鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

重组肢体是研究体内环境下胚胎信号影响细胞分化及力量形成的有力模型。该实验方法具有多种变异可能性，其潜在应用不限于鸡肢体发育生物学，还可应用于其他生物体的干细胞或前体细胞。

首先，在孵化3.5天后从培养箱中取出鸡蛋，用70%乙醇擦拭，并静置使其自然风干。接着，通过透光检查鸡蛋并观察血管发育情况，确定胚胎的位置。丢弃无胚胎的鸡蛋。

用钝头镊子的末端轻敲蛋壳的钝端，打开一个窗口，然后用镊子移除约一平方厘米的蛋壳。随后将鸡蛋转移至塑料或纸板支架中。将鸡蛋逐一放置在体视显微镜下。

识别气膜，并用精细的外科镊子在无血管区域戳一个小孔将其去除。借助精细的外科镊子拉出该部分，并移除与胚胎接触的蛋壳碎片。用精细的外科镊子撕开羊膜囊。

用钝头镊子小心地将胚胎从蛋中取出，并转移至含有冰上预冷的1×PBS的无菌培养皿中。用冰上预冷的1×PBS清洗胚胎一次，并在体视显微镜下去除残留的膜结构。然后定位后肢芽。

用精细的外科镊子将每个后肢芽沿纵轴剪下，紧贴胚胎体侧进行切割。保持胚胎处于1x PBS中。然后用塑料移液管将肢芽转移至1.5毫升微量离心管中。

接下来，将 PBS 替换为 500 微升 0.5% 胰蛋白酶溶液。将肢芽置于恒温块中，在 37 摄氏度下孵育 7 分钟。然后将胰蛋白酶溶液替换为 500 微升含有 2 毫克/毫升 IV 型胶原酶的 HBSS 溶液，并在恒温块中继续孵育 8 分钟。

尽可能去除胶原酶，并加入一毫升含10%胎牛血清的冷高糖DMEM以灭活酶活性。轻轻吹打混合液约10次。使用70微米细胞筛过滤细胞悬液，以去除外胚层组织。

再次用移液器吹打悬浮液约5至10次，然后在室温下以200 × g离心5分钟。随后弃去上清液。用1毫升培养基洗涤过量的胶原酶，再次离心悬浮液，并小心弃去上清液。

接下来，加入1.5毫升培养基，注意不要扰动细胞，然后在37摄氏度的恒温金属块中孵育1至1.5小时，使细胞形成紧密的沉淀。获取后肢芽后，用塑料移液管将其转移至一个空的微量离心管中。去除多余的1×PBS，并替换为500微升含0.5%胰蛋白酶的无菌1×PBS。

将混合物置于恒温块中，37摄氏度孵育30分钟。将含有肢芽的胰蛋白酶溶液转移至无菌培养皿中。然后尽可能去除多余的胰蛋白酶，并用预冷的含10%胎牛血清的1×PBS充满培养皿，确保所有肢芽均被覆盖。

在体视显微镜下识别肢芽。接着，将外胚层识别为从肢芽中胚层细胞略微分离的透明膜状结构。用精细手术镊夹住肢芽最近端的部分，分离并去除外胚层。

取前一步骤中的中胚层细胞沉淀，弃去约 600 微升培养基。然后用移液器吸头小心地将沉淀从管壁脱离，避免压碎。将离心管倒置，将沉淀转移至含有空胚层的培养皿中。

用精细的外科镊子切取一小块组织团块，并尽可能靠近外胚层放置。用外科镊子打开外胚层，将团块尽可能紧密地置入外胚层腔内。打开前肢附近的羊膜囊，以暴露胚胎的右侧体壁。

根据前肢的位置，使用钨针进行伤口划痕，划痕长度为两到三个体节，轻微损伤中胚层直至出血。将重组的肢体逐一移植到鸡胚中，将其基部置于体节的伤口处。用两根钯丝将重组肢体正确固定。

将重组肢体的基部与伤口对齐。用胶带密封窗口，并将鸡蛋放回培养箱中。在成功植入的情况下，重组肢体表现为一个突起，牢固地附着在供体胚胎的中胚层壁上。

相反，当细胞活力不足或移植失败时，重组肢体则会从中胚层壁脱落或呈现粗糙的形态。阿利新蓝染色显示了重组鸡肢体中六天龄鸡的骨骼结构。在清除阿利新蓝染色之前，已在乙醇中获取图像，用于形态学和定量测量。

对经H&E染色或未染色的肢体进行切片以观察组织和细胞。该技术可在体内生成肢体类器官，并利用不同来源或物种的干细胞研究细胞分化或形态发生过程。