利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因觅药行为

本方案具有重要意义，因为它结合了光遗传学技术的最新进展和物质成瘾的临床前模型，能够逆转促进复吸的神经环路中的可塑性变化。该技术的主要优势在于，可在清醒动物中对特定神经环路的突触活动进行精准操控，并对后续由线索诱发的可卡因觅药行为产生持久的抑制作用。该方法可广泛应用于其他多种神经系统和环路，以特异性调控与行为相关的神经可塑性。

通过将26号不锈钢注射套管连接至装有1微升浓缩AAV溶液的Hamilton注射器，开始为手术做准备。将动物麻醉后，按文本稿件所述，剃除手术区域的毛发，并润滑眼睛以防止干燥。接下来，通过上背部皮肤，皮下注射按体重计算剂量的镇痛药卡洛芬；并通过下背部皮肤，皮下注射5毫升乳酸林格氏液。

然后进行静脉导管植入。导管植入后立即把大鼠固定于立体定位仪中，以进行腺相关病毒注射。通过颅骨上方皮肤皮下注射利多卡因，对局部区域进行麻醉，随后从颅骨前部至后部做一道0.5毫米的切口。

去除覆盖的组织以暴露颅骨表面。沿前后轴调整大鼠头部位置，并将立体定位坐标在前囟处归零，然后使用配备小型钻头的Dremel工具在颅骨上钻三个小孔，并用螺丝刀固定不锈钢螺钉。对于AAV注射，根据《大鼠脑图谱》（Rat Brain Atlas）提供的内侧膝状体核（medial geniculate nucleus，MGN）坐标，在双侧颅骨上钻孔。

相对于前囟的坐标为：前后轴负5.4毫米，内外侧轴正3毫米，背腹轴负6.6毫米。以每分钟约4毫米的速度缓慢降低注射套管，直至套管准确定位于内侧膝状体（MGN）。以每分钟0.1 µL的速度注入浓缩的AAV溶液。输注完成后，将注射套管留置原位5分钟，以使病毒从套管周围充分扩散，然后缓慢将套管从脑组织中撤出。

接下来，进行靶向内侧膝状体至外侧杏仁核投射末梢的光纤植入。使用Dremel工具在外侧杏仁核上方钻双侧孔，钻孔坐标参见论文中的说明。用镊子夹住光纤植入物的陶瓷套管，并将其固定在立体定位仪适配器上。

以每分钟两毫米的速度缓慢降低光纤，直至光纤尖端位于LA背侧部分。先用一层薄薄的Loctite瞬干胶将光纤套管固定在皮肤上，再用牙科水泥加固。待牙科水泥充分干燥后，为套管安装套管护套和防尘盖。手术后，将大鼠单独饲养，并每天用含有5毫克/毫升庆大霉素和30 USP单位/毫升肝素的生理盐水冲洗导管。

行为实验开始前24小时，将大鼠的食物限制至其自由进食体重的90%。将大鼠放入操作式条件反射箱中，每天进行一小时的训练，以固定比率一强化程序进行可卡因（2毫克/毫升）的自我给药训练。在箱内，允许大鼠按压杠杆。

按压指定的活动杠杆将导致一次剂量为每公斤一毫克的可卡因输注，同时呈现持续十秒的复合灯光和声音提示。按压指定的非活动杠杆不会产生任何程序设定的效果。持续进行自我给药实验至少10天，直至大鼠连续三天每天成功获得至少八次输注。

若在第20天仍未达到习得标准，则该大鼠将被排除出研究。成功达到习得标准后，让大鼠在操作箱内自由按压杠杆，每天进行一小时的工具性消退训练，持续6至10天。持续每日的工具性消退训练，直至连续两天内平均按压杠杆次数不超过25次为止。

为了进行光遗传学诱导的长时程抑制（LTD），将光纤连接线通过悬挂在标准啮齿类动物饲养笼上方的旋转接头，连接至473纳米的蓝色激光二极管。根据操作说明打开激光器，并将激光器连接至脉冲发生器。调节参数设置，使大鼠接受900次光脉冲刺激，每次脉冲持续2微秒，频率为1赫兹。

使用光传感器通过光纤跳线测量光输出，并调节激光强度，使通过跳线的光输出约为五至七毫瓦。将大鼠放入清洁的饲养笼中，取下防尘盖和套管护套，露出套管。然后将光纤跳线双侧连接至每个套管。

如果设置得当，啮齿类动物在光遗传学刺激期间能够自由地在笼内活动。让大鼠在环境中探索三分钟后，打开脉冲发生器以启动光遗传学刺激。在诱导长时程抑制后，让大鼠在笼内再停留三分钟，然后将其放回饲养笼中。

体内光遗传学刺激24小时后，将大鼠重新放入操作性条件反射箱中，进行一小时的标准线索诱导复吸实验，以评估可卡因觅药行为。按压活动杠杆会触发灯光和声音线索，持续10秒。第一次测试至少一周后，进行第二次复吸测试，以确定光遗传学诱导的长时程抑制（LTD）是否导致可卡因觅药行为的长期抑制。

在代表性分析中，展示了可卡因自我给药的获得与消退过程。在获得阶段，可卡因输注次数和主动杠杆反应次数逐渐增加，而非主动杠杆反应次数较少。在可卡因自我给药期间，主动反应次数在每个获得日均逐步上升，并在第二周趋于稳定。

在消退的第一天，观察到压杆行为最初有所增加，随后在两个压杆上的反应均逐渐减少。在工具性消退后，重新引入线索导致可卡因寻求行为复现，表现为活动压杆反应次数增加。与对照组相比，光学诱导的长时程抑制（LTD）显著减少了活动压杆的按压次数。

七天后，再次对大鼠进行测试。此前接受过MGN-LA长时程抑制（LTD）的大鼠，其主动按压杠杆行为显著低于对照组，表明光遗传学LTD可导致可卡因觅药行为的长期减少。离体电生理记录显示，在光遗传学LTD之后，LA神经元中光诱发的兴奋性突触后电流幅度降低。

此外，在接受假刺激动物的神经元中，离体光刺激降低了兴奋性突触后电位的上升斜率，但在接受体内光诱导长时程抑制（optical LTD）动物的神经元中则未出现该现象。通过组织学方法验证了光导纤维植入位置及病毒在侧杏仁核和内侧膝状体（MGN）的表达。为了有效减少可卡因觅药行为，关键在于通过光导纤维植入实现适当的光输出，并采用持续的低频刺激以促进长时程抑制（long-term depression）。

采用此方案后，可利用神经记录技术来检测神经活动的变化，并可开展针对可卡因觅药行为或其他习得性行为的其他行为学测试。