Name: iPSC来源心肌细胞中的高通量光学控制和记录钙信号，用于毒性测试和表型药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习使用全光学方法在iPSC来源心肌细胞中控制和记录钙信号，实现高通量药物筛选与毒性测试。该技术可量化表型模式并长期观察药物效应，适用于心脏疾病研究与新药开发。

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我们感谢东京大学的 Robert Campbell 教授分享材料并进行富有价值的讨论；感谢分子装置公司的 Chia-Lin Ho 博士提供技术支持。

左心室致密化不全心肌病（LVNC）患者的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）由台湾大学医院提供。用于重编程为诱导多能干细胞的患者样本采集及维持方案14遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》（涉及人类受试者的医学研究伦理原则），并经台湾大学医院机构审查委员会：研究伦理委员会办公室批准（#201612099RINC）。其他 iPSC-CM 来自商业供应商。本机构使用诱导多能干细胞&#160;衍生细胞无需特殊许可。
1. 诱导多能干细胞来源的心肌细胞制备
<ol>
	<li>在将iPSC-CM从低温保存中取出解冻之前，先准备好多孔板。在96孔微孔板的每个孔中加入100 µL浓度为50 µg/mL的纤连蛋白/0.2%明胶溶液（见材料表），确保完全覆盖所有表面。</li>
	<li>将板置于37 °C、湿润的培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>在细胞解冻前30分钟，将培养基（见材料表）升温至室温。 
	注：本方案中将室温定义为25 °C。</li>
	<li>将iPSC-CM从液氮储存罐转移至37 °C水浴中。 
	注：iPS-CMs通常由学术或商业来源以干冰运输。收到后应立即转移至液氮中保存，直至使用。</li>
	<li>在冰完全融化前取出冻存管，并用75%乙醇喷洒管体表面。</li>
	<li>将冻存管移至II级生物安全柜中，轻柔地将内容物转移至含有9 mL室温培养基的新15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>在室温下以200 × g 离心3分钟。</li>
	<li>用移液器弃去上清液，并在1 mL含有10 µM ROCK抑制剂（Y27632）的培养基中轻柔重悬细胞（见材料表）。 
	注：为最大限度回收细胞，避免对解冻后的细胞进行反复吹打。</li>
	<li>移除孔中的包被溶液，并迅速加入50 µL含有10 µM ROCK抑制剂的培养基。</li>
	<li>使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板确定活细胞数量15。</li>
	<li>根据制造商说明书16，将细胞以100,000–150,000 个细胞/cm2的密度接种于包被好的96孔板中。</li>
	<li>24小时后，确认贴附在板表面的细胞已彼此接触。 
	注：单个细胞在长期培养中存活率较低，且通常表现出更大的变异性。</li>
	<li>每2天更换一次预温的维持培养基。 
	&#8203;注：对于长期药物处理，每2天对LVNC iPSC-CM进行半量换液，可加入或不加入小分子药物。</li>
</ol>
2. 遗传编码钙指示剂的表达
<ol>
	<li>细胞接种72 h后，将GECIs病毒试剂盒（参见材料表）置于冰上解冻。</li>
	<li>使用维持培养基配制2×病毒试剂盒储存液。</li>
	<li>调整每孔培养基体积至100 µL，以准备细胞感染。每孔加入100 µL预混的病毒溶液，在37 °C孵育8–16 h。</li>
	<li>孵育后更换为200 µL预热的培养基。</li>
	<li>转导后24 h，使用成像系统（参见材料表）观察GECIs表达情况。 
	注意：GECIs表达水平在转导后48–72 h达到峰值。可在转导后24 h开始成像，但GECIs信号可持续超过一个月。</li>
	<li>在进行功能检测前，将细胞置于加湿培养箱中维持培养。</li>
	<li>在分化后第25天，使用感染方案（步骤2.1–2.6）对iPSC-CMs（源自LVNC患者的iPSC-CMs）感染ChR2-K-GECO病毒试剂盒（参见材料表）。</li>
</ol>
使用 Fluo-4 的染料法钙成像
<ol>
	<li>将Fluo-4粉末（见材料表）溶于DMSO中，配制成5 mM的储存液。</li>
	<li>用Tyrode's缓冲液将储存液稀释至Fluo-4终浓度为10 µM。 
	注：Tyrode's缓冲液的成分为：1.0 g/L碳酸氢钠、0.2 g/L氯化钙、0.1 g/L氯化镁、0.2 g/L氯化钾、8.0 g/L氯化钠、0.05 g/L磷酸二氢钠和1.0 g/L D-葡萄糖。</li>
	<li>更换一半培养基，加入10 µM Fluo-4溶液（使终浓度为5 µM）。</li>
	<li>将细胞在37 °C条件下孵育30分钟。</li>
	<li>用预热的Tyrode's缓冲液洗涤细胞，并在成像前更换为新鲜培养基。</li>
	<li>启动连续采集模式开始记录。 
	&#8203;注：连续采集模式是指无时间间隔地持续获取图像。iPSC-CM的搏动频率约为1 Hz，该连续采集模式用于收集搏动模式。</li>
</ol>
4. 毒性检测与表型筛选的图像采集及功能分析
<ol>
	<li>打开高内涵成像系统的所有设备（参见 材料表).</li>
	<li>验证培养箱温度达到 37 °C，且 CO₂ 浓度为 5%2 补充。在图像采集前，将系统保持在平衡状态2小时。 
	注意：热漂移是长期活细胞观察中的一个重要问题，1 °C 的温度变化可使焦平面移动约 1 µm，因此在开始图像采集前，必须确保物镜和载物台已达到目标温度。</li>
	<li>打开成像软件（参见 材料表）并为96孔板选择相应的板型设置。</li>
	<li>将无盖的96孔板放入腔室中，并在其上方装载活细胞密封环。 
	注意：活细胞密封环是一种用于实现环境平衡的适配器。</li>
	<li>选择 20x（图1 和 图2），60倍（图3 和 图4）和 20x（图5) 水浸物镜，具体选择取决于所需的空間分辨率。</li>
	<li>调整焦距，确保在实验数据采集前获得清晰的图像。</li>
	<li>每孔随机选取3-5个区域进行钙活性记录。 
	注意：每个区域必须包含至少20个细胞（n ≥ 20）。</li>
	<li>为不同的指示剂选择合适的滤光片：mNG-GECO、mtGCEPIA3 和 Oria1-G-GECO 使用 FITC 475/536；NIR-GECO2 使用 Cy5 631/692；ER-LAR-GECO 使用 ER 530/593；K-GECO 使用 Texas Red 560/624。</li>
	<li>为每个成像通道设置适当的发光二极管（LED）功率。 
	注意：在通过信噪比（信号指检测到的物体强度，噪声指检测到的背景强度）优化成像采集的LED功率时，信噪比应高于2。在本方案中，TRITC和FITC通常使用10%的LED功率，Cy5使用20%。</li>
	<li>将相机曝光时间设置为最长40 ms（25 Hz），记录持续时间为30 s，以采集心肌细胞中表达的mNG-GECO和K-GECO探针报告的钙瞬变信号图1-3 和 图5）。如果信噪比不足，则增加LED功率 &#60;2 在更高的帧率下。</li>
	<li>用于光遗传学刺激（图2 和 图3C，D），优化蓝光的功率（通常为5%-10%）和频率（1 Hz）。 
	注意：通常，人iPSC-CM会以约1 Hz的频率自发搏动，操作者需以快于自发频率的速率进行起搏。</li>
	<li>如果依次（图3）或延长（图4）测量时，必须不惜一切代价避免光毒性。这可能意味着需要降低照明光强，并通过增加相机曝光时间来补偿，例如在用于亚细胞钙离子实时三通道观察的时间序列实验方案中，将曝光时间增至100 ms2+ 信号（图4).</li>
	<li>使用异步分配程序添加 10 mM 咖啡因 通过 自动微流控系统（参见 材料表) (图 4). 
	注意：异步分液方案允许在添加咖啡因等药物时同步进行图像采集，从而避免图像之间的间隔。</li>
	<li>开始采集。</li>
</ol>
5. 小分子制备
<ol>
	<li>将 E4031、多非利特和维拉帕米用 DMSO 溶解，然后用台氏液缓冲液稀释。培养基中 DMSO 的终浓度为 0.1%（v/v）。</li>
	<li>将化合物溶液配制为所需工作浓度的两倍（即2x），并在添加前于37 °C预热平衡。 
	注意：添加培养基后应尽量减少温度波动，因为细胞收缩力具有温度依赖性，温度变化的影响非常迅速。</li>
	<li>将化合物加入对应的靶孔中。</li>
	<li>加入100 µL双倍浓度（2x）的化合物 通过 自动微流控系统（参见 材料表将样品加入孔板，在所需孵育时间（通常为15分钟）后开始检测。</li>
</ol>
6. 图像处理与分析
<ol>
	<li>通过软件自动检测随时间-转数变化的脉冲特征，将信号区域与背景分离。</li>
	<li>使用钙峰分析软件（见材料表）分析搏动频率（BPM）、峰值信号（振幅）、钙瞬变持续时间50%（CTD50）、钙瞬变持续时间90%（CTD90）、上升时间及衰减时间（图1C）。 
	注意：在这些设置中，前10秒内光漂白现象明显，之后信号趋于稳定。因此，钙峰分析的时间范围为11–30秒。在三通道记录（图4）中，需手动勾画细胞轮廓以测量强度变化。</li>
</ol>

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</ol>

LumiSTAR 已针对 K-GECO、NIR-GECO 和 LAR-GECO 的使用申请了专利保护。

为了成功进行高通量筛选，信号必须在培养容器中均匀分布，以确保在成像采集过程中能够自动选取随机的兴趣区域（ROIs）。尽管化学钙指示剂很容易满足这一要求，但传统的基因编码探针往往产生斑块状而非连续片层状的信号，限制了其应用。使用病毒转导系统可实现靶细胞中多个指示剂的高表达水平27,28，且表达水平相当，优于传统的转染方法。不同细胞类型可能需要不同的启动子，因此基因递送系统的选择也需相应调整29,30,31。在异质性细胞模型中，特定细胞类型的转导效率和表达效率可能存在差异。一方面，这可能限制某些细胞的应用；但另一方面，该现象也可被利用来在共培养体系中区分特定细胞类型32。
该方法的主要优势在于通过自动化摆脱了实验人员与样本之间一对一的操作模式。在标准的多孔板实验中，若需从单个孔内的四个位置采集数据，我们估计使用显微镜从一块96孔板中获取30秒视频大约需要15小时。而在自动化系统中，这一过程仅需约4小时。此外，手动分析数据所需时间远超数据采集本身。本文所使用的分析系统比手动分析速度快约200倍。最终结果是显著优化了工作流程，并大幅节省了时间和成本。
与加载钙染料后存活数小时的原代心肌细胞相比，在诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CM）中表达的GECI 通过 病毒递送系统可在存活数月的实验模型中产生信号。这些模型可采用多孔板形式进行培养，并利用为小分子筛选而开发的高内涵成像系统，对其实行同步连续分析。这提供了一个简单的人源性实验平台，可用于检测药物在更接近患者实际用药时长（数周或数月）下的效应，而非传统毒理学检测中通常使用的数分钟时间尺度。
通过引入从绿色到近红外具有不同发射特性的基因编码钙离子探针（GECI），该系统可扩展用于多参数测量。此类实验在实验设计中需要合适的激发光源和滤光片组，以确保信号相互分离。在药物筛选应用中，除了药物分配系统外，还需要稳健且高效的分析平台。尽管本文描述的模型主要聚焦于多种动态钙离子指示剂的使用，但该方法也可修改用于检测细胞形态或功能的结构标记物。由于结构标记物的搏动间变异性较小，而细胞内钙离子浓度可发生高达百倍的变化，因此结构标记物通常更易于观察。该方法在罕见病研究中可能尤为有价值，因为来源于患者的诱导多能干细胞（iPSC）中间体可能包含特定疾病的全部遗传驱动因素和修饰因子，这些因素可在可扩展的细胞模型中得以保留，从而基于可独立于潜在生物学机制（该机制可能难以阐明）进行可视化的细胞表型，促进多种疾病的药物发现。

基于人类诱导多能干细胞（iPSC）的模型被认为是实现动物实验“3R”目标（替代、减少和优化）的一种有前景的解决方案1,2。iPSC来源的心肌细胞已被用于疾病建模和药物发现，因其能够重现人类生物学的关键特征3。通常使用化学染料进行钙成像，以观察药物处理前后细胞的活动状态4,5。然而，基于化学染料的钙感应探针会直接抑制Na, K-ATP酶并干扰细胞功能6，因此在使用化学染料时，对同一细胞进行数小时或数天的连续追踪存在困难。本文利用一系列基因编码的钙指示剂（GECIs）7,8,9,10，覆盖广泛的激发/发射波长和钙亲和力范围，构建了一个心脏毒性检测平台，可实现长时间内对多个细胞器进行实时同步测量11。
为了进一步推动基于钙信号的高通量筛选技术在iPSC-CM模型中的应用，超越此前利用基因编码工具在学术研究中所展示的范畴，本研究通过将红移型钙离子指示剂R-GECO或K-GECO与光遗传学工具ChR212,13共表达，并开发出即用型病毒试剂盒，实现了该技术的优化。通过将成像过程转移至配备自动微流控系统的高内涵成像设备，将化合物添加的单通道移液操作与活细胞成像相结合。最后，实验流程中的两个关键环节——图像处理与数据分析——也得到了改进并实现自动化。

<table><tbody><tr><td>96孔板</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>自动微流控系统</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>该设备配备单通道移液器，可用于自动添加化合物</td></tr><tr><td>咖啡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Cardiosight-S 人诱导多能干细胞来源心肌细胞</td><td>NEXEL</td><td>C-002</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>1096780100</td><td></td></tr><tr><td>多非利特</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0016</td><td></td></tr><tr><td>E4031</td><td>Tocris</td><td>1808</td><td></td></tr><tr><td>ER-LAR-GECO 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AA001a</td><td>红移型GECI包装于腺病毒载体中</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>化学性钙离子敏感染料</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPSC-CMs 维持培养基</td><td>NEXEL</td><td>CMS-002</td><td>iPSC-CMs 培养基（Cardiosight-S 培养基）+ Cardiosight-S 补充剂</td></tr><tr><td>iPSC-CMs 培养基（Cardiosight-S 培养基）</td><td>NEXEL</td><td>CMS-002</td><td></td></tr><tr><td>K-GECO 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AA005a</td><td>红移型GECI包装于腺病毒载体中</td></tr><tr><td>LumiCAL 软件</td><td>LumiSTAR</td><td>LUCS01a</td><td>用于分析心肌细胞钙峰的软件</td></tr><tr><td>mNG-GECO 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AL008a</td><td>亮度更高的绿色GECI包装于慢病毒载体中</td></tr><tr><td>mt-GCEPIA3 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AL011a</td><td>靶向线粒体的GECI包装于慢病毒载体中</td></tr><tr><td>NIR-GECO 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AV004a</td><td>近红外GECI包装于病毒载体中</td></tr><tr><td>Orai1-GGECO 病毒试剂盒</td><td>LumiSTAR</td><td>AL010a</td><td>靶向Orai1的GECI包装于慢病毒载体中</td></tr><tr><td>台氏盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2145</td><td></td></tr><tr><td>盐酸维拉帕米</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

了解可兴奋细胞在健康和疾病状态下的功能，以及小分子或基因操作如何改变其行为，具有重要意义。具有多个发射窗口的基因编码钙指示剂（GECI）可组合使用（例如，用于同时观察不同的亚细胞事件），或与可兴奋细胞中其他光依赖性效应元件联用（例如，将基因编码的光遗传学控制与光谱兼容的钙指示剂结合）。此类方法已应用于原代神经元、干细胞来源的神经元、心肌细胞以及胰岛β细胞。然而，由于仪器、分析软件、指示剂性能和基因递送效率的限制，这些方法在提高通量或延长观察时间方面一直面临挑战。本文将高性能绿色GECI mNeonGreen-GECO（mNG-GECO）与红移GECI K-GECO结合光遗传学控制，利用高内涵成像系统，在高通量成像模式下实现了细胞活动的全光学调控与可视化。文中展示了利用健康个体和患者来源的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CM）进行心脏毒性检测和表型药物筛选的应用。此外，在iPSC-CM模型中，还展示了通过组合不同光谱特性和钙亲和力的指示剂变体（如NIR-GECO、LAR-GECO以及靶向不同细胞区室的mtGCEPIA或Orai1-G-GECO）进行多参数评估的方法。

通过诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）表达mNG-GECO10，在有或无药物处理条件下观察到的自发性钙振荡现象如图1和动画视频1所示。利用mNG-GECO获得的动力学曲线显示，小分子离子通道抑制剂维拉帕米（verapamil）、多非利特（dofetilide）和E4031对钙瞬变产生了预期的影响（图1B）。如图1C所示的典型钙瞬变曲线可通过钙峰分析软件进行分析，以获得峰值信号（振幅）、钙瞬变持续时间50%（CTD50）、钙瞬变持续时间90%（CTD90）、上升时间及衰减时间等参数。维拉帕米是一种L型钙通道阻滞剂17，可完全抑制细胞内的钙内流，结果符合预期（图1B）。多非利特和E4031为hERG通道抑制剂18,19,20，被归类为实验性III类抗心律失常药物。与对照组相比，多非利特处理组（p &lt; 0.05）和E4031处理组（p &lt; 0.001）的衰减时间均显著延长。与仅使用溶剂对照组相比，E4031处理还导致CTD50（p &lt; 0.01）和CTD90（p &lt; 0.001）显著延长（表1）。这些结果与既往研究中报道的对QT间期的影响一致；QT间期是临床上评估复极化的重要指标，通过体表心电图测量Q波起点至T波终点之间的时间长度来确定12,21。
在自发搏动的细胞中进行CTD评估的一个难点是搏动频率的变异性对CTD造成的影响。这一问题在iPSC-CM模型中尤为突出，即使所有细胞均来自同一母代冻存管，96孔板中的每个孔仍可能具有各自不同的搏动频率。可通过光刺激或电刺激的方式施加固定的搏动频率。为了在标准化起搏条件下评估E4031的剂量-反应关系，采用表达ChR2和K-GECO7的iPSC-CM，并使用1 Hz、470 nm的光脉冲进行光学控制，同时通过红色K-GECO信号进行观测（图2A 和 补充图1）。随着E4031浓度的增加，钙瞬变的峰值幅度显著降低（p &lt; 0.01），衰减时间延长（p &lt; 0.05）（图2B1）。E4031对峰值幅度降低的作用呈剂量依赖性，这一效应最为明显（图2B1、B2）。
尽管通常采用持续数分钟的短期研究进行心脏毒性评估，但针对与患者数周、数月甚至数年药物暴露情况相对应的慢性毒性的评估仍存在盲区。研究疾病或毒性效应时，若能覆盖与临床治疗时长相关的时段，将具有显著优势。我们利用全光学控制与检测系统，研究了一例左心室致密化不全（LVNC）患者来源的诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。在分化后第25天，将K-GECO病毒试剂盒（步骤2.2–2.6）转导至iPSC-CMs中。随后，在相同孔中每隔1–2周追踪K-GECO信号，无论是否追加药物处理。利用高内涵成像系统（步骤4.1–4.12）获取自发性钙活动（图3A、3B）以及光刺激起搏下的钙动力学（图3C、D，步骤4.11），并通过钙峰分析软件（步骤6）进行处理。如图3A、C所示，在病毒转导一个月后，无论是否使用光刺激起搏所需的额外光照，清晰的钙瞬变信号仍然可见。本研究发现了一种药物，在LVNC iPSC-CM模型中可提高搏动频率、使收缩间期规律化，并增强钙瞬变幅度（图3A、B）。从该数据中可得出两个重要观察结果：第一，从治疗角度而言，该药物效应在第63天和第70天时间点仍保持持久；第二，对于通常在较早时间点（通常<50天）的短暂窗口期（<1分钟）内检测化合物效应的研究领域而言，该化合物对疾病表型的调节作用直至第60天之后才显现，提示在标准筛选流程中，可能容易忽略作用机制较慢的药物。
搏动频率的变异性及其对钙瞬变持续时间的后续影响，不仅在同一时间点存在孔间差异，而且随着iPSC-CM在培养过程中的维持而发生变化，这种变化在同一孔内随时间推移而波动（图3B）。为了在连续实验中保持一致性，可采用1 Hz光学起搏，无论是否进行药物处理（图3C，D）。尽管第63天的结果显示出钙瞬变的积极趋势，表现为显著更高的振幅、更短的CTD90和更短的衰减时间；但在第70天时间点——提示在罕见病药物筛选过程中需要进行慢性评估——检测到早期后除极（EAD）。通过比较图3B，D中所示的搏动频率、钙瞬变振幅、CTD90和衰减时间的结果，可以定性评估在疾病表型分析或小分子评价中加入起搏方案的价值。
与基于化学染料的方法相比，使用基因编码钙离子探针（GECI）来可视化钙瞬变的一个优势在于能够将探针特异性地限制在细胞内的特定区室中。通过在单个细胞中多重组合多种颜色和/或亲和力不同的探针变体，这一能力可进一步扩展。因此，目前已开发出多种GECI，例如ER-LAR-GECO9、mtGCEPIA22,23（或Oria1-G-GECO）以及NIR-GECO28,24，可用于细胞模型中，单独或联合表达，以实时检测内质网/肌浆网（ER/SR）、线粒体（或CRAC通道）及胞质溶胶中产生的钙信号。这些探针可在iPSC-CM模型中联合使用（图4A，C），用于研究不同细胞内钙库之间的相互作用。例如，使用10 mM咖啡因处理可耗尽肌浆网中的钙储存，在此情况下，ER-LAR-GECO信号下降（表明肌浆网中钙的流失）伴随着NIR-GECO信号的降低（表明胞质钙浓度升高），结果符合预期。然而，其他细胞内区室如何受到这些波动的影响尚缺乏深入研究。尽管如此，加入绿色荧光的线粒体靶向探针mtGCEPIA3显示，在这些条件下线粒体发生了钙摄取（图4A，B）。
同样，通过加入探针 Orai1-G-GECO25 可以观察不同钙电流之间的相互作用，以揭示钙释放激活通道（CRAC）的 Ca2+ 电流（图 4C，D）。在 iPSC-CM 模型中，该信号随自发的胞质钙瞬变而升高（图 4D1，D2）。与此一致，咖啡因处理可引发胞质和 Orai1 通道均出现显著的钙瞬变。
公认的是，在心肌细胞模型中，大多数钙瞬变成像均使用钙离子荧光染料完成26。为实现不同钙成像方法的并行比较，本研究在诱导多能干细胞来源的心肌细胞模型中，将一种基因编码的钙离子指示剂与化学染料进行了对比。实验中对表达 K-GECO 的 iPSC-CMs 与负载 Fluo-4 的细胞进行了同步成像。表达 K-GECO 的心肌细胞在长时间内表现出稳定的搏动行为（图 5A，C）。然而，Fluo-4 的负载对该模型中的搏动频率和收缩持续时间（CTD）均产生了影响（图 5B，C），提示 Fluo-4 本身可能会影响此类实验的结果。在长时间暴露于成像探针的情况下，这种影响尤为显著；例如在多孔板成像模式中，若每孔的成像停留时间为一分钟，则可能发生此类情况。
<img alt="钙成像与分析：荧光显微镜、时间进程图、药物对钙瞬变的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：小分子离子通道抑制剂作用于iPSC来源的心肌细胞。 （A-B）以25 Hz采集的表达mNG-GECO的iPSC-CM时间序列图像。比例尺 = 50 µm。（B）添加化合物后典型的Ca2+振荡图示。来自表达mNG-GECO细胞的荧光信号以F/F0荧光比值表示，其中F0定义为基线荧光强度，F为各时间点检测到的荧光强度。（C）钙峰分析软件可提取包括半最大宽度（CTD50）、90%瞬变持续时间（CTD 90）、上升时间和衰减时间在内的多种参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="E4031 剂量-反应分析，F/F0 与时间关系图，剂量-反应数据，振幅，衰减时间图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：在光控起搏系统中使用 hERG 抑制剂 E4031 的剂量-反应示例。 （A）在不同浓度 E4031 条件下，以 10% 蓝光进行光刺激的记录曲线。以 25 Hz 采集的表达 K-GECO 的诱导多能干细胞来源心肌细胞的时间推移图像。（B1）使用不同药物剂量获得的钙瞬变代表性曲线。E4031 在振幅（B2）和衰减时间（B3）上的峰值分析及剂量-反应关系。蓝色条形表示 1 Hz、470 nm 脉冲光刺激。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心肌细胞活性分析；药物效应；图表；LVNC患者数据；搏动频率；光学起搏。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：全光学平台用于LVNC患者来源心肌细胞的长期药物表型筛选。（A）患者来源心肌细胞（分化后第70天）在有（红色）或无（蓝色）5 µM药物处理条件下的自发搏动活性代表性轨迹。（B）有或无5 µM药物处理条件下自发搏动活性的峰形分析。（C）在1 Hz光学刺激下，患者来源iPSC-CM中对药物反应的强度轨迹。（D）在1 Hz光学刺激下患者来源心肌细胞的峰形分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙离子活性分析；荧光显微镜（细胞质、内质网/肌浆网），咖啡因刺激图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：iPSC-CM 模型中的三通道亚细胞 Ca2+ 成像。（A-B）iPSC-CM 经转导表达定位于细胞质的 NIR-GECO2（红色）、内质网的 ER-LAR-GECO（黄色）以及线粒体 Ca2+ 指示剂 mtGCEPIA3（青色）等亚细胞钙探针。（B）给予 10 mM 咖啡因处理前后，进行三通道时间序列钙成像。（C-D）iPSC-CM 经转导表达细胞质 NIR-GECO2（红色）、内质网 ER-LAR-GECO（黄色）以及 CRAC 通道指示剂 Orai1-G-GECO（青色），并进行可视化观察。（D）采集三通道时间序列钙成像图像。（D1）使用 NIR-GECO2 和 Orai1-G-GECO 观察到自发的搏动间活性。（D2）经咖啡因处理后，内质网钙释放（ER-LAR-GECO 信号下降）伴随细胞质钙信号上升。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙信号分析图，K-GECO 与 Fluo4 对比，时间推移数据，频率，CTD90，衰减时间。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：在诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中，基因编码钙指示剂（K-GECO）与化学钙敏感染料（Fluo-4）的比较。 （A-B）K-GECO（A）和 Fluo-4（B）随时间变化的代表性钙信号轨迹。 （C）转导 K-GECO 或负载 Fluo-4 的 iPSC-CM 的钙瞬变分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>每分钟跳动次数 (BPM)</td>
			<td>CTD50 (秒)</td>
			<td>CTD90 (秒)</td>
			<td>振幅 (F/F0)</td>
			<td>上升时间</td>
			<td>衰减时间 (秒)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶剂对照 (0.1% DMSO)</td>
			<td>112.3657±10.95</td>
			<td>0.25±0.04</td>
			<td>0.41±0.01</td>
			<td>1.99±0.02</td>
			<td>0.07±0.01</td>
			<td>0.28±0.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维拉帕米 (1 µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多非利特 (5 nM)</td>
			<td>103.42±9.87**</td>
			<td>0.23±0.03</td>
			<td>0.46±0.03</td>
			<td>1.91±0.03</td>
			<td>0.07±0.01</td>
			<td>0.35±0.02*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031 (30 nM)</td>
			<td>75.73±12.08***</td>
			<td>0.37±0.04**</td>
			<td>0.58±0.08***</td>
			<td>1.55±0.02**</td>
			<td>0.11±0.04***</td>
			<td>0.35±0.07**</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：化合物添加对iPSC-CM模型中瞬时钙参数的影响。显著性水平用*（p ≤ 0.05）、**（p &lt; 0.01）和***（p &lt; 0.001）表示。
动画视频 1：仅使用载体处理的 iPSC 来源心肌细胞中通过 mNG-GECO 观察到自发性钙活动。提供了一段灰度图像的伪彩视频。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/fig1-video.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充图1：腺病毒载体的示意图。该载体包含作为效应元件的通道视紫红质ChR2，以及作为钙离子报告分子的红色荧光钙指示剂K-GECO，用于实现全光学检测。这种光敏离子通道可通过可见光谱中的蓝绿光范围实现可兴奋细胞的去极化。本实验中使用了470 nm的光。可兴奋细胞中的钙瞬变可由K-GECO同步成像，K-GECO需要绿色激发光并产生红色发射光。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/Sup%20r1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了用于高通量药物筛选和毒性检测的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活动的全光学控制与观测方法。展示了在时间和空间上对表型模式进行多参数定量分析的结果，并演示了药物在数小时内产生的长期效应或在数天内进行的连续测量。

了解可兴奋细胞在健康与疾病状态下的功能机制，以及小分子或基因操作如何改变其行为，具有重要意义。

我们展示了一种用于对诱导多能干细胞来源的心肌细胞中触发的细胞活动进行全光学控制与观测的多种方法，适用于高通量药物筛选和毒性检测。该方法可实现对表型模式在时间和空间上的多参数定量分析，能够观察药物在数小时至数天内的作用效果。此方法可应用于多种类型的细胞，例如神经细胞或β细胞，用于功能筛选和毒性测试。本实验操作将由我实验室的生物成像工程师 Wan-Chi Su 演示。在将诱导多能干细胞来源的心肌细胞从冷冻保存状态取出解冻之前，需预先准备好多孔板。用含有每毫升 50 微克纤连蛋白的 0.02% 明胶溶液对 96 孔微孔板的每个孔进行包被，每孔加入 100 微升，确保完全覆盖所有表面。将iPSC心肌细胞从液氮储存罐转移至37摄氏度水浴中。将冻存管移至二级生物安全柜中，轻轻将内容物转移至含有9毫升室温培养基的新的15毫升锥形管中。在室温下以200 × g离心3分钟。用移液器弃去上清液，再用1 mL含有10 µM ROCK抑制剂Y27632的培养基轻柔重悬细胞。按照生产商说明书，将细胞以每平方厘米100,000至150,000个细胞的密度接种到包被的96孔板中。24小时后，确保贴附在培养板表面的细胞彼此接触。接种细胞后 72 小时，将 GECI 病毒试剂盒置于冰上解冻。使用维持培养基配制双倍浓度的病毒试剂盒储备液。通过将每孔培养基体积调整为 100 微升，准备细胞以进行感染。向孔板中加入 100 微升预混病毒溶液，在 37 摄氏度下孵育 8 至 16 小时。孵育结束后，更换为 200 微升预热的培养基。转导后 24 小时，使用成像系统观察 GECIs 的表达情况。在进行功能检测之前，将细胞置于加湿培养箱中培养。开启高内涵成像系统的所有设备。确认培养腔室温度达到37摄氏度，并补充5%二氧化碳。打开成像软件，选择适用于96孔板的设置。将无盖的96孔板放入成像腔室，并在上方安装活细胞密封环。根据所需的空间分辨率，选择20X、60X和20X水浸物镜。在实验采集前调整焦距以获取清晰图像。每孔随机选择三到五个区域进行钙活性记录。针对不同的指示剂选择适当的滤光片。为每个成像通道设置适当的发光二极管功率。将相机曝光时间设置为最长40毫秒或25赫兹，并以30秒的记录时长进行流式采集，以观察心肌细胞中由MNG-GECO和K-GECO探针报告的钙瞬变信号。若在较高帧率下信噪比低于2，则增加发光二极管功率。进行光遗传学刺激时，优化1赫兹蓝光的功率和频率，然后开始采集数据。用DMSO重悬E4031 Dofetilide和维拉帕米，并用台氏缓冲液稀释。将化合物分配至对应的靶孔中。通过自动微流控系统，将100微升双倍浓度的化合物加入孔板中，并在所需的孵育时间后开始采集数据。利用软件通过随时间分辨率自动检测脉冲特征，将信号区域与背景分离。使用钙峰分析软件分析搏动频率、峰值信号、钙瞬变持续时间50%、钙瞬变持续时间90%、上升时间以及衰减时间。视频展示了经iPSC来源的心肌细胞表达NMG-GECO后，在有或无药物处理条件下自发性钙振荡的观察结果。利用MNG-GECO获得的动力学轨迹显示，小分子离子通道抑制剂维拉帕米（Verapamil）、多非利特（Dofetilide）和E4031对钙瞬变的影响符合预期。为了在标准化、起搏条件下评估E4031的剂量反应，采用每秒一次、波长470纳米的光脉冲对表达channelrhodopsin-2和K-GECO的iPSC心肌细胞进行光学控制，并通过红色K-GECO信号进行观察。随着E4031浓度的增加，钙瞬变的峰值振幅逐渐降低，衰减时间延长。E4031对峰值振幅降低的作用呈剂量依赖性，这一效应尤为明显。在病毒转导一个月后，即使未使用光刺激起搏的额外光照，仍可清晰观察到钙瞬变信号。该图显示了一种药物在LVNC诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC CM）模型中似乎可提高搏动频率、使收缩间隔规律化，并增加瞬时钙振幅。随着iPSC CM在培养过程中维持时间的延长，搏动频率的变异性以及随之对钙瞬变持续时间的影响也会发生变化。目前已开发出多种基因编码的钙离子探针（GECI），包括用于内质网的ER LAR-GECO、用于线粒体的MTG-Sepia以及用于细胞质的NIR-GECO，这些探针可分别或联合表达于细胞模型中，以实时检测内质网、肌浆网、线粒体和细胞质中产生的钙离子活性。可将GECIs与iPSC-CM模型结合，用于研究不同的细胞内钙库。表达K-GECO的心肌细胞随时间表现出稳定的搏动行为。然而，在该模型中，Fluo-4的加载影响了搏动频率和CTD，提示Fluo-4本身可能会影响此类实验的结果。我们提供一种简单的方法，用于研究对照组和患者来源细胞的表型特征，同时诱导性多能干细胞（iPSC）中间体可能为多种疾病的药物发现提供线索。

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科研

JoVE Journal

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医学

iPSC来源心肌细胞中的高通量光学控制和记录钙信号，用于毒性测试和表型药物筛选

我们介绍了一种利用激光扫描共聚焦显微镜从活细胞中分离快速（微秒级）钙信号与较慢钙流的方法。该方法通过记录细胞内数百像素的线扫描，检测钙离子指示剂的荧光强度波动。利用直方图分析，可分离出不同时间尺度的钙流信号。...

测量心肌细胞中的快速钙离子流

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人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

来源于人诱导性多能干细胞的自发收缩心肌细胞合胞体是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。本文介绍了一种高通量筛选系统，该系统利用钙敏感性荧光染料和温度可控的成像多孔板读数仪，定量分析外源性化合物对搏动频率的影响。...

在温度控制的384孔板中使用钙敏感荧光染料测量人诱导多能干细胞衍生心肌细胞合胞体的收缩

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。...

生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外...

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

学习使用全光学方法在iPSC来源心肌细胞中控制和记录钙信号，实现高通量药物筛选与毒性测试。该技术可量化表型模式并长期观察药物效应，适用于心脏疾病研究与新药开发。

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

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