用于鉴定黑色素瘤转移新介质的强大发现平台

该协议描述了连续工作流程中的一系列技术，可用于评估黑色素瘤转移的候选调节因子的体内效应，也可用于评估其他实体恶性肿瘤转移的体内效应。我们系统化工作流程的主要优点是，由于稳健和标准化的体内模型和技术，提高了数据的可重复性。该管道通过测试从组学数据或体内环境中的体外测定推断的候选药物，为靶标发现和治疗开发提供了途径。

通过使用提供的材料并在练习步骤时遵循详细说明，缩短了与该协议中介绍的技术相关的学习曲线。帮助演示该程序的将是The Preclinical Imaging Core的研究科学家Orlando Aristizabal和我实验室的讲师Ran Moubarak。对于皮内注射，在生物安全柜内麻醉和剃须8至10周大的小鼠，同时保持无菌条件。

然后抓住并向后缩回皮肤，使其与针刺的轨迹相对，并使用6毫米长，31号胰岛素注射器针头，以锐角轻轻刺穿皮肤，斜面朝上。缓慢注入30微升肿瘤细胞悬浮液，直到观察到圆顶形轮。监测肿瘤生长，体重减轻和整体健康状况的进展。

在这些监测过程中，用卡尺进行测量，并使用肿瘤的长度和宽度尺寸来计算体积。对于心内注射，将麻醉小鼠转移到超声机的加热平台上。然后使用低过敏性胶带，将鼠标固定在鼻锥上。

用直剃须刀或手术刀刀片剃除胸部，以30度角倾斜，并用10%聚维酮碘清洁手术区域周围的皮肤。然后，将超声探头放置在小鼠左侧胸部中间，以捕获水平窗口，以获得左心室的横截面视图。当探头的长轴朝上时，将探头固定在50度角，加热平台以20度角固定，然后将探头和支撑架锁定在位置。

在安全柜内工作时，用30号一英寸针头将细胞悬浮液拉入结核菌素一毫升注射器中。去除注射器中存在的任何气泡。将注射器锁定在立体定向注射器中。

然后在超声引导下，将针头穿过胸壁进入心脏左心室，缓慢注射100~250微升的肿瘤细胞悬浮液。对于分阶段生存手术，将麻醉小鼠放在加热垫上，并用10%聚维酮碘溶液清洁手术区域周围的皮肤。戴上无菌的个人防护设备和手套后，在动物的身体上铺上无菌的窗帘。

接下来，使用虹膜剪刀或手术刀切开皮肤，从肿瘤边缘保持五到七毫米的切除边缘。在皮内肿瘤的情况下，将肿瘤与周围皮肤一起切除。对于皮下肿瘤，解剖并切除皮下肿瘤。

肿瘤切除后，用九毫米吻合装置闭合伤口。对于体内成像，通过腹膜内注射用一毫升胰岛素注射器和28号针头向小鼠施用d-荧光素底物，然后麻醉小鼠并将其放入生物发光成像扫描仪内的鼻锥中。通过按初始化启动仪器，并将曝光时间设置为自动。

要捕获空白图像以进行背景减法，请单击"获取"，并在采集序列完成后保存图像。对于数据分析和相同的体内成像软件，导航到保存图像的文件夹，然后打开一个实验中所有小鼠的图像。将单位设置为辐射度，并确保未选中指示个人的复选框，因为这将阻止跨组的信号归一化。

接下来，使用感兴趣区域或ROI绘制工具，为大脑区域绘制圆形ROI，为身体绘制矩形ROI，排除大脑中的耳朵和鼻子ROI，因为它们往往会发出非特异性亮度。为了最大限度地减少偏差，在不覆盖发光信号的情况下在小鼠的照片上绘制ROI，然后选择测量ROI以量化信号并将数据导出到电子表格中。通过绘制感兴趣的身体区域的总光通量来分析组之间的差异。

使用软件进行 NuMA 染色后，绘制 ROI 以包括器官组织内的所有 NuMA 染色细胞，但其他器官实质和空白区域除外。调整设置以对 NuMA 阳性和 NuMA 阴性细胞进行分类，同时对每个器官使用适当的阳性和阴性对照。使用已建立的软件算法来量化每个样品的 NuMA 阳性细胞的百分比总数。

生物发光，明场，离体荧光以及苏木精和曙红染色图像说明了分析候选基因对黑色素瘤转移的影响的多管齐下的方法。岩藻糖基转移酶沉默损害了黑色素瘤细胞的转移性播散。这里显示了感染了对照琳达病毒和表达琳达病毒的转移抑制物的黑色素瘤细胞的NuMA染色肺部分。

转移性黑色素瘤细胞标记为绿色，器官区域由绿色阴影线分隔。在进行皮内注射时保持皮肤的适当张力，在准备注射器时避免空气栓塞，并获得足够的切除边缘，不应干扰动物的运动或使其易患伤口并发症，有助于提高成功率和可重复性。进一步使用多重成像来检查免疫过滤，用于基因表达分析和空间转录组学的单细胞RNA测序都可以为检查肿瘤内异质性提供互补的途径。

该协议中描述的技术组合帮助我们确定了黑色素瘤脑转移的新调节因子，例如黑色素瘤分泌的β淀粉样蛋白在抑制神经炎症和促进脑转移中的作用。