Name: 前子宫 从前肠胚形成到晚期器官生成的小鼠胚胎培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解小鼠胚胎体外培养技术，用于研究原肠胚形成至晚期器官发生的发育过程。该方法支持胚胎在子宫外持续生长长达六天，为发育生物学研究提供可靠平台。

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本工作由 Pascal 和 Ilana Mantoux；欧洲研究理事会（ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety）；空乘人员医学研究理事会（FAMRI）；以色列癌症研究基金（ICRF）教授职位；BSF；Helen 和 Martin Kimmel 干细胞研究研究所；Helen 和 Martin Kimmel 创新研究奖；以色列科学基金会（ISF）；Minerva；Sherman 药物化学研究所；Nella 和 Leon Benoziyo 神经疾病研究中心；David 和 Fela Shapell 遗传病研究家族中心；Kekst 家族医学遗传学研究所；Beth Rom-Rymer 博士干细胞研究基金；Edmond de Rothschild 基金会；Zantker 慈善基金会；Zvia Zeroni 遗产基金资助。

所有动物实验均按照魏茨曼科学研究所的动物保护指南进行，并经魏茨曼科学研究所IACUC批准（#01390120-1、01330120-2、33520117-2）。根据拉班医学中心赫尔辛基委员会（#RMB-0452-15）的批准，健康孕妇被要求签署知情同意书，以采集其脐带血。根据魏茨曼科学研究所赫尔辛基委员会指南（#1566-3），健康成人也被要求签署知情同意书以采集血液样本。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>使用500 mL不含酚红和L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清和5 mL青霉素/链霉素，通过0.22 µm滤器过滤除菌，配制解剖用培养基。 
	注意：解剖用培养基可于4 °C保存最多1个月。</li>
	<li>每天在生物安全柜内新鲜配制ex utero胚胎培养基（EUCM），成分为25%胚胎培养基、50%大鼠血清和25%人脐带血清（HCS）或人成人血清（HBS）。</li>
	<li>配制胚胎培养基时，在500 mL不含酚红和L-谷氨酰胺的DMEM中加入5 mL谷氨酰胺、5 mL HEPES和5 mL青霉素/链霉素。分装为10–15 mL等份，于4 °C保存，最多可使用两个月。 
	注意：若出现污染，应将抗生素浓度加倍。</li>
	<li>将大鼠血清在56 °C加热灭活30–45分钟，然后通过0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤器过滤。灭活后当天即用于培养。将HCS或HBS解冻后立即用于实验。 
	&#8203;注意：商用大鼠血清结果稳定（已测试至少4个批次，无明显差异）。此外，高质量的大鼠血清也可按先前所述方法在in-house条件下自行制备8,14。若无法获得HCS，可用in-house采集的HBS替代。大鼠血清、HCS和HBS均可再冻存一次，并于-20 °C保存以备后续使用。使用时解冻，并将再冻存的血清与较大量新解冻的血清混合后使用，切勿再次冻存。</li>
</ol>
2. 人脐带血清和人成年血液血清的采集
<ol>
	<li>为分离HCS，应在计划进行剖宫产分娩的当天，从健康孕妇处采集脐带血。
	<ol>
		<li>在婴儿娩出后，立即于距脐部5-7 cm处用两把止血钳夹住脐带，并在两钳之间剪断。</li>
		<li>使用14号大孔径针头和50 mL注射器，在胎盘仍完整时直接从脐静脉手动抽血 原位 以避免任何溶血痕迹。 
		注意：在婴儿离开手术区域且已采集脐带血用于临床检测后，再采集血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将采集的血液分装至5 mL抗凝无菌试管中，并立即置于4 °C环境中15 min，以确保完全凝固。将已凝固的试管在2,500 × g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去出现溶血迹象（血清呈粉红色至红色）的试管。使用5 mL移液管收集血清（黄色），并通过0.22 µm滤器过滤。立即将血清置于56 °C水浴中加热灭活45 min。</li>
	<li>制备1-1.5 mL灭活血清分装样品，于-80 °C保存，可保存长达六个月。如需运输，可使用干冰在-70 °C条件下进行。</li>
	<li>采集成人人类血清时，从健康成人抽取血液，并立即按照脐带血血清所述相同方案分离血清。将人血清（HBS）分装后进行热灭活和过滤，于 -80 °C 保存，最长可保存六个月。 
	&#8203;注意：人脐带血清和新鲜制备的成人人血清 自主研发 与市售血清相比，结果更优。采集18岁以上、40岁以下健康女性的HCS，这些女性需计划进行剖宫产分娩。排除经阴道分娩的女性，以及患有任何慢性疾病或活动性医学状况的女性，包括妊娠期糖尿病或高血压。</li>
</ol>
3. 子宫外 从E7.5至E11胚胎的滚筒培养
<ol>
	<li>设置滚筒培养孵育箱和气体调节器
	<ol>
		<li>使用滚筒培养孵育箱系统培养 E7.5 或更晚期的胚胎。在进行胚胎解剖前至少 1 小时，开启旋转装置和 37 °C 加热单元。向气体入口瓶和出口试管中加入已灭菌的水。 
		注意：将温度计放置在旋转鼓附近，并频繁检查孵育箱内温度的稳定性。应尽快打开孵育箱，因为长时间开启会导致温度升高并影响胚胎发育。必要时，向气体入口瓶和出口试管中补充已灭菌的水，确保其容量不低于一半。用布覆盖孵育箱以遮挡光线，保护箱内胚胎。</li>
		<li>按下主开关，启动气体调节模块，随后打开氧气/氮气和 CO2 控制器（图 1A）。使用各自的控制器将氧气和CO2浓度设定为5%。打开气体调节器，通过调节压力变送器上的电压开关，将气体压力设置为约 6.5–7 磅/平方英寸（psi）（图 1B）。使用数字压力计确认气体压力值。</li>
		<li>通过观察精密孵育箱内装水的出口试管中气泡产生的速率来监测气体流量。通过打开或关闭水瓶盖上的气体流量阀，调节至合适的气泡速率。确保气体流量使气泡以每秒 2–4 个气泡的速率形成，或调节至气泡刚好从装水的出口管中逸出的第一个位置。</li>
		<li>向培养瓶中加入 2 mL 培养基，并将其插入中空旋转鼓中，预平衡 1 小时。使用中空硅胶塞将瓶子密封至旋转鼓上。使用实心塞子封闭旋转鼓上的空位。 
		注意：若出口管中无气泡（无气体通过系统）或气体流速异常高，可能会影响胚胎发育。若出口试管中无气泡流动，请检查所有硅胶塞是否正确安装在旋转鼓上并密封系统，确认水瓶是否已正确关闭，以及所有管路是否连接正确。若水瓶中无气泡进入，可能表明气体调节器出现故障。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠妊娠母鼠中解剖胚胎
	<ol>
		<li>将解剖用培养基置于 37 °C、5% CO2 的孵育箱中预平衡至少 1 小时。将瓶盖略微打开，以允许气体交换。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死妊娠雌鼠，用 70% 乙醇清洁其腹部，用剪刀剪开皮肤和腹壁。找到子宫一端，在卵巢与子宫交界处剪断。然后沿子宫剪至另一端，并将其转移至盛有室温 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）的 100 mm 培养皿中。 
		注意：建议使用未经激素处理、自然交配的雌鼠。</li>
		<li>迅速用 DPBS 清洗胚泡，并成对剪开以方便胚胎操作。将所有成对的胚泡转移至盛有预平衡解剖培养基的 60 mm 培养皿中，并进一步剪成单个胚泡。</li>
		<li>使用粗镊子撕开子宫组织，去除胚泡的子宫壁。使用精细显微外科镊子剪开梨形蜕膜的尖端。将镊子插入胚胎旁，与胚胎长轴平行，然后张开镊子将蜕膜分成两半。</li>
		<li>最后，用精细镊子夹住蜕膜处的胚胎，剥离胚外体腔卵黄囊，使完整的外胎盘锥体仍附着于胚体柱上。 
		注意：为避免影响胚胎，应在配备 37 °C 加热板的显微镜下进行解剖，总时间不超过 30–40 分钟。每次解剖一窝胚胎。</li>
		<li>解剖完成后，立即使用玻璃巴斯德移液管将胚胎转移至盛有平衡后解剖培养基的新培养皿中，以防止胚胎粘附组织碎片。</li>
		<li>选择处于神经板期/早期头褶阶段且上胚层无损伤的胚胎，每瓶转移 5–6 个胚胎至已预平衡的玻璃培养瓶中。 
		注意：准备玻璃巴斯德移液管时，使用玻璃切割器将管口切割至适合胚胎大小的口径，并将其保存在乙醇中以避免污染。转移胚胎前，用 PBS 清洗玻璃移液管。将胚胎转移至培养瓶时，应尽量减少携带的解剖培养基体积，以避免稀释 EUCM。</li>
		<li>将培养瓶置于 37 °C 的旋转培养系统中，气体环境为 5% O2 和 5% CO2。</li>
		<li>每天从孵育箱中逐一取出培养瓶，在体视显微镜下评估胚胎发育情况。取出培养瓶时，务必用实心塞子封闭旋转鼓上的空孔。将无菌塑料巴斯德移液管尖端剪至适合胚胎大小，将胚胎转移至培养皿以便观察。确保胚胎始终被培养基覆盖。 
		注意：应尽量减少胚胎在孵育箱外的时间，以避免因温度下降对胚胎造成不利影响。操作时应小心，避免破裂卵黄囊血管，影响胚胎存活。</li>
		<li>培养第 1 天（相当于 E8.5），将每组 3 个胚胎转移至新培养瓶，加入 2 mL 新鲜且已预平衡的 EUCM，其中额外添加 3 mg/mL D-葡萄糖，气体混合物为 13% O2、5% CO2。</li>
		<li>48 小时后（相当于 E9.5），将每组 2 个胚胎转移至新培养瓶，加入新鲜预热的 EUCM 并补充 3.5 mg/mL 葡萄糖，气体环境为 18% O2 和 5% CO2。</li>
		<li>培养 72 小时后（相当于 E10.5），将每个胚胎单独转移至含有 1.5–2 mL 新鲜培养基的培养瓶中，培养基补充 4 mg/mL 葡萄糖，气体供应为 21% O2 和 5% CO2。 
		注意：胚胎在培养第 4 天午夜左右达到最大生长。</li>
		<li>使用精细镊子去除卵黄囊和羊膜，并分离脐带，以便正确观察胚胎形态。关闭气体调节模块和精密孵育箱。 
		&#8203;注意：根据胚胎发育阶段，在滚筒培养系统中将培养基置于玻璃瓶内，于适当气体环境下孵育 1 小时进行预平衡。每次使用后，用流动的蒸馏水冲洗培养瓶及所有孵育箱玻璃器皿三次，随后在 70% 乙醇中浸泡过夜。再用流动蒸馏水冲洗三次，晾干过夜，并通过高压灭菌进行消毒。同样，应定期对硅胶塞进行高压灭菌。所有解剖工具需用 70% 乙醇彻底清洁并进行干热灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从 E5.5/E6.5 到 E11 的胚胎延长培养
<ol>
	<li>在静态培养板中培养原肠胚形成前（E5.5）和早期原肠胚形成期（E6.5）胚胎，直至早期体节阶段（E8.5）。</li>
	<li>将解剖培养基在含5% CO₂的培养箱中预平衡1小时2 在 37 °C。 
	注意：为允许气体交换，不要将管盖完全关闭。</li>
	<li>通过向每个孔中加入 250 µL 新鲜配制的 EUCM 来准备培养板。将培养板置于 CO2 37 °C 培养箱中预平衡。 
	注意：尽管8孔板非常适合胚胎生长，但也可使用其他任何规格的培养板，只需根据培养板的尺寸调整培养基体积即可。</li>
	<li>按照E7.5所述技术，将卵圆柱胚胎从子宫中分离。去除胚胎的壁层卵黄囊，保留完整的外周胎盘锥体与卵圆柱相连。</li>
	<li>使用微量移液器将单个胚胎转移至8孔板的每个孔中，并将该板放入含有5% CO₂的培养箱内2 37 °C</li>
	<li>在体视显微镜下观察胚胎，仅选择具有完整羊膜腔、无明显损伤且无Reichert膜的胚胎进行培养。 
	注意：使用 20 µL 吸头转移 E5.5 胚胎，使用 200 µL 吸头转移 E6.5 胚胎。对于从 E6.5 开始的培养，可使用 freshly collected HBS 替代 HCS。</li>
	<li>培养24小时后，移除一半培养基，并加入250 µL freshly prepared prewarmed EUCM，确保胚胎始终浸没在培养基中。对于从E5.5开始培养的样本，在培养两天后（相当于E7.5），移除200 µL培养基，并加入250 µL新鲜EUCM。 
	注意：在静态培养过程中，胚胎可能会附着于培养板上（主要发生在使用塑料培养板时），这将严重影响胚胎发育。E5.5胚胎培养第一天更易发生附着现象。为防止附着，需使用精细、无菌的镊子小心地将胚胎从培养板表面推开。确认仅有胚外滋养层锥体仍附着于培养板表面。</li>
	<li>在体节早期（4-7个体节；于E5.5天分离并培养3天后，或于E6.5天开始培养2天后），按照此前所述E8.5阶段胚胎的操作方法，将胚胎转移至滚筒培养装置中。 
	注意：将胚胎转移到滚筒培养系统的时间若不在上述指定的体节阶段，会导致后续发育失败。与E7.5时期不同 子宫外 培养时，可将胚胎维持在21%氧气和5% CO₂的恒定环境中2，相较于动态氧浓度环境，可提供稍高的胚胎发育效率。</li>
</ol>

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<li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li>
</ol>

J.H.H. 担任 Biological Industries Ltd 的顾问，并已提交一项专利申请，涵盖本文所述的滚瓶和静态培养条件（由 J.H.H. 和魏茨曼科学研究所提交）。其他作者声明无竞争利益。

本文所述的培养方案可维持小鼠胚胎的正常且持续发育 子宫外 最长可达六天，从E5.5至E11。此前，处于这些发育阶段的胚胎在体外培养中仅能正常发育较短时间（最多48小时）。15将气体调控模块与滚筒式培养孵育器耦合，以精确控制氧气浓度和高压气体压力，对于本文所述的小鼠胚胎的适当培养至关重要。将气体压力增加至7 psi可增强氧气扩散，使得胚胎在最高达21% O₂的大气环境中发育至E11阶段。2/5% CO₂2，与先前采用的95% O₂条件相比216, 长期可能对胚胎有害。此外，已知氧浓度在胚胎发育中起着关键作用，因为早期植入后胚胎发生是在低氧条件下进行的17因此，晚期原肠胚的成功培养需要初始5% O₂2 大气环境，随着胚胎发育，氧浓度动态增加。值得注意的是，在5% O₂的静态培养条件下培养前/早期原肠胚2 与21% O₂相比，显著降低了胚胎正常发育的效率...

哺乳动物胚胎的宫内发育限制了对植入后早期发育阶段的研究1,2胚胎植入子宫后，其发育过程难以接近，这阻碍了人们对关键发育事件的理解，例如动物体轴的建立、胚层的特化以及组织和器官的形成。此外，早期植入后胚胎体积非常微小，使得活体成像观察极为困难。 在子宫内 之前&#160;E103无法在这些阶段观察和操作活体胚胎，限制了对植入后早期胚胎发生的研究，仅能获得发育过程中的静态图像。
实验方案 体外 哺乳动物着床前胚胎的培养技术已得到充分建立，具有可靠性和常规应用性4然而，建立 子宫外 支持哺乳动物着床后胚胎正常生长的培养系统成功率有限5一个多世纪以来，已提出了多种培养技术，主要是在常规静态培养板中培养胚胎6,7,8 或旋转瓶（滚瓶培养）5,9,10这些平台有助于拓展对哺乳动物着床后发育过程的认识11,12，尽管对正常胚胎存活率极低，且仅限于短期培养。胚胎在培养开始后24-48小时即已出现发育迟滞和形态学异常。
本研究详细描述了ex utero胚胎培养系统的建立方法，该系统可支持胚胎从原肠胚形成前阶段持续发育至器官发生的较晚阶段，最长可达植入后六天的发育时长13。本文介绍了改进的滚筒培养方案，该方案可支持E7.5胚胎（神经板和头褶阶段）生长至后肢形成阶段（约E11），并通过结合静态培养板与滚筒培养平台，实现了从E5.5/E6.5阶段开始的延长培养。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 孔径滤器（250 mL）</td><td>JetBiofil</td><td>FCA-206-250</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 孔径注射器 PVDF 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>8 孔 &amp;micro;-板 玻璃底/ibiTreat</td><td>iBidi</td><td>80827/80826</td><td></td></tr><tr><td>带气体进口适配盖的瓶子</td><td>Arad Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塞子（带孔）</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 06</td><td>用于将瓶子密封至滚筒</td></tr><tr><td>塞子（实心）</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 07</td><td>用于密封旋转滚筒</td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 03/BTC 04</td><td>可选用小号玻璃瓶 BTC 03 或大号玻璃瓶 BTC 04</td></tr><tr><td>D-(+)葡萄糖一水合物</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10100-30/45</td><td></td></tr><tr><td>数字压力计</td><td>上海本旭电子科技有限公司</td><td>BX-DPG80</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11880</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Biological industries</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biological industries</td><td>04-013-1A</td><td></td></tr><tr><td>气体调控模块</td><td>Arad Technologies</td><td>HannaLab1</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>谷氨酰胺</td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>显微外科镊子（Dumont #5, #55）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（玻璃）</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（塑料）</td><td>Alexred</td><td>SO P12201</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biological industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm 和 100 mm）</td><td>Falcon</td><td>351007/351029</td><td></td></tr><tr><td>精密培养系统</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC01</td><td>配备气体鼓泡装置套件的 BTC01 型号</td></tr><tr><td>促凝无菌试管（5 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#456005</td><td></td></tr><tr><td>大鼠全胚胎培养血清</td><td>ENVIGO Bioproducts</td><td>B-4520</td><td></td></tr><tr><td>配备加热板的体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器（5 mL、10 mL），用于血清过滤</td><td>Pic Solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero 小鼠胚胎培养：从原肠胚形成前到高级器官发生的阶段

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

哺乳动物胚胎的着床后体外培养方法通常效率较低，且仅限于从子宫中分离后的短暂培养时期。近年来已开发出一些平台，能够实现从小鼠胚胎卵圆柱阶段到高级器官发生阶段的高效且长期的ex utero（体外）培养。这些平台可支持原肠胚形成前胚胎（E5.5）直至后肢形成阶段（E11）的正常且精确的发育。在该体系中，晚期原肠胚（E7.5）在旋转瓶中培养，而从原肠胚形成前阶段（E5.5 或 E6.5）开始的延长培养则需要静态培养与旋转瓶培养相结合。此外，O2 和 CO2 浓度、气体压力、葡萄糖水平的精确调控，以及特定的ex utero培养基的使用，对于胚胎的正常发育至关重要。本文提供了一套详细的延长ex utero小鼠胚胎培养操作步骤。从小鼠原肠胚形成至器官发生阶段实现正常的ex utero胚胎培养，为研究胚胎发育过程中不同实验干预的影响提供了有力工具。

E7.5 胚胎（晚期原肠胚阶段）所描述的滚管培养条件可支持胚胎持续且正常的生长，在培养 4 天后平均效率接近 75%图2 和 表1）。胚胎发育效率可能因小鼠遗传背景的不同而有所差异，但通常较为稳定（图 2C）。以HBS替代HCS进行补充，在培养4天后可达到约68%的效率 子宫外 培养，具体取决于小鼠的遗传背景（图 2D 和 表2）。胚胎发育 子宫外 可正常发育至约44体节期。此后，由于缺乏尿囊胎盘，胚胎出现发育异常，导致此阶段因胚胎体积增大而无法获得充足的氧气和营养供应。
E6.5胚胎（早期原条）在静态培养板中的发育可被准确重现，效率为 &gt;90%直至早期体节阶段E8.5，使用含HCS和HBS的EUCM图3, 表3</str...

一种改进的全胚胎培养平台，可支持小鼠着床后胚胎从原肠胚形成前期到高级器官发生阶段连续且稳定的体外发育，最长可达六天。ex utero。在本方案中，我们详细阐述了使用静置培养板和旋转瓶系统进行胚胎成功培养的标准操作流程。

Ex Utero 小鼠胚胎培养：从原肠胚形成前到高级器官发生的阶段

哺乳动物胚胎在植入后的培养方法通常效率较低，且仅限于从子宫中解剖取出后的短暂培养时期。

该方法对于理解哺乳动物原肠胚形成过程具有重要意义。通过使长期以来隐藏在母体子宫内的胚胎发育阶段能够在活体胚胎中进行实验，该方法使得小鼠胚胎在体外持续高效且适当地生长，最长可达6天。快速而准确的胚胎解剖以及原肠胚形成前的气体浓度和压力控制是胚胎成功生长最关键的步骤。开始培养7.5天或更晚期的小鼠胚胎时，应在胚胎解剖操作前至少1小时打开滚筒培养箱系统的旋转装置和加热单元。同时，向气体入口瓶和出口试管中加入经高压灭菌的水。接下来，通过按下主开关打开气体调节模块，然后使用相应的控制器将氧气和二氧化碳的浓度分别设定为5%。打开气体调节阀，并调节压力变送器上的电压开关，将气体压力设置为约6.5至7磅每平方英寸。使用数字压力表确认气体压力值。通过观察精密培养箱内装有出水的试管中产生的气泡速率，监测气体流量。通过关闭或打开水瓶盖上的气体流量阀来调节适当的气泡速率。确保气体流量使气泡以每秒2到4个的速度产生，或将气泡流量调节至气泡首次从充满水的出口管中冒出的位置。接下来，向培养瓶中加入2毫升培养基。使用中空硅胶塞密封瓶子，并将其插入中空旋转鼓中预平衡1小时。使用实心塞子保持旋转鼓中的空位处于密封状态。接下来，从已安乐死的妊娠雌鼠体内解剖出胚胎。用70%乙醇清洁腹部，使用剪刀剪开皮肤和腹壁。找到子宫的一端，在卵巢与子宫交界处剪断。沿子宫继续剪至另一端，然后转移至盛有DPBS的100毫米培养皿中。用DPBS快速清洗胚胎组织，并成对切开以方便操作。将所有成对的胚胎组织转移至已预平衡的解剖液中，置于60毫米培养皿内，随后将其分离为单个胚胎组织。接着，使用粗镊子撕开子宫组织，去除胚胎组织的子宫壁，然后用精细的显微外科镊子剪除梨形蜕膜的尖端。将镊子插入胚胎旁边，使其与胚胎的长轴平行，然后张开镊子，将蜕膜一分为二。最后，用精细镊子从蜕膜中夹住胚胎，并将壁层卵黄囊从胚胎上剥离，使完整的外胎盘锥体仍附着在卵柱上。选择处于神经板期或早期头褶阶段、且上胚层无损伤的胚胎。将5至6枚选定的胚胎转移至已预平衡的玻璃培养瓶中，每瓶放入一枚，并将培养瓶置于37摄氏度、含5%氧气和5%二氧化碳的旋转培养系统中。培养原肠胚前期和原肠胚早期胚胎及静态培养板时，向8孔板的每个孔中加入250 µL新配制的体外胚胎培养液。将培养板放入37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行预平衡。按照先前所示方法将胚胎从子宫中分离后，使用微量移液器将各个胚胎转移至8孔板的每个孔中，并将该板置于含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱内。在体视显微镜下观察胚胎，仅选择具有完整羊膜腔、无明显损伤且不含Reichert膜的胚胎进行培养。本方案中所述的7.5天龄胚胎滚筒培养条件可支持胚胎持续且正常的生长发育，经过4天培养后的平均效率接近75%。胚胎发育效率在不同遗传背景的小鼠中有所差异，但总体保持稳定。使用HBS替代HCS进行补充，在培养4天后可达到约68

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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了解小鼠胚胎体外培养技术，用于研究原肠胚形成至晚期器官发生的发育过程。该方法支持胚胎在子宫外持续生长长达六天，为发育生物学研究提供可靠平台。

Ex Utero 小鼠胚胎培养：从原肠胚形成前到高级器官发生的阶段

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