测定带状纤维粘弹性的生物制备及机械技术

我们方法的重要性在于它能够回答以下问题，即将晶状体悬挂在眼睛内的纤维的带状纤维的粘弹性是什么？我们技术的主要优点是，它可以量化来自有和没有靶向基因修饰的小鼠的小而脆弱的区域纤维的粘弹性特性。编码微纤维蛋白的基因突变是几种遗传性综合征疾病的基础。

使用我们的技术，我们可以研究特定突变如何改变微纤维的生物力学特性。首先，在安乐死小鼠后，使用细镊子去除眼睛。将固定针的尖端插入眼壁，并将其放置在玻璃体房的中心，注意不要损坏晶状体。

小心地将刺穿的眼睛转移到充满4%多聚甲醛和磷酸盐缓冲盐水的管中。打开将针头连接到位于样品上方25厘米处的固定储液槽的阀门，该储液槽在固定期间保持相当于眼睛内15至20毫米汞柱的正压，并使样品固定过夜。第二天，取出固定针，在磷酸盐缓冲盐水中洗眼10分钟。

通过使用眼科手术剪刀和体视显微镜，在靠近视神经头的眼睛壁上做一个全层切口。将切口向前延伸至赤道，然后绕眼睛的赤道周延伸，同时小心地保留微妙的睫状突和相关的带状纤维。通过移除地球背面来暴露晶状体的后表面。

使用镊子将解剖的眼睛从缓冲溶液中取出，并将其置于角膜朝下的干擦拭布上。轻轻地将角膜拖过湿巾表面以使其干燥。在50毫米培养皿的底部涂抹一滴速溶胶，并将平台固定在其上。

将盘子放在体视显微镜的载物台上，以便可以看到带有胶水的孔。为了将眼睛容纳在培养皿的平台孔中，请添加三微升速溶胶。小心地将其放入孔中并快速调整，使镜头的背面朝上。

用干湿巾的一角轻轻擦干镜片的外露面。要测量区域粘弹性响应，请打开秤，将培养皿放在秤上，然后启动秤记录程序和相机软件。打开伺服电机控制器。

在计算机上启动控制器应用程序，并以 50 微米为增量设置运动参数。在毛细管杆中创建 90 度弯曲。将弯曲的毛细管滑入毛细管探头支架，然后拧紧固定螺钉。

在毛细管尖端，加入一小颗UV固化胶。使用机械手上的手动调整移动毛细管探头的尖端，并将其直接放在镜头的顶部。通过使用显微镜相机进行前视检查和侧视图，检查UV胶水的底部是否在镜头顶部居中。

在通过相机观察时，降低探头尖端，直到UV胶与镜头接触并覆盖其上表面的1/3至1/2。使用380至400纳米波长和约1毫瓦强度的定向近可见UV光源固化胶水。将PBS溶液添加到培养皿中，直到眼睛被覆盖到至少两毫米的深度。

将圆柱形透镜放在显微镜前，靠近培养皿，不要触摸它。同时，在计时器程序中启动日志记录。使用相机拍摄眼睛和探头的照片。

60秒后，开始50微米的位移。每60秒重复一次，直到实验完成，如所有带状纤维断裂所示。在运行完成后保存缩放记录数据，并将其导出为兼容的电子表格格式。

另外，保存在运行期间获得的镜头图片。将数据导入电子表格。使用第一个和最后一个刻度读数，插值背景读数中由于蒸发而随时间变化的漂移，然后从每个时间点的读数中减去插值的背景。

在执行测定并校正蒸发后，粘弹性数据的图形被反转。瞬时和放松力的大小随着每步进增加约1， 000秒而增加，然后随着区域纤维开始断裂而下降，直到所有纤维断裂时达到1， 500秒的时间点。对于该演示，还比较了野生型小鼠和MAGP-1缺陷小鼠的粘弹性反应。

在0到600秒的初始时间，这些图彼此相似，表明带状纤维的粘弹性没有显着改变。然而，在MAGP-1敲除小鼠中，纤维过早断裂。利用引体向上法对1个月和1岁阶段的野生型小鼠进行区状纤维断裂力。

结果表明，野生型小鼠的纤维强度随着年龄的增长而增加。在这些步骤中，任何意外接触培养皿都可能导致眼壁相对于眼晶状体移动，从而可能损坏区域纤维。这种上拉测定有助于鉴定有助于微纤维拉伸强度的蛋白质。

我们将使用这些信息来构建更逼真的区域光纤内部模型。