Name: 刺激和分析 果蝇 中枢脑中的成人神经发生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 了解穿透性创伤性脑损伤诱导果蝇中枢脑成人神经发生的方法。该方案使用免疫组织化学技术量化细胞增殖并鉴定新生神经元，为研究人类神经再生机制提供重要模型。

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我们感谢Stacey Rimkus和Becky Katzenberger提供的技术协助，感谢Eduardo Moreno分享perma-twin果蝇品系。我们谨向Barry Ganetzky和David Wassarman致以诚挚谢意，他们富有启发性的讨论无疑推动了科学研究的进步；同时感谢Kent Mok、Cayla Guerra和Bailey Spiegelberg对本实验室工作的贡献。FasII抗体由Corey Goodman研发，来源于美国国立卫生研究院（NIH）下属国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）创建、现由爱荷华大学生物学系（爱荷华市，IA 52242）维护的发育研究杂交瘤库。本研究中使用的大部分黑腹果蝇（Drosophila）品系来自布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington Drosophila Stock Center, BDSC；NIH P40OD018537）。本研究得到以下资助：NIH T32 GM007133（KLC）；NIH NS090190（GBF）；NIH NS102698（GBF）；威斯康星大学研究生院（GBF）；以及威斯康星大学麦迪逊分校女性科学与工程领导力研究所（WISELI）（GBF）。

本方案遵循威斯康星大学麦迪逊分校的动物护理指南。
1. 为 PTBI 生成成年 Drosophila
<ol>
	<li>进行标准杂交时，将20只处女雌蝇y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417&#160;与10只y[1] w[1]17成年雄蝇共同放入含有培养基的试管中（见材料表）。为获得大量同步发育的子代，应同时设立10–20个杂交组合。该标准杂交产生的F1代子代基因型为：y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+。
	<ol>
		<li>将试管置于25 °C条件下进行交配和产卵。为最大化子代数量，每2–4天将亲本转移至新的试管中，并将之前的试管继续维持在25 °C。在亲本首次放入试管后的第18天丢弃该试管，以确保无F2代子代产生。 
		注意：每组亲本可产生3批子代（&#34;broods&#34;）。</li>
		<li>约10天后检查，此时F1代子代将开始羽化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行谱系研究时，使用基因型为w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp的F1代永久双生雄蝇15。为保持一致性，每次均应以相同方向进行该杂交。
	<ol>
		<li>为获得永久双生雄蝇，将20只处女雌蝇w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B与10只成年雄蝇w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15共同放入含有培养基的试管中。</li>
		<li>将试管置于17 °C条件下进行交配和产卵。每7天将亲本转移至含新鲜培养基的新试管中，并将所有试管维持在17 °C。在亲本首次放入试管后的第35天丢弃该试管，以确保无F2代子代产生。</li>
		<li>约21天后检查，此时F1代子代将开始羽化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 穿透性创伤性脑损伤（PTBI；图1）
<ol>
	<li>筛选新羽化的F1代果蝇。在羽化后6小时内挑选年轻的雄性个体，放入装有食物的洁净小瓶中，每瓶不超过40只果蝇。 
	注意：此操作在上午进行最为方便，可通过 CO 麻醉果蝇来实现2 垫板并识别肠道内仍含有胎粪（透过腹壁可见深绿色斑点）的成年雄性个体。</li>
	<li>预先用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）孵育（参见 材料表若计划使用 EdU 标记分裂细胞，需在损伤前 6 小时给予。详见步骤 3。</li>
	<li>消毒显微操作针（参见 材料表用移液器将约100根针放入盛有70%乙醇的1.5 mL微量离心管中，浸泡至少5分钟。&#160;</li>
	<li>消毒 CO2 用70%乙醇喷洒垫板和画笔进行消毒，并用干净的无绒纸巾擦干。待工具清洁干燥后，将40只或更少的已分选F1代雄性个体转移回清洁的垫板上。</li>
	<li>在果蝇操作板上将F1代雄性分为两组。其中一组作为对照组，为未受伤的果蝇；第二组为实验组，将接受PTBI处理。</li>
	<li>使用镊子从微量离心管中取出4-5枚新的Minutien针，并将其放置于CO的边缘附近2 垫板。在解剖镜下，选择一根尖端锋利且笔直的Minutien针。 
	注意：每次实验使用单个 minutien 针可减少实验变异。重复使用锋利的针。将损坏或变钝的针放入单独的含有 70% 乙醇的 1.5 mL 微离心管中，以确保安全处理。</li>
	<li>若使用标准杂交的果蝇，打开配备有适合绿色荧光蛋白（GFP）激发和发射滤光片的体视显微镜发光二极管（LED）灯。该设置可在440-460 nM波长下激发，并允许观察500-560 nM的发射荧光。 
	注意：使用此光源和滤光片组合，蘑菇体的细胞体将透过头部角质层发出绿色荧光（图1C）。对于永久双生果蝇或其他基因型果蝇，可使用体视显微镜的标准白光照明器来观察头部几丁质表皮的解剖标志，以准确定位蘑菇体进行损伤操作。图1C).</li>
	<li>用镊子夹住并固定选定的Minutien针（对于惯用右手者，通常使用右手），另一只手（通常为左手）持画笔。从实验组中选取一只果蝇，将其摆放至头部朝右，以便获得头部囊的背侧视野。将画笔置于胸部背侧前端，轻轻下压以固定果蝇。</li>
	<li>将微型钉针尖对准头部右侧蘑菇体的细胞体，刺入头壳。若使用解剖标志，应瞄准位于单眼与复眼背缘之间的背部头壳角质层（图1).</li>
	<li>完成损伤操作后，使用画笔轻轻将头部从 minutien 针上推下。</li>
	<li>如果使用脑组织进行RNA测序或qRT-PCR，需在头部左侧再制造一次损伤。</li>
	<li>重复步骤 2.8–2.10，以损伤实验组中的所有果蝇。</li>
	<li>所有果蝇处理完毕后，将对照组和受伤的果蝇分别放入已标记、含有食物的不同小瓶中。在果蝇从麻醉中恢复以及后续老化期间，将小瓶水平放置（即侧放），以防止果蝇陷入食物中。</li>
	<li>将标准的野生型果蝇置于25 °C条件下，将perma-twin果蝇置于30 °C条件下进行培养和老化。</li>
	<li>对于日龄超过24小时的果蝇，每隔1-2天将其转移至洁净的食物培养基上。</li>
</ol>
3. EdU 标记
<ol>
	<li>用二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）储备液。该储备液可在-20 °C下保存长达12个月。</li>
	<li>用10%蔗糖溶液配制200 µL的50 µM EdU工作液。在进行PTBI前，预先用EdU喂食果蝇6小时。</li>
	<li>将200 µL含50 µM EdU的10%蔗糖溶液滴加至23 mm圆形3级滤纸（见材料表）上，然后将滤纸放入一个空的培养瓶中。</li>
	<li>将果蝇放入该培养瓶中，并用棉塞密封瓶口。</li>
	<li>将培养瓶水平放置于25 °C的湿润培养箱中孵育6小时。</li>
	<li>按照步骤2.3–2.10所述进行PTBI操作。</li>
	<li>将果蝇重新放回含有EdU的培养瓶中，并用棉塞密封瓶口。</li>
	<li>将培养瓶水平放置于25 °C的湿润培养箱中孵育最多24小时。随后根据以下任一步骤进行操作（步骤3.8.1–3.8.3）。
	<ol>
		<li>按照步骤4所述方法解剖并固定脑组织，使用不含叠氮化钠的固定液、洗涤缓冲液和封闭缓冲液，并在抗体染色前完成EdU检测反应。</li>
		<li>将果蝇转移至一个新的洁净培养瓶中，瓶内放置新的滤纸并加入200 µL含50 µM EdU的10%蔗糖溶液。将培养瓶水平放置于25 °C培养箱中。在标记期间每24小时重复一次该步骤。随后按照步骤4所述方法解剖并固定脑组织，使用不含叠氮化钠的缓冲液，并在抗体染色前完成EdU检测反应。</li>
		<li>如需进行EdU脉冲-追踪标记，先在脉冲期内用EdU喂食果蝇，之后每24小时将果蝇转移至一个含有新滤纸和200 µL含50 µM EdU的10%蔗糖溶液的新培养瓶中。脉冲期结束后（例如4天），将果蝇转移至含有标准黑腹果蝇培养基的培养瓶中。将培养瓶侧放于25 °C培养箱中继续孵育3天。随后按照步骤4所述方法解剖并固定脑组织，使用不含叠氮化钠的缓冲液，并在抗体染色前完成EdU检测反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 解剖、免疫组织化学及封片
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中加入100 µL固定液：含4%甲醛的PEM缓冲液（100 mM 哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) [PIPES]，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，pH 7.0）（见材料表），并将离心管置于冰上。 
	注意：同一基因型和条件的最多20个果蝇脑组织可在同一管中处理。</li>
	<li>准备一个解剖板，在其上设置一个小池（约100 µL）70%乙醇以及三个小池磷酸盐缓冲液（PBS；100 mM K2HPO4，140 mM NaCl，pH 7.0）。</li>
	<li>将约10只对照组或实验组果蝇置于已用70%乙醇消毒的CO2麻醉垫上进行麻醉。</li>
	<li>使用解剖刀将每只果蝇的头部与躯干分离。</li>
	<li>用蘸有70%乙醇的画笔收集头部，并将头部置于解剖板上的乙醇池中2–5分钟。 
	注意：此步骤可使脑组织轻微脱水，从而更易于从头壳中解剖分离。</li>
	<li>将头部转移至约100 µL PBS小池中，使用两对钟表镊解剖取出脑组织，每取出一个脑组织即转移至一个新的干净PBS小池（约100 µL）中。操作时用一对镊子夹住头壳后部并打开，另一对镊子闭合尖端轻轻撬动，将脑组织从头壳中分离。</li>
	<li>使用配备经切割并斜面处理塑料吸头的P200移液器，将解剖好的脑组织转移至含有100 µL固定液的离心管中。</li>
	<li>室温固定20–25分钟，随后小心使用P200或玻璃移液器移除固定液。</li>
	<li>用1 mL PT缓冲液（PBS加0.1% Triton X-100）清洗固定后的脑组织四次，每次清洗之间静置数分钟使脑组织沉降。 
	注意：若脑组织在清洗间未能快速沉降，可能仍附着有脂肪体和/或气管组织。</li>
	<li>在1 mL PBT缓冲液（PBS加0.1% Triton X-100和2%牛血清白蛋白）中室温封闭样本约1小时。</li>
	<li>移除封闭液，加入100 µL一抗溶液，在4 °C下于PBT中孵育过夜。本研究使用的一抗为兔抗PH3抗体（1:500）和小鼠抗Fasciclin II抗体（1:20）（见材料表）。</li>
	<li>用1 mL PT缓冲液清洗样本五次，每次清洗之间静置数分钟使脑组织沉降。</li>
	<li>移除最后一次清洗液，加入100 µL二抗溶液，在4 °C下孵育过夜。所用二抗为抗兔IgG-568（1:400）和抗小鼠Cy5（1:100）（见材料表）。</li>
	<li>用1 mL PT缓冲液清洗样本五次，每次清洗之间静置数分钟使脑组织沉降。在最后一次清洗时，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐，1:100稀释自10 µM母液）染核10分钟。移除清洗液，每管中保留50–100 µL液体。</li>
	<li>准备显微镜载玻片：在每张载玻片中央贴一个自粘式加固环，并在环中央滴加50 µL抗荧光淬灭封片介质（见材料表）。加固环可使盖玻片略微高于载玻片，防止封片时脑组织过度压平。</li>
	<li>使用配备切割斜面塑料吸头的P200移液器，将各离心管中的脑组织小心转移至已准备好的载玻片上，尽量减少携带的清洗缓冲液。每张载玻片最多可封片10个脑组织。</li>
	<li>在放置盖玻片前，使用镊子轻轻调整脑组织位置。盖玻片封片后用指甲油密封。脑组织应朝向一致，可为腹面朝上或背面朝上，但彼此不得接触。 
	注意：由于难以通过共聚焦显微镜获得完整脑组织的高质量图像，建议部分样本以不同方向封片。</li>
	<li>将制备好的载玻片平放于避光环境中，4 °C保存直至成像。如需长期保存（最长1年），可置于-20 °C保存。</li>
</ol>
5. 共聚焦成像
注意：使用激光扫描共聚焦显微镜对脑组织进行成像，应选择适用于 DAPI 和荧光二抗的激发激光和发射滤光片组合（例如，分别为 405 nm、488 nm 和 568 nm、633 nm）。
<ol>
	<li>打开显微镜、激光器、控制器和计算机的电源。</li>
	<li>启动采集软件。</li>
	<li>在采集模式下，选择最多四个通道，并设置所需通道的逐层扫描参数。将每个通道的激光功率增加至 5–10%。</li>
	<li>将玻片放置在显微镜上。</li>
	<li>使用落射荧光附件（见材料表）选择待成像的脑组织。</li>
	<li>在采集模式下，选择 1024 × 1024 像素作为帧尺寸。</li>
	<li>在采集模式下，选择Z-堆栈选项，设定以 2 µm 为间隔进行 Z-堆栈扫描，并通过样品调焦，选定待成像的顶部和底部焦平面。</li>
	<li>使用 20 倍物镜对整个脑组织进行 Z-堆栈成像，使用 60 倍物镜对特定脑区（如蘑菇体）进行成像。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>通过手动和/或使用图像分析软件（参见材料表）定量增殖细胞及永久双生克隆的数量。使用软件时，选择面积至少为 10 µm 的感兴趣区域（ROIs）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

尽管此前已有对成年果蝇大脑穿透性损伤的描述15,17,18，但这些研究主要集中在视叶，而非中央脑。此外，目前尚缺乏关于如何实施此类损伤的详细操作说明。本实验方案描述了一种针对成年Drosophila中央脑的穿透性损伤模型，该模型可重现创伤性穿透性脑损伤（PTBI）后成年神经发生的统计学显著证据。
该PTBI方案的可重复性部分归因于将蘑菇体作为损伤靶向区域。蘑菇体体积较大，由约2200个神经元组成，其树突和轴突分支形成复杂且高度刻板的结构阵列18。蘑菇体神经元的胞体位于脑表面附近，可通过头部角质层观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达（图1C）。蘑菇体前体细胞是在发育过程中最后经历凋亡的神经干细胞13,12,19。因此，在羽化时许多蘑菇体神经元仍处于较年轻的状态。这引出一个假说：蘑菇体可能比其他脑区具有更强的有丝分裂潜能16。此外，蘑菇体在学习与记忆功能中起关键作用18。这使得研究者能够探究PTBI诱导的神经发生是否可导致功能恢复。
影响结果可重复性的其他因素包括：使用基因型一致的杂交果蝇、每次均以相同方向进行杂交、精确控制培养和衰老温度，以及分别分析雄性和雌性个体。使用杂交产生的F1代果蝇可降低分析到自发突变纯合子脑组织的概率。将y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4成年&#160;雌蝇与y[1] w[1]成年雄蝇&#160;进行标准杂交，可获得基因型为y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+的F1代子代。OK107-GAL4在蘑菇体的所有内在神经元中表达，并驱动膜结合报告基因UAS-mCD8-GFP的表达，从而实现对蘑菇体及其投射纤维的可视化观察。对于永久孪生（perma-twin）杂交实验，杂交过程必须始终在17 °C下进行，以确保谱系示踪系统处于关闭状态。这可以保证发育过程中没有分裂的细胞被标记，仅成年后新生的神经元和胶质细胞被标记。为此，果蝇培养室也可一直维持在17 °C。尽管永久孪生系统最初的文献描述15建议在18 °C下培养果蝇，但这可能导致明显的背景标记。
为了保持一致性，建议在进行穿透性创伤（PTBI）操作的同时，将对照组未受伤的果蝇也置于CO2麻醉垫上。这可确保两组果蝇接受相同的麻醉暴露条件。此外，为保证实验的可重复性，应完全穿透果蝇头部。然而，操作时需注意避免针尖在垫子上弯曲，以免影响后续损伤操作的使用。对于熟练的操作者而言，PTBI果蝇的非预期损伤较小。尽管如此，在损伤过程中若用力按压胸部以固定果蝇，可能导致其死亡。评估非预期损伤程度的一种方法是量化PTBI后24小时果蝇的死亡率。对于单侧损伤的果蝇，初学者的死亡率可能达到50%或更高。因此，为确保观察到的结果是由PTBI引起而非非预期损伤所致，建议初学者每天练习对约20只果蝇进行PTBI操作，持续数周，直至24小时死亡率稳定在&#60;10% 时，再对获得的脑组织进行分析。
为了定量评估中枢脑部创伤性脑损伤（PTBI）所诱导的细胞增殖程度，可采用抗磷酸化组蛋白H3（PH3）免疫染色以及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入法。抗PH3抗体可标记处于有丝分裂前期至中期的细胞，因此仅能检测到活跃分裂细胞中的一小部分，故PH3染色仅能提供对细胞增殖的部分观察。EdU是一种胸苷类似物，可掺入新合成的DNA中。通过在损伤前后向果蝇喂食EdU，可以更全面地了解在损伤后正在分裂或已经完成分裂的细胞情况。由于所有发生分裂的细胞都会被永久标记，这一特性有助于识别缓慢循环的细胞，并可用于检测细胞在初始增殖后的存活情况。出于尚不明确的原因，可能与血脑屏障通透性有限有关，EdU标记效率较低，会低估成年果蝇大脑中的细胞增殖水平。这一点可通过以下现象得到证实：在PTBI后24小时，对照组与实验组大脑中PH3阳性（PH3+）和EdU阳性（EdU+）细胞数量相近；此外，在永久性双标记克隆（perma-twin clones）中仅有一部分新生细胞掺入了EdU16。为实现最大程度的标记，必须在损伤前预先对果蝇进行EdU喂养，因为受伤后的果蝇在PTBI后数小时内不会恢复进食。进食情况的评估方法是将食用色素加入EdU溶液中，并通过腹部体壁观察肠道内染料的摄入量16。
需要注意的是，尽管我们在第4步中提供了脑解剖方案，但也可采用其他技术。其中一些方法已在先前发表的方案中提供20,21,22。Drosophila melanogaster 是一种低成本的模式生物，具有强大的遗传学和分子生物学工具，可用于研究多种组织（包括肠道和神经系统组成部分）再生背后的机制。本文概述了一种新颖且可重复的损伤模型，可用于研究脑损伤后的反应。利用这些方案获得的数据支持以下观点：成年 Drosophila 中枢脑仍保留增殖能力，可在损伤后生成新的神经元。这些发现值得进一步探究成年神经发生现象的范围及其潜在的分子机制。一旦在此系统中鉴定出参与神经再生的关键组分，我们便可将关于成年 Drosophila 神经发生的知识转化为对人类的相关研究。

脑和神经系统损伤是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。每年约有150万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）1，而仅在美国，估计就有600万人患有帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病2。脑部疾病或损伤均可引发神经退行性病变，导致感觉、认知和运动功能障碍3。由于脑的生理结构复杂，开发用于人类脑修复的治疗策略一直面临巨大挑战。果蝇（Drosophila melanogaster）等模式生物为揭示神经退行性病变的基本机制及潜在治疗靶点提供了一个简便的研究系统4。
果蝇 黑腹果蝇 一个多世纪以来，它一直是一种强大的模式生物，推动了遗传学、发育生物学和神经科学领域的发展5,6。该 黑腹果蝇 脑仅包含约90,000个神经元7，比人类大脑平均数量少一百万倍8，但它们具有许多相似之处。人类和果蝇的大脑均利用神经递质GABA、谷氨酸、乙酰胆碱以及生物胺类多巴胺和5-羟色胺9. 黑腹果蝇 人类神经元的功能也类似，具有共有的突触结构和相似的神经细胞类型10较小的脑容量 果蝇 以及先进遗传学技术的可及性，结合分子、细胞和生理机制在不同物种间的保守性 果蝇 以及哺乳动物，允许 果蝇 使研究人员能够提出在哺乳动物模型中难以或无法回答的问题。
我们目前对成年神经发生的研究认知 黑腹果蝇，无论是在稳态条件下还是损伤后，仍知之甚少。相比之下，正常发育过程中的神经发生研究较为深入。例如，在发育过程中，神经元和胶质细胞由前体细胞——称为成神经细胞（neuroblasts）——产生10,11在中央脑中已区分出至少三种不同类型的神经母细胞。I型和II型谱系的神经母细胞均在蛹室形成后约20-30小时退出细胞周期12相比之下，蘑菇体神经母细胞是最后停止细胞分裂的，其分裂终止时间也最晚 通过 蛹壳形成后约85-90小时的Reaper依赖性细胞凋亡13羽化后，成虫 果蝇 大脑中分裂细胞极少（约每脑1个细胞），主要为胶质细胞14成年视叶具有缓慢循环的神经母细胞，能够进行神经发生15，而成年中枢脑中则无已知的神经母细胞。神经前体细胞的稀缺以及细胞增殖能力的有限性，与成年哺乳动物大脑的情况高度相似，凸显了成年神经发生机制在其中潜在的相关性 果蝇 对人类。
在损伤后发现成年 Drosophila 视叶中存在低水平的成年神经发生15，这提出了一个假设：成年 Drosophila 中枢脑也可能具备成年神经发生的能力16。本方案描述了建立一种严格且可重复的成年 Drosophila 中枢脑损伤模型的方法，可用于研究成年中枢脑中的神经发生。鉴于人类与 Drosophila 在脑结构和功能上的相似性，这些发现可能有助于识别受损或患病人类大脑中治疗性神经发生的关键靶点。

<table><tbody><tr><td>#11 一次性手术刀</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395923</td><td>用于在脑解剖前分离果蝇头部与躯干</td></tr><tr><td>150 mm 直径黑色 Sylgard 培养皿</td><td>Dow</td><td>1696157</td><td>使用 Dow 公司试剂在实验室中制备；用于脑解剖</td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>任意</td><td></td><td>用于将脑组织固定在显微镜载玻片上</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>由不同来源的 95% 乙醇配制而成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>抗兔 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A11036</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>任意</td><td></td><td>用于密封盖玻片</td></tr><tr><td>Click-It EdU 标记试剂盒</td><td>InVitrogen</td><td>C10640</td><td>用于检测新合成的 DNA</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气泡发生器</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-181</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 麻醉垫</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 调节器及供气装置</td><td>任意</td><td></td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>任意</td><td></td><td>用于成像固定、染色并封片的脑组织</td></tr><tr><td>棉塞</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>用于 EdU 标记</td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>用于 EdU 标记</td></tr><tr><td>固定缓冲液（Pipes、EGTA、镁；PEM）</td><td>组分来自不同公司</td><td></td><td>用于固定成年果蝇脑组织；含 100 mM 哌嗪-N,N&amp;rsquo;-双(2-乙磺酸) [PIPES]、1 mM EGTA、1 mM MgSO4，pH 7.0</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>用于固定成年果蝇脑组织，加入 PEM 缓冲液中使用</td></tr><tr><td>Grade 3 圆形 Whatman 滤纸，23 mm 直径</td><td>Tisch Scientific</td><td>1003-323</td><td>用于 EdU 标记</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>任意</td><td></td><td>用于固定和染色反应，以及储存显微操作针（Minutien pins）</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>任意</td><td></td><td>用于脑组织封片</td></tr><tr><td>显微操作针（Minutien pins）</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>用于脑损伤实验；针尖直径 12.5 &amp;mu;m，针杆直径 100 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>小鼠抗 Fasciclin II 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>1D4-s</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>NIGHTSEA 体视显微镜荧光适配器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-GR</td><td>解剖显微镜的荧光装置</td></tr><tr><td>P20、P200 和 P1000 移液器及吸头</td><td>任意</td><td></td><td>用于量取溶液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>组分来自不同公司</td><td></td><td>用于脑组织解剖，以及配制免疫组织化学封闭液和洗涤液；含 100 mM K2HPO4、140 mM NaCl，pH 7.0</td></tr><tr><td>含 0.1% Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水（PT）</td><td>组分来自不同公司</td><td></td><td>用于洗涤解剖后的脑组织</td></tr><tr><td>含 0.1% Triton X-100 和 2% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBT）</td><td>组分来自不同公司</td><td></td><td>免疫组织化学的封闭液，以及用于稀释抗体</td></tr><tr><td>兔抗 PH3 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td><td>sc-8656-R</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>加强型标签纸</td><td>Avery</td><td>5721</td><td>用于维持显微镜载玻片与盖玻片之间的间距</td></tr><tr><td>0 号画笔</td><td>任意</td><td></td><td>用于操作和稳定成年果蝇以进行损伤实验</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>两把 #5 钟表匠镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>用于夹持显微操作针及进行脑组织解剖</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>显微镜载玻片的封片介质</td></tr></tbody></table>

刺激与分析成年神经发生 果蝇 中枢脑

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

在疾病或损伤情况下，神经发生的分子与细胞机制尚未被充分阐明。然而，理解这些机制对于开发神经再生疗法至关重要。Drosophila melanogaster 是研究神经发育的领先模型，但历史上并未被广泛用于研究成年果蝇大脑的再生，这主要是因为成年大脑的有丝分裂活性极低。尽管如此，对成年 Drosophila 中枢脑实施穿透性创伤性脑损伤（PTBI）能够触发新神经元和新胶质细胞的生成。结合 Drosophila 中强大的遗传工具与本文所述简单而严谨的损伤操作流程，成年 Drosophila 大脑现已成为神经再生研究的有力模型。本文提供了以下详细操作步骤：（1）对成年中枢脑实施穿透性损伤；（2）损伤后的脑组织解剖、免疫组织化学染色及成像。这些方案可获得高度可重复的结果，有助于进一步开展研究以解析神经再生的潜在机制。

PTBI 促进细胞增殖 
为了确定中枢脑部 PTBI 后神经发生的程度，在羽化后 6 小时内收集并损伤的年轻成年雄性个体中测量了增殖反应。使用抗磷酸化组蛋白 3（PH3）抗体（标记正处于有丝分裂期的细胞）检测发现，损伤后 24 小时增殖显著增加。PTBI 后 24 小时，对照组中枢脑中约有 3 个 PH3+ 细胞，而损伤组中枢脑中约有 11 个 PH3+ 细胞（图 2A-D）。大多数分裂细胞位于损伤部位附近。为量化单次损伤引起的累积性细胞增殖，并评估新生成细胞的存活情况，采用了第二种细胞分裂检测方法。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是一种胸苷类似物，可掺入新合成的 DNA 中，对经历 DNA 合成的细胞进行永久标记。果蝇接受连续 4 天的 EdU 脉冲标记，随后进行 3 天的追踪。结果显示，被标记的细胞具有活力，并至少在增殖后存活了 3 天。到第 7 天时，对照组中枢脑平均有 2 个 EdU+ 细胞，而损伤组中枢脑平均有 11 个 EdU+ 细胞（图 2E），这与使用 PH3 抗体在损伤后 24 小时获得的结果相似。当在 14 天时检测细胞增殖情况时，未损伤对照组平均每只中枢脑有 1 个 EdU+ 细胞，而损伤组平均每只中枢脑有 29 个 EdU+ 细胞（图 2E），表明细胞增殖至少持续至 PTBI 后的第二周。
细胞增殖具有年龄依赖性 
在羽化后的最初24小时内，中枢脑中观察到最显著的增殖反应（图3）。在羽化后7天，穿透性损伤仍会引起显著的增殖增加，平均每只中枢脑中有6个PH3+细胞。然而，在羽化后14天，细胞在创伤性脑损伤（PTBI）后分裂的能力显著下降至约1个分裂细胞，与对照组大脑的水平相似（图3）。因此，创伤性脑损伤后细胞增殖的潜力具有年龄依赖性。
新生成的神经元可以投射到正确的靶区域 
为了评估创伤性脑损伤（PTBI）后的神经再生情况，采用了永久性双标记系统15。该永久性双谱系追踪技术可利用绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）对分裂细胞及其后代进行永久标记15。在损伤后2天和2周时，损伤样本中检测到的永久性双标记克隆数量多于对照组（图4A-E）。值得注意的是，在损伤后2周，约50%的PTBI果蝇大脑中出现了新的蘑菇体神经元（图4N）。这些新生神经元将其树突正确投射至蘑菇体萼部，轴突正确投射至蘑菇体叶（图4D、F、G）。这表明新生成的细胞可能是具有功能的神经元，参与了受损蘑菇体的修复过程。大脑中其他表现出再生迹象的区域包括椭球体（EB）（图4H、I）、触角叶（AL）（图4J、K）和侧角（LH）（图4L、M），这些区域分别在约26%、26%和20%的情况下出现较大的克隆（图4N）。这些结果凸显了该系统在研究成年个体神经发生方面的应用价值。PTBI后事件发生顺序及新生神经元生成过程的假说模型见于图5。
<img alt="昆虫脑解剖结构；外部/内部视图示意图及背侧显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63182/63182fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：成人穿透性创伤性脑损伤（PTBI） 果蝇 中枢脑 (A成年果蝇头部外部结构示意图。此为正面观，因此动物的右侧位于观察者的左侧。B成人内部结构示意图 果蝇 头部，灰色线条指示损伤轨迹。此为后视图，因此在本图及后续图示中，脑的右侧位于右侧。中央脑部PTBI影响多个脑结构，包括蘑菇体（绿色），以及脑外组织，如脂肪体（蓝色）和血细胞（红色）。CB = 中央脑区。OL = 视叶区。C）活体成年果蝇头部的背侧视图，其中蘑菇体（箭头）被绿色荧光蛋白（GFP）标记。此为“标准基因型”（详见正文）。PTBI 造模方法可稳定地导致蘑菇体损伤。该 图示有 已根据参考文献改编16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63182/63182fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="脑损伤反应：TBI 后 PH3 染色分析（C-D）、示意图（A-B）及细胞计数图（E）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63182/63182fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2PTBI 促进细胞增殖。 未受伤对照组（A）和创伤性脑损伤（PTBI）B）示意图。右上角的蓝色方框表示在图中以更高放大倍数显示的脑区C）和（D). (C，D) 使用PH3抗体（红色）检测损伤后24小时的细胞增殖情况。在对照组大脑中（C)，PH3+ 细胞很少，且在 MB 附近没有。然而，在 PTBI 脑组织中（D)，在脑部附近存在 PH3+ 细胞。E) 增殖细胞的定量。数据反映的是整个大脑中的增殖细胞数量，而不仅限于蘑菇体附近区域。在24小时时间点，未受伤对照组大脑平均含有3个PH3+细胞/脑（n = 11个脑，共28个细胞），而创伤后24小时（PTBI）的大脑平均含有11个PH3+细胞/脑（n = 17个脑，共181个细胞）。在7天时间点，未受伤对照组仅有少量EdU+细胞，平均为2个EdU+细胞/脑（n = 15个脑，共24个细胞），而创伤后7天的PTBI大脑平均为11个EdU+细胞/脑（n = 22个脑，共238个细胞）。在14天时间点，未受伤对照组平均为1个EdU+细胞/脑（n = 8个脑，共11个细胞），而创伤后14天的PTBI大脑平均为29个EdU+细胞/脑（n = 14个脑，共400个细胞）。本组实验使用羽化后6小时内年轻的成年雄性个体。对三个时间点的对照组与PTBI样本进行非配对t检验，所得p值分别为&lt;0.0001，p&lt;0.0001，和 p&lt;0.0002。误差线表示标准差（SD）。该 图示有 已根据参考文献改编16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63182/63182fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="衰老损伤影响图；pH3+细胞数与损伤年龄的关系；损伤时间点的统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63182/63182fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：对PTBI的增殖反应随年龄增长而减弱。为了探究年龄是否影响损伤后细胞增殖的程度，将新羽化的成年雄蝇与在PTBI前分别饲养至7天、14天和28天的果蝇进行比较，使用抗PH3抗体在损伤后24小时检测细胞增殖情况。在羽化后6小时内遭受损伤的果蝇，其大脑中平均有11个PH3+细胞/脑（n = 17个脑，共182个细胞），而年龄匹配的对照组平均为3个PH3+细胞/脑（n = 11个脑，共28个细胞）。饲养至7天后再接受PTBI处理的果蝇，其大脑中平均有6个PH3+细胞/脑（n = 11个脑，共65个细胞），而年龄匹配的对照组平均为2个PH3+细胞/脑（n = 5个脑，共12个细胞）。当果蝇在PTBI前饲养至14天，并于24小时后检测时，其大脑中平均仅有1个PH3+细胞/脑（n = 8个脑，共11个细胞），与年龄匹配的对照组（同样平均为1个PH3+细胞/脑，n = 4个脑，共2个细胞）相近。28天龄的未损伤对照组（n = 4，1个细胞）和PTBI组（n = 3，1个细胞）果蝇均平均为0个PH3+细胞/脑。在上述四个时间点，PTBI组与对照组之间的非配对t检验结果分别为p&lt;0.0001、p&lt;0.04、p&lt;0.07和p&lt;0.84。本图改编自参考文献16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63182/63182fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑损伤研究：克隆分布分析；共聚焦图像、图表；聚焦于蘑菇体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63182/63182fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：Perma-twin 谱系追踪显示在穿透性创伤性脑损伤（PTBI）后发生脑再生，且轴突实现了准确投射。 采用 perma-twin 谱系追踪系统15分析 PTBI 后的神经发生。该系统可永久性地标记分裂细胞及其子代，使其表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）。果蝇在发育期间于 17 °C 下培养，以保持该系统处于关闭状态。收集携带 perma-twin 转基因的 F1 代雄性果蝇羽化后立即进行损伤处理，并转移至 30 °C 恢复 2 天或 14 天。(A) 在 2 天未受伤的对照组中，大脑各处可见少量散在的 GFP+ 细胞。( B) 在 14 天时，对照组中央脑中仅存在相对较少的 GFP+ 细胞。( C) 相比之下，2 天损伤组的大脑中 GFP+ 细胞数量更多，且倾向于聚集在损伤部位附近（箭头所示）。( D) 在损伤后 14 天，损伤部位附近出现大量克隆。其中一些克隆的轴突沿蘑菇体神经束投射（箭头所示）。此处仅显示 GFP 通道；在 PTBI 样本中也观察到类似的 RFP+ 克隆。( E) PTBI 后随着时间推移，克隆数量逐渐增加。未受伤的对照组大脑（n = 13）在 2 天时平均有 10 个克隆，而 2 天 PTBI 大脑（n = 20）平均有 23 个克隆（p&lt;0.00002）。在 7 天时，对照组大脑平均每脑有 9 个克隆（n = 18），而 7 天 PTBI 大脑平均每脑有 39 个克隆（n = 16）（p 值&lt;0.00000002），显著高于损伤后 2 天的克隆数量（p 值&lt;0.0009）。在 14 天对照组大脑中，平均每脑有 10 个克隆，与 2 天和 7 天对照组相比无显著差异。然而，在 PTBI 后 14 天，平均每脑有 66 个 GFP+ 克隆，显著高于同龄对照组（p&lt;0.0000003）以及损伤后 2 天的大脑（p 值&lt;0.0001）。误差线表示标准差。（F-M） PTBI 促进了大脑多个区域的克隆形成。左侧图示为 PTBI 后 14 天发现大克隆的大脑区域示意图（A、H、J、L）。右侧图显示代表性大脑的高倍放大图像（G、I、K、M）。许多 PTBI 后 14 天的大脑中，克隆向特定靶区投射，包括蘑菇体（MB）（F、G）、椭球体（EB）（H、I）、触角叶（AL）（J、K）和外侧角（LH）（L、M）。( N) PTBI 后随着时间推移，克隆数量和克隆大小均增加。在对照组和损伤组大脑中，分别计算了 2、7 和 14 天时具有大克隆的大脑区域比例。在 2 天时，约 8% 的对照组大脑（n = 13）出现 AL 克隆，而 2 天损伤组大脑（n = 20）中未见 AL 克隆。在 7 天对照组大脑（n = 18）中，6% 存在 AL 克隆，6% 存在 EB 克隆。在 PTBI 后 7 天（n = 16），6% 的大脑存在 AL 克隆，6% 存在 EB 克隆，19% 存在较大的 MB 克隆。在 14 天时，对照组大脑（n = 9）未表现出任何特定区域的克隆，而 47% 的 PTBI 大脑（n = 15）存在 MB 克隆，20% 存在 AL 克隆，27% 存在 EB 克隆，27% 存在 LH 克隆。本图改编自参考文献16。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63182/63182fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经发生时间线示意图；从损伤到再生，包括细胞类型和增殖阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63182/63182fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：穿透性创伤性脑损伤（PTBI）后再生的总结模型。 在年轻成年 Drosophila 的中枢脑中存在处于静息状态的类神经母细胞，这些细胞不表达典型的神经母细胞基因。在 PTBI 后 24 小时，这些静息的类神经母细胞被激活，开始表达神经母细胞基因并启动增殖。在 PTBI 后 4 小时和 24 小时，均出现一波细胞死亡16。到第 7 天，细胞增殖率仍然较高，许多新生细胞已获得成熟细胞的身份，分化为神经元或胶质细胞。在 PTBI 后 14 天，形成了大量包含轴突和树突的新神经元克隆，且其投射正确到达相应靶区。运动功能缺陷也在第 14 天得到恢复，表明成年 Drosophila 能够实现功能性和结构性的再生。本图改编自参考文献16。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63182/63182fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文提供了对成年果蝇（Drosophila）造成穿透性创伤性脑损伤（PTBI）并检测由此引发的神经发生的详细实验方案。

在疾病或损伤后神经发生的分子与细胞机制尚不明确。然而，理解这些……

本方案具有重要意义，因为它展示了一种中枢脑损伤方法，可在通常不存在成年神经发生的果蝇（Drosophila）中诱导成年神经发生。我们预期，利用该技术来理解成年神经发生的分子机制，将有助于人类神经再生的研究。掌握这一技术需要耐心和毅力。我们建议在开始采集用于分析的果蝇大脑之前，先持续数周每天练习解剖五到十个大脑。将果蝇在二氧化碳垫上麻醉后，于羽化后六小时内挑选新羽化的F1代年轻雄性果蝇，并将其放入含有食物的洁净小瓶中，每瓶不超过40只果蝇。若计划使用 EdU 标记分裂细胞，需配制 200 微升浓度为 50 毫摩尔或更高的 EdU 溶液，并将其加入含 10% 蔗糖的溶液中，然后将配好的溶液滴加到空小瓶内的 23 毫米圆形三级滤纸上，再将雄性果蝇放入小瓶中，在损伤前进行 6 小时的预饲喂。接下来，将约 100 枚昆虫针放入装有 70% 乙醇的 1.5 毫升微量离心管中浸泡 5 分钟，以实现消毒。随后，用 70% 乙醇喷洒二氧化碳垫和画笔，并用干净的无绒纸巾擦干，完成消毒。工具清洁并干燥后，将40只或更少的已分选F1代雄性果蝇转移至洁净的垫上，并将其分为两组。其中一组作为未受伤的对照组果蝇，另一组为实验组，将接受穿透性创伤性脑损伤处理。接下来，使用镊子从微量离心管中取出四到五枚新的Minutien针，并将其放置在二氧化碳垫边缘附近。然后在解剖显微镜下选择一枚针尖笔直且锋利的Minutien针。重复使用锋利的针，将损坏或变钝的针放入另一管含有70%乙醇的离心管中，以确保安全处理。接下来，对于具有标准杂交基因型的果蝇，打开体视显微镜的LED灯，该光源配备适用于绿色荧光蛋白的激发和发射滤光片，可在440至460纳米波长下激发，并在500至560纳米波长范围内进行观察。然后选择实验组中的一只果蝇，将其放置在视野中，使操作者能够从背侧观察果蝇的头壳结构，且果蝇头部朝向右侧。用镊子一只手夹起并握住选定的微型针，另一只手握住画笔。然后将毛刷置于果蝇背部胸部的前部，轻轻下压以固定果蝇。将微型细针的尖端对准头部右侧的蘑菇体细胞体位置，刺入头壳。若使用解剖标志进行定位，应瞄准单眼与复眼背缘之间的背部头壁角质层区域。完成损伤操作后，使用画笔轻轻将果蝇头部从微型钉上推下。如果后续实验需进行RNA测序或定量反转录PCR（QRT-PCR），请在头部左侧制造第二次损伤。待所有实验组果蝇均完成损伤处理后，将对照组和损伤组果蝇分别放入标记好的、含有培养基的试管中。将小瓶水平放置，以防止果蝇陷入食物中。将标准杂交果蝇置于 25 °C，Permatwin 果蝇置于 30 °C 进行老化。若老化时间超过 24 小时，每隔一至两天将果蝇转移至清洁的食物中。使用抗 pH3 抗体（标记正在进行有丝分裂的细胞）检测，在损伤后 24 小时观察到增殖显著增加。在每个对照组中央脑中约观察到三个 pH3 阳性细胞，而在每个损伤的中央脑中则观察到 11 个 pH3 阳性细胞。到第7天时，每个对照组中枢脑中平均存在两个EdU阳性细胞，而每个损伤的中枢脑中则有11个EdU阳性细胞，这与伤后24小时使用pH3抗体所获得的结果相似。到第14天时，对照组平均每个中枢脑中有1个EdU阳性细胞，而损伤组脑组织平均每个中枢脑中有29个EdU阳性细胞。研究表明，在发生穿透性创伤性脑损伤后，细胞增殖至少持续至第二周。当果蝇在羽化后24小时内遭受脑损伤时，中枢脑组织表现出最强的增殖反应。即使在羽化后七天造成穿透性损伤，仍会显著促进细胞增殖。然而，到第14天时，细胞的分裂能力显著下降，每只脑组织中仅剩一个正在分裂的细胞，这与对照组脑组织相似。使用permatwin标记系统，在损伤样本中，第2天和第2周检测到的permatwin克隆数量均多于对照组。随着损伤后时间的推移，克隆数量逐渐增加。损伤后两周，在50%的受损脑组织中出现了新的蘑菇体神经元。这些新生神经元将其树突大致投射至蘑菇体萼部，轴突则投射至蘑菇体叶。大脑中其他似乎能够再生的区域包括椭体小叶、触角叶和侧角。进行脑损伤操作时，务必使用锋利的Minutien针，因为使用钝的或弯曲的针会增加果蝇的死亡率。此外，用画笔处理果蝇时切勿用力过猛，否则也会增加死亡率。通过该实验步骤，可利用免疫组织化学方法定量分析细胞自身增殖情况，同时鉴定新生神经元和胶质细胞。

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神经科学

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