刺激和分析 果蝇 中枢脑中的成人神经发生

本文提供了对成年 果蝇 造成穿透性创伤性脑损伤（PTBI）的详细方案，并检查由此产生的神经发生。

该协议具有重要意义，因为它展示了一种中枢脑损伤方法，该方法触发果蝇中的成人神经发生，而通常没有。我们预计，使用这种技术来了解成人神经发生的分子机制将与人类神经再生有关。学习这种技术需要耐心和毅力。

我们建议每天在5到10个大脑上练习几周，然后再收集大脑进行分析。在二氧化碳垫上麻醉苍蝇后。在闭合后六小时内对新近关闭的F1年轻雄蝇进行分类，并将它们放入含有食物的干净小瓶中，每瓶有40只或更少的苍蝇。

如果计划用EdU标记分裂细胞，则在10%蔗糖中制备200微升50碾或更多EdU，并将制备的溶液放在空小瓶中的23毫米圆形三级滤纸上，然后将雄蝇放入小瓶中，以便在受伤前六小时预先喂养。接下来，通过将大约100个针放入装有70%乙醇的1.5毫升微型离心管中5分钟，对Minutien Pins进行消毒。然后通过喷洒70%乙醇并用干净的无绒纸巾擦干二氧化碳垫和画笔进行消毒。

工具清洁干燥后，将40名或更少的F1男性转移到干净的垫上，并将其分成两组。一组将作为控制未受伤的苍蝇。第二实验组将受到穿透性创伤性脑损伤。

接下来，使用镊子从微型离心管中拉出四到五个新的Minutien销，并将它们放置在二氧化碳垫的边缘附近。然后在解剖镜下选择一个带有尖锐尖端的直小针。重复使用锋利的针脚，并将损坏或钝的针放在含有70%乙醇的单独管中，以便安全处置。

接下来，对于在体视显微镜LED灯上具有标准交叉基因型开关的苍蝇，LED灯配备了绿色荧光蛋白的适当激发和发射滤光片，允许在440至460纳米处激发，并允许在500至560纳米处进行可视化。然后选择实验组的苍蝇并放置苍蝇，使实验者具有头部胶囊的背侧视图，苍蝇的头部向右。使用镊子拿起并握住选定的Minutien别针，另一只手握住画笔。

然后将刷子放在胸背前部，轻轻向下推以稳定苍蝇。将细节针的尖端对准头部右侧的蘑菇体细胞体，并穿透头部胶囊。如果使用地标性眼球，则瞄准眼部和眼睛背缘之间的背头角质层。

完成损伤后，使用画笔将头部轻轻推离Minutien别针。如果使用大脑进行RNA测序或QRT PCR，则会使我们头部左侧第二次受伤。一旦所有实验苍蝇受伤，将对照和受伤的苍蝇放入单独的含有食物的标记小瓶中。

将小瓶水平放置，以防止苍蝇被食物捕获。将标准十字苍蝇放在25摄氏度，永久苍蝇在30摄氏度下变老。如果老化时间超过24小时，每隔一到两天将苍蝇转移到干净的食物上。

使用抗pH3是积极经历有丝分裂的细胞的标志物，在损伤后24小时观察到增殖显着增加。在每个对照中枢脑中观察到大约三个pH3阳性细胞。每个受伤的中枢脑中有11个pH3阳性细胞。

到七天时，每个对照细胞大脑中平均存在两个EdU阳性细胞。而每个受伤的中枢脑中有11个EdU阳性细胞，这与损伤后24小时用pH3抗体获得的结果相似。在14天时，对照组平均每个中枢脑一个EdU阳性细胞，受伤的大脑平均每个中枢脑有29个EdU阳性细胞。

证明细胞增殖至少持续到穿透性创伤性脑损伤后的第二周。当大脑在闭合后的前24小时内受伤时，观察到中枢脑中最强的增殖反应。到闭合后七天，穿透性损伤仍然导致增殖显着增加。

然而，到14天时，细胞的分裂能力显着下降到每个大脑一个分裂细胞。这与控制大脑相似。与对照组相比，使用permatwin标记系统在两天，两周内在受伤样品中检测到更多的permatwin克隆。

随着损伤后克隆数量的增加。受伤后两周，50%的受伤大脑中有新的蘑菇体神经元。这些新的神经元将其树突大约投射到蘑菇体花萼，并将轴突投射到蘑菇体的叶片上。

大脑中似乎再生的其他区域包括椭球体触角叶和侧角。在进行脑损伤时，请务必使用锋利的Minutien别针，因为使用钝或弯曲的别针会增加死亡率。另外，一定要不要用画笔在苍蝇身上用力过猛，因为这也会增加死亡率。

按照这一程序，免疫组织化学可用于量化自身增殖，也可用于识别新的神经元和神经胶质细胞。