小鼠输卵管的显微解剖与分离：不同节段的识别与单细胞制备

输卵管的不同节段具有不同的生理功能，且对病理变化的易感性也各不相同。由于小鼠输卵管非常细小，识别其不同节段具有挑战性，同时通过组织解离获得足量且分化良好的细胞也较为困难。在本视频中，我们将演示如何解旋小鼠输卵管，辨认不同的节段以便进行独立分析，最后展示如何获得相对较高产量的分化型解离细胞。

更深入地了解壶腹部特有的微环境，可能有助于改进体外受精技术。此外，通过将漏斗部与其他输卵管节段进行对比，我们有望更清楚地理解漏斗部易于发生恶性转化的倾向。单细胞解离程序可从输卵管中分离出间质细胞以及上皮细胞。

我们的方法还提供了分别分析免疫细胞、平滑肌细胞和上皮细胞对输卵管生理学和病理学贡献的机会。在解剖显微镜下操作起初可能较为困难。建议先使用较大的管道（如子宫）进行练习，以确保所用工具适合输卵管的显微解剖。

首先，用胶水将一块齿科蜡固定在培养皿上，并使其干燥。然后用70%乙醇对培养皿进行消毒。此时表面已准备好用于解剖。

准备解剖时，将含有牙科蜡的培养皿固定在解剖显微镜下的冷台上。用70%乙醇消毒动物的腹侧表面，然后用无菌解剖剪刀打开腹腔和盆腔。

将胃肠道移至一侧，以找到背侧的双角子宫。沿每个子宫角向前追溯，找到位于肾脏下方、包裹在子宫脂肪垫中的每侧输卵管和卵巢。然后使用解剖剪切除两侧的输卵管，连同卵巢以及仍附着的部分远端子宫角。

将每个侧子宫角剪下，保留约一到两厘米的子宫角与盘绕的输卵管和卵巢相连。立即将组织浸入两毫升冷解剖液中，然后用无菌的25号针头将子宫组织固定在牙科蜡上，以固定组织便于解剖。清除卵巢周围的脂肪垫和结缔组织，以便清晰观察输卵管。

使用1毫升注射器滴加1至2滴无菌1%亚甲蓝染色液，孵育30秒至1分钟。用冷DPBS冲洗，然后吸除所有液体。轻轻将卵巢从盘绕的输卵管中拉出。

在阔韧带的输卵管系膜膜处进行切开，以将卵巢从输卵管上分离，同时不损伤输卵管组织。找到位于子宫输卵管连接处外侧的输卵管远端伞部。轻柔牵拉输卵管，并使用弹簧式显微剪剪除输卵管系膜，以展开输卵管。

剪切输卵管以获取漏斗部区域。然后在第二和第三螺旋之间进行切割，分离出壶腹部区域。最后，将剩余部分切割至输卵管子宫交界处，即峡部区域。

立即用液氮速冻分离的组织片段，然后向组织中加入200微升冷的RNA提取试剂和等体积的匀浆珠混合物，用于RNA提取。从伞部区域开始，用弹簧剪纵向剪开输卵管，并用镊子作为支点暴露管腔上皮。将剪开的部分及剩余的输卵管组织切碎成约1至2毫米的片段。

然后向组织中加入5 mL温热的非酶解离缓冲液，在37摄氏度下孵育。此处显示的是occludin、细胞核和乙酰化微管蛋白呈阳性的细胞簇的荧光和相差图像。红色代表occludin，蓝色代表细胞核，绿色代表乙酰化微管蛋白。

在整个实验过程中，带有纤毛的顶膜保持完整，并能耐受进一步的单细胞消化。在这些代表性图像中，显示了红色、蓝色、相衬、绿色通道及合并图像。经过短暂的蛋白酶孵育后，大部分细胞呈单细胞状态。

碘化丙啶染色显示，在明场、红色通道PI阳性及合并图像中，细胞活力约为93%。合并图像的插图显示单个解离细胞上完整的纤毛边缘。此类细胞具有活跃摆动的纤毛。

采用微量分光光度计和生物分析仪对总RNA的得率和质量进行评估。结果显示，除漏斗部样本外，本方法每个组织片段可获得800至1,200纳克RNA，而漏斗部样本可能需要合并两只动物的样本才能获得适用于后续检测的足够RNA量。本文所示漏斗部结果来自两只动物的合并样本，共计四个漏斗部区域。

本方案利用微量分光光度计和生物分析仪成功获得了高纯度RNA。样品在260 nm与280 nm处的吸光度比值介于1.8至2之间，符合高纯度RNA核苷酸的典型特征。对样品进行生物分析显示其RNA完整性良好，测定的RNA完整性数值（RIN）高于7，适用于后续的表达分析和测序分析。

注意保留1至2厘米的输卵管末端，以便将输卵管系统固定在解剖平台上。此外，使用甲苯胺蓝染料有助于快速展开输卵管。展开速度越快，组织保存效果越好，RNA降解程度也越低。

该方法足以获得适用于RNA测序的高质量RNA，从而实现各个节段的独立测序。细胞解离步骤适用于单细胞测序或流式细胞术，可实现更精确的节段和细胞水平分析。该方法将有助于推动该领域超越整体管装分析，克服其掩盖节段或单细胞水平差异的局限性。