无需细胞分选从速冻异质组织样本中分离细胞类型特异性RNA

本方案旨在无需细胞分选的情况下，从复杂组织中的少量细胞中获取高质量的特定细胞类型RNA。该方法利用一种新近可用的小鼠模型，使研究人员能够通过GLP下拉法分离与核糖体结合的RNA。该方法同样适用于从任何表达EGFP的细胞中分离与核糖体结合的RNA。

首先，向一套玻璃组织研磨器中加入 2 毫升预冷的匀浆工作缓冲液。迅速将冷冻样品放入研磨器中，使用松配合的研杵在冰上研磨 30 次以匀浆组织。将匀浆液转移至一个 2 毫升圆底离心管中，并在 4 °C 条件下于 12,000 ×g 离心 10 分钟。

然后将上清液转移至一个新的2 mL离心管中，注意不要扰动沉淀，保留100 µL作为输入样品。将上清液与抗GFP抗体在4 °C条件下于翻转摇床中孵育过夜。将匀浆液与抗体混合物转移至含有经洗涤的Protein G磁珠的新2 mL圆底离心管中，在4 °C、24 RPM转速下于摇床孵育2小时。

使用磁力架将磁珠与上清液分离。将上清液保留作为阴性组分，其中含有EGFP阴性细胞中的RNA以及未与核糖体结合的EGFP阳性细胞中的RNA。向磁珠中加入1毫升高盐洗涤缓冲液，并短暂涡旋振荡离心管以洗涤磁珠。

然后将离心管置于磁力架上，吸除洗涤缓冲液，并重复洗涤步骤两次，以从EGFP阳性细胞中获得珠子-核糖体RNA复合物。将珠子与RNA提取试剂盒中的50 µL提取缓冲液在ThermoMixer中孵育30分钟，以释放珠子上的RNA。

将磁珠置于磁力架上分离，随后将上清液转移至一个1.5毫升离心管中。以3000 ×g离心2分钟，然后用移液器将上清液转移至一个新的1.5毫升离心管中。

为预处理RNA纯化柱，用移液器将250微升平衡缓冲液加入纯化柱中，在室温下孵育5分钟。然后在16,000 g离心1分钟。向细胞裂解液中加入等体积的70%乙醇，通过移液充分混匀。

将最多200微升的混合物移液至预处理的RNA纯化柱中。为减少样品损失，不要将柱子填充超过其容量的80%。重复此步骤数次，直到所有RNA均收集到各组分的同一根柱子中。

将离心柱离心两分钟，使RNA结合到柱中的膜上。然后继续离心30秒。弃去流出液，并用移液器向柱中加入100 µL洗涤缓冲液一。

离心一分钟，然后弃去滤过液。用移液器将75微升DNA溶液混合物直接加入纯化柱膜中。室温孵育15分钟。

然后，将40 µL洗涤缓冲液一加入柱中，再离心30秒。弃去流出液。向柱中加入100 µL洗涤缓冲液二，于8,000 ×g离心1分钟。

弃去流出液。向柱中加入500微升洗涤缓冲液二，于16,000 g离心2分钟。弃去流出液，再将同一根柱子于16,000 g重新离心1分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。

将层析柱转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。用移液器吸取12微升无RNase的水，直接加在纯化柱的膜上，注意移液器吸头不要接触膜。室温孵育1分钟，然后在1000 ×g离心1分钟。

然后在16,000 G离心1分钟以洗脱RNA。使用生物分析仪评估提取RNA的质量和数量。将RNA储存在-80°C冰箱中，或送样进行进一步分析。

将携带两种基因工程等位基因 Gli1-CreERT2 和 NuTRAP 的小鼠每隔一天注射一次他莫昔芬，共注射三次，每次注射间隔一天。对收集的组织进行免疫荧光分析显示，EGFP 在睾丸的间质细胞中表达。在 Gli1-CreERT2、NuTRAP 小鼠的肾上腺被膜细胞中也检测到 EGFP 的表达。

在Sonic Hedgehog-CreERT2、NuTRAP小鼠中，EGFP阳性细胞群体位于肾上腺外皮质、被膜下方，证实了EGFP预先表达细胞的存在。在提取该细胞类型特异性RNA后，将所提取的RNA送至进行微阵列分析。结果显示，与阴性组分中的基因相比，阳性组分中约有3000个基因富集，而阴性组分中约有4,000个基因富集。

在差异表达基因中，Leydig 细胞相关基因 Hsd11b1 和 Hsd3b6 在阳性组分中富集。在阴性组分中，Sertoli 细胞相关基因 Desert Hedgehog 和 Gstm6 富集。在将阴性组分与输入样本进行比较时，仅鉴定出少数差异表达基因。

采用实时定量RT-PCR验证关键基因在阳性与阴性组分中的表达情况。与芯片分析结果相似，类固醇生成酶3-β羟基类固醇脱氢酶和胆固醇侧链裂解酶在阳性组分中富集。与此同时，支持细胞标志物SRY盒转录因子9和生殖细胞标志物联会复合体蛋白3在阴性组分中富集。

在进行本实验方案时，重要的是要配制新鲜的匀浆工作缓冲液。仅在使用前，将DTT、放线菌酮、重组核糖核酸酶以及蛋白酶抑制剂混合物加入匀浆储存液中。此外，使用前也需配制新鲜的低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液。