信号通路在组织发育中发挥关键作用9。GLI1 是 GLI 家族的成员，作为转录激活因子介导 Hh 信号通路。Gli1+ 细胞存在于多种分泌激素的器官中，包括肾上腺和睾丸。为了利用 NuTRAP 小鼠模型从 Gli1+ 细胞中分离细胞类型特异性的 DNA 和 RNA，将 Gli1-CreERT2 小鼠与 NuTRAP 小鼠杂交。同时，将 Shh-CreERT2 小鼠也与 NuTRAP 小鼠杂交，以分离表达 sonic hedgehog（Shh）的细胞。以下方案展示了如何使用 Gli1-CreERT2;NuTRAP 小鼠从成年小鼠睾丸中的 Gli1+ 细胞中分离核糖体结合的 RNA。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Actb&lt;/em&gt;</td><td>欧陆检测</td><td>qPCR 引物</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT（正向引物/反向引物）</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>安捷伦</td><td>2100 Bioanalyzer 仪器</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>默克密理博</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>默克密理博</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cyp11a1&lt;/em&gt;</td><td>欧陆检测</td><td>qPCR 引物</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT（正向引物/反向引物）</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT，二硫苏糖醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>玻璃研磨器套装</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Hsd3b&lt;/em&gt;</td><td>欧陆检测</td><td>qPCR 引物</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC（正向引物/反向引物）</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Clariom S 检测微阵列</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>微阵列服务</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>默克密理博</td><td>492018-50 mL</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>英潍捷基</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead 磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 水</td><td>growcells</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sox9&lt;/em&gt;</td><td>欧陆检测</td><td>qPCR 引物</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT（正向引物/反向引物）</td></tr><tr><td>Superscript IV 逆转录酶</td><td>英潍捷基</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 主混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sycp3&lt;/em&gt;</td><td>欧陆检测</td><td>qPCR 引物</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA / GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA（正向引物/反向引物）</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

无需细胞分选从速冻异质组织样本中分离细胞类型特异性rna

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

细胞异质性为在转录组水平上理解复杂组织的功能带来了挑战。利用细胞类型特异性的RNA可避免由组织异质性引起的各种潜在问题，并充分发挥转录组分析的强大能力。本文所述方案展示了如何在无需细胞分选的情况下，使用翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法从复杂组织中少量表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA。该方案适用于利用近期可获得的NuTRAP小鼠模型来分离特定细胞类型的RNA，也可用于分离任何表达EGFP的细胞中的RNA。

Gli1-CreERT2 小鼠（杰克逊实验室品系编号：007913）首先与 NuTRAP 报告基因小鼠（Jackson实验室货号：029899）以生成双突变小鼠。携带两种基因工程等位基因的小鼠（即 Gli1-CreER）T2 和 NuTRAP) 每隔一天注射一次他莫昔芬，共注射三次。组织样本于第7天采集th 1 天后st 注射当天。免疫荧光分析显示，EGFP在睾丸的间质细胞中表达（图1）。已知肾上腺被膜是另一种表达阳性细胞群体 Gli112,13在肾上腺被膜细胞中也检测到 EGFP Gli1-CreERT2;NuTRAP 小鼠（图1）。我们实验室也进行 Shh-CreERT2;...

本方案旨在利用 NuTRAP 小鼠模型分离特定细胞类型的翻译核糖体 mRNA。

无需细胞分选从速冻异质组织样本中分离细胞类型特异性RNA

细胞异质性为在转录组水平上理解复杂组织的功能带来了挑战。利用细胞类型特异性的RNA可避免……

本方案旨在无需细胞分选的情况下，从复杂组织中的少量细胞中获取高质量的特定细胞类型RNA。该方法利用一种新近可用的小鼠模型，使研究人员能够通过GLP下拉法分离与核糖体结合的RNA。该方法同样适用于从任何表达EGFP的细胞中分离与核糖体结合的RNA。首先，向一套玻璃组织研磨器中加入 2 毫升预冷的匀浆工作缓冲液。迅速将冷冻样品放入研磨器中，使用松配合的研杵在冰上研磨 30 次以匀浆组织。将匀浆液转移至一个 2 毫升圆底离心管中，并在 4 °C 条件下于 12,000 ×g 离心 10 分钟。然后将上清液转移至一个新的2 mL离心管中，注意不要扰动沉淀，保留100 µL作为输入样品。将上清液与抗GFP抗体在4 °C条件下于翻转摇床中孵育过夜。将匀浆液与抗体混合物转移至含有经洗涤的Protein G磁珠的新2 mL圆底离心管中，在4 °C、24 RPM转速下于摇床孵育2小时。使用磁力架将磁珠与上清液分离。将上清液保留作为阴性组分，其中含有EGFP阴性细胞中的RNA以及未与核糖体结合的EGFP阳性细胞中的RNA。向磁珠中加入1毫升高盐洗涤缓冲液，并短暂涡旋振荡离心管以洗涤磁珠。然后将离心管置于磁力架上，吸除洗涤缓冲液，并重复洗涤步骤两次，以从EGFP阳性细胞中获得珠子-核糖体RNA复合物。将珠子与RNA提取试剂盒中的50 µL提取缓冲液在ThermoMixer中孵育30分钟，以释放珠子上的RNA。将磁珠置于磁力架上分离，随后将上清液转移至一个1.5毫升离心管中。以3000 ×g离心2分钟，然后用移液器将上清液转移至一个新的1.5毫升离心管中。为预处理RNA纯化柱，用移液器将250微升平衡缓冲液加入纯化柱中，在室温下孵育5分钟。然后在16,000 g离心1分钟。向细胞裂解液中加入等体积的70%乙醇，通过移液充分混匀。将最多200微升的混合物移液至预处理的RNA纯化柱中。为减少样品损失，不要将柱子填充超过其容量的80%。重复此步骤数次，直到所有RNA均收集到各组分的同一根柱子中。将离心柱离心两分钟，使RNA结合到柱中的膜上。然后继续离心30秒。弃去流出液，并用移液器向柱中加入100 µL洗涤缓冲液一。离心一分钟，然后弃去滤过液。用移液器将75微升DNA溶液混合物直接加入纯化柱膜中。室温孵育15分钟。然后，将40 µL洗涤缓冲液一加入柱中，再离心30秒。弃去流出液。向柱中加入100 µL洗涤缓冲液二，于8,000 ×g离心1分钟。弃去流出液。向柱中加入500微升洗涤缓冲液二，于16,000 g离心2分钟。弃去流出液，再将同一根柱子于16,000 g重新离心1分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。将层析柱转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。用移液器吸取12微升无RNase的水，直接加在纯化柱的膜上，注意移液器吸头不要接触膜。室温孵育1分钟，然后在1000 ×g离心1分钟。然后在16,000 G离心1分钟以洗脱RNA。使用生物分析仪评估提取RNA的质量和数量。将RNA储存在-80°C冰箱中，或送样进行进一步分析。将携带两种基因工程等位基因 Gli1-CreERT2 和 NuTRAP 的小鼠每隔一天注射一次他莫昔芬，共注射三次，每次注射间隔一天。对收集的组织进行免疫荧光分析显示，EGFP 在睾丸的间质细胞中表达。在 Gli1-CreERT2、NuTRAP 小鼠的肾上腺被膜细胞中也检测到 EGFP 的表达。在Sonic Hedgehog-CreERT2、NuTRAP小鼠中，EGFP阳性细胞群体位于肾上腺外皮质、被膜下方，证实了EGFP预先表达细胞的存在。在提取该细胞类型特异性RNA后，将所提取的RNA送至进行微阵列分析。结果显示，与阴性组分中的基因相比，阳性组分中约有3000个基因富集，而阴性组分中约有4,000个基因富集。在差异表达基因中，Leydig 细胞相关基因 Hsd11b1 和 Hsd3b6 在阳性组分中富集。在阴性组分中，Sertoli 细胞相关基因 Desert Hedgehog 和 Gstm6 富集。在将阴性组分与输入样本进行比较时，仅鉴定出少数差异表达基因。采用实时定量RT-PCR验证关键基因在阳性与阴性组分中的表达情况。与芯片分析结果相似，类固醇生成酶3-β羟基类固醇脱氢酶和胆固醇侧链裂解酶在阳性组分中富集。与此同时，支持细胞标志物SRY盒转录因子9和生殖细胞标志物联会复合体蛋白3在阴性组分中富集。在进行本实验方案时，重要的是要配制新鲜的匀浆工作缓冲液。仅在使用前，将DTT、放线菌酮、重组核糖核酸酶以及蛋白酶抑制剂混合物加入匀浆储存液中。此外，使用前也需配制新鲜的低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液。

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