使用浸泡珠测定分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化，形态发生和图案化
January 12th, 2022
浸泡的磁珠测定涉及在任何发育时间点靶向递送测试试剂，以研究细胞分化和形态发生的调节。提出了适用于任何实验动物模型的详细方案，用于制备三种不同类型的浸泡珠子并将其植入鸡胚的间位中。
该测定使学生能够通过将磁珠植入不同的胚胎区域来观察许多发育过程中的特定分子，例如细胞分化和形态发生。该方案可应用于任何实验动物模型、细胞培养、有机细胞模型，包括类器官。此外，它是向学生教授基础发育生物学的有用教育工具。
演示该程序的将是来自实验室的本科生Alexandra Gonzales-Gonzales。首先，在38摄氏度和70%相对湿度的加湿培养箱中垂直孵育受精的白色Leghorn鸡蛋，尖头面朝下。根据汉堡和汉密尔顿的说法，一旦它们达到第28阶段，从孵化器中取出鸡蛋，用70%乙醇交换它们，让它们风干。
然后用70%乙醇对工作区域，显微镜和仪器进行消毒。接下来，用蜡烛将卵子识别血管并定位胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。
使用无齿镊子的末端，通过点击鸡蛋的钝端打开窗户，然后取下一平方厘米的壳部分。然后，将卵子转移到纸箱或塑料支架中，并将其置于体视显微镜下。使用精细的手术镊子，取出任何可能接触胚胎的小卵壳，并通过穿刺并将其拉出来去除空气膜。
接下来，使用精细的手术镊子，轻轻撕裂羊膜袋，小心不要损伤绒毛膜的脉管系统。对卵内胚胎进行分期，以确定它们是否处于所需阶段。对于阿菲凝胶肝素珠制备，切成方形的副膜部分以适合45毫米培养皿。
将伞膜放在培养皿的底部后，使用非齿镊子的末端，推动每个顶点并将其固定在培养皿的底部。接下来，使用移液器或刮刀将微球转移到微量离心管中，并通过允许它们沉降并移液上清液用PBS洗涤两次。然后，使用微型移液器，将40至50个珠子转移到覆盖的石蜡膜培养皿的中心。
在显微镜下，选择30个直径为100微米的Affi-gel或肝素珠。使用28级胚胎的第三个数字间作为参考来调整珠子的大小。磁珠必须小于数字间。
小心地去除所选珠子周围多余的PBS后，将它们浸泡在两到五微升的处理溶液中。将珠子在室温下在溶液中孵育30分钟。在孵育过程中，为了防止磁珠变干，请移液几滴珠珠周围的PBS或水以加湿局部大气，并用parafilm覆盖培养皿以减缓蒸发。
倒入AG1X2珠子制备。使用刮刀将磁珠转移到微量离心管中，并以所需的最终浓度加入50微升的处理溶液。用铝箔包裹管子以保护它们免受光照后，在缓慢摇晃时将珠子孵育20分钟。
孵育后，使用移液器，用0.2%酚红溶解在水中两分钟，在涡流中轻度搅拌，在污渍中取出尽可能多的处理溶液。染色后，除去染料，然后在PBS中洗涤珠子两次以除去任何残留的染料。接下来，使用微型移液器吸头，将40至50个AG1X2微球转移到副变形覆盖的培养皿的中心，并将微球浸泡在五微升PBS中。
然后在显微镜下，选择大约30个直径为100微米的珠子。将选定的珠子浸入实验溶液中，在珠子周围滴几滴PBS或水，以加湿当地大气。用薄膜覆盖培养皿以减缓蒸发。
在操纵胚胎之前，在台式上布置两个相邻的立体显微镜。然后，使用非齿镊子，在剩余的卵子上创建一个窗口。接下来，在显微镜下用精细的手术钳撕裂右后肢附近的羊膜。
使用细镊子，通过羊膜握住胚胎以暴露右后肢。然后使用细钨针，在后肢第三指间的最远端做一个孔。在不释放胚胎和暴露的后肢的情况下，使用镊子的尖端之一从另一个显微镜中取出一个经过处理的珠子。
镊子必须打开，一个珠子才能粘附在其尖端。将珠子转移到后肢附近的雏鸡胚胎中，将其放置在指间孔的顶部。通过关闭镊子直到其进入孔对珠子施加压力。
然后释放胚胎，用胶带密封蛋壳窗口，并将卵子放回孵化器，直到它们达到所需的阶段。为确保测定效果，必须将磁珠一致且精确地放置在正确的位置。在这项研究中，浸泡的珠子被放置在顶端外胚层脊下方第三指间的最远端。
胚胎可以用海洋蓝和茜素红染色，以证明骨骼元素的形成并评估对细胞分化的影响。该测定也非常适合评估具有中性红色和基因调控的细胞死亡，购买C2杂交。该实验工具的主要优点是控制浸泡珠子的时间和位置。
将核心定位与精确的发育时间相结合，为研究细胞分化过程提供了巨大的可能性。
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概览
浸泡珠子测定法允许在不同的发育阶段靶向递送测试试剂，以研究细胞分化和形态发生。该协议适用于任何实验动物模型，包括鸡胚。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞分化
- 胚胎学
背景
- 浸泡珠子测定法是一种研究参与发育过程的特定分子的方法。
- 它可以应用于各种实验模型，包括器官型模型和类器官。
- 该方法作为教学发育生物学基本概念的教育工具。
- 该程序的演示由本科生进行。
研究目的
- 探索细胞分化和形态发生的调控。
- 提供准备和植入浸泡珠子的详细协议。
- 增强发育生物学的教育体验。
使用的方法
- 在加湿环境中孵化受精鸡蛋。
- 准备植入的浸泡珠子。
- 将珠子植入胚胎的特定区域。
- 观察植入后的发育过程。
主要结果
- 该测定法成功地展示了测试试剂对细胞分化的影响。
- 它提供了胚胎形态发生过程的洞察。
- 该协议可适用于各种动物模型。
- 学生在发育生物学技术方面获得实践经验。
结论
- 浸泡珠子测定法是研究发育生物学的多功能工具。
- 它有助于理解复杂的生物过程。
- 该方法可以有效地用于教育环境。
常见问题
Executive Industry Relevance
The soaked-bead assay enables precise spatial and temporal delivery of morphogens or candidate molecules in embryonic models, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By controlling the local microenvironment, this method provides actionable insights into cell fate decisions, morphogenesis, and patterning, directly informing predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline. Its adaptability across model systems enhances portfolio-wide translational continuity and supports robust hypothesis testing for developmental targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of morphogen-driven pathways and cell fate specification in a controlled in vivo context.
- Supports functional validation of candidate targets by isolating the effects of specific molecules on tissue patterning.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of developmental outcomes following localized perturbation.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of gene or protein function in embryonic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated embryonic systems for downstream screening of bioactive compounds or biologics.
- Enables reproducible, quantitative assessment of phenotypic changes in response to localized molecular delivery.
- Supports assay standardization through precise bead placement and developmental staging.
- Allows for scalable adaptation to other model organisms or organotypic systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental phenotypes with disease-relevant pathways for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying the functional impact of candidate molecules on tissue formation.
- Supports predictive de-risking for developmental and regenerative medicine programs.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging hypothesis-driven target validation with phenotypic screening in embryonic models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling localized delivery and observation of morphogen effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic outputs for compound or protein evaluation.
- Analytics: Facilitates measurement of cell differentiation, patterning, and morphogenetic outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects developmental findings to preclinical model systems and potential biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse developmental and mechanistic studies across the portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for developmental assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of developmental and regenerative programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, developmental biology, and precise microsurgical manipulation.
- Needs access to stereomicroscopes, controlled incubators, and bead preparation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for bead placement, developmental staging, and phenotypic assessment.
- Adaptable to various animal models and organotypic systems with protocol optimization.
- Limitations include technical variability in bead placement and the need for precise developmental timing.
