Name: 用超极化 1-13C 丙酮酸和 13C / 31P NMR波谱研究分离灌注小鼠心脏中的心脏代谢 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 学习使用超极化[1-¹³C]丙酮酸结合³¹P核磁共振波谱技术，实时监测离体灌注小鼠心脏的代谢通量与能量状态。该方法可定量分析乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶活性，为研究生理及病理状态下的心脏代谢提供高灵敏度工具。

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该项目由以色列科学基金会资助，资助协议编号为1379/18；由以色列科学与技术部应用与工程科学直接攻读博士学位学生奖学金（Jabotinsky Scholarship）资助，资助编号为3-15892，授予D.S.；以及由欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，资助协议编号为858149（AlternativesToGd）。

希伯来大学和哈达萨医学中心的联合伦理委员会（IACUC）批准了动物福利方面的研究方案（MD-19-15827-1）。
1. 克雷布斯-亨塞尔特缓冲液的配制
<ol>
	<li>实验前一天，配制改良的克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（Krebs-Henseleit buffer, KHB）26。首先，将 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.5 mM 丙酮酸钠、1.2 mM MgSO4、25 mM NaHCO3 和 1.2 mM KH2PO4 溶解于双蒸水（H2O）中。</li>
	<li>用 95%/5% O2/CO2 混合气体对该溶液通气 20 分钟，然后加入 1.2 mM CaCl2。</li>
	<li>用 HCl 或 NaOH 将缓冲液的 pH 值调节至 7.4。</li>
	<li>实验当天，在步骤 1.2 配制的 KHB 中加入 10 mM 葡萄糖和 72 U/L 胰岛素。 
	注意：胰岛素的添加方法参照 Kolwicz 等人26 的研究，并与既往研究一致，这些研究表明胰岛素可增强心肌收缩功能27 以及超极化 [13C]碳酸氢根信号的强度28。</li>
</ol>
2. 灌注系统的准备
<ol>
	<li>将 200 mL KHB 缓冲液置于 40 °C 水浴中，并在心脏灌注前 1 小时内以 4 L/min 的流速通入 95%/5% O2/CO2 混合气体进行预饱和。整个实验过程中需持续用该混合气体对缓冲液进行鼓泡。
	<ol>
		<li>首先将水浴温度设定为 40 °C，放入 KHB 储液器。使用蠕动泵（见材料表）和医用级延长管，以 7.5 mL/min 的恒定流速将 KHB 在储液器与 10 mm NMR 管之间循环。</li>
		<li>将三条铂固化硅胶管（内径 3 mm）连接至泵上（一条进液管和两条 KH 缓冲液出液管）。将出液管和进液管插入加热的 KH 缓冲液中，随后将供氧管也插入加热的 KH 缓冲液中。</li>
		<li>使用细的聚醚醚酮（PEEK，见材料表）管路，使缓冲液和超极化试剂在核磁共振谱仪腔体内流向和流出 NMR 管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保温度维持在 37–37.5 °C。请按以下步骤操作。</li>
	<li>用设定为 42 °C 的加热带包裹从缓冲液储液器通向 NMR 管的进液管。</li>
	<li>通过核磁共振谱仪调控的暖风对谱仪内部的 NMR 管进行加热。</li>
	<li>使用与核磁共振兼容的温度传感器（见材料表）测量 NMR 管内的温度，并将其调节至 37–37.5 °C。</li>
</ol>
3. 核磁共振波谱仪的校准与采集前准备
<ol>
	<li>实验当天，将含有1,4-二噁烷的13C标准样品（材料表）插入核磁共振波谱仪中，调节并匹配NMR探头至13C。然后，以90°翻转角获取1,4-二噁烷的热平衡信号谱图。</li>
	<li>随后将13C标准样品更换为含105 mM ATP溶于D2O中的31P标准样品（材料表），调节并匹配NMR探头至31P。 
	注意：以50°翻转角获取磷酸盐热平衡信号的谱图。</li>
	<li>将进液管、出液管和温度探头插入一根10 mm NMR样品管中，然后将该样品管插入磁体孔腔内。将加热带调节至42 °C。</li>
	<li>对实验中所用的循环KH缓冲液，以50°翻转角和1.1 s的弛豫延迟（TR）连续采集30分钟的31P NMR谱图（共1,640次累加）。</li>
</ol>
4. 动物准备、手术操作及在核磁管中对心脏进行灌注
<ol>
	<li>用3.3%异氟烷与空气混合气体麻醉一只雄性HSD:ICR（CD-1）小鼠（材料表) 使用气体麻醉系统以340 mL/min流速持续5分钟材料表在诱导室中。</li>
	<li>使用2.9%异氟烷进行鼻内麻醉以维持全身麻醉。 
	注意：需尽量减少动物的疼痛和不适。</li>
	<li>用胶带固定动物的四肢，确认足底疼痛反射呈阴性，然后腹腔注射300 IU肝素钠。</li>
	<li>用70%酒精充分湿润小鼠的胸壁和腹部，以确保清洁，并避免在手术过程中毛发污染或阻碍操作。</li>
	<li>肝素注射后1分钟，用小剪刀剪开腹腔的皮肤和肌肉。</li>
	<li>将小型弯嘴持针器-锁定式蚊式钳置于剑突与胸部皮肤之间，抬起胸壁以暴露膈肌。穿刺并剪开膈肌右叶。</li>
	<li>沿中线切开胸部，向两侧牵开并移除。</li>
	<li>向心脏左心室注射 200 IU 肝素钠以防止血液凝固。随后，如前所述，注射 0.1 mL 冰冷的 0.5 mol/L KCl 以实现心脏停搏。25心脏停搏对于心脏插管至关重要。</li>
	<li>识别胸腺，并用剪刀将其移除以暴露主动脉。清除残留的肋骨组织。</li>
	<li>识别主动脉弓，使用弯头镊子将3-0丝线松松结扎材料表在升主动脉周围进行操作。向左心室注入3 mL KHB，以清除主动脉中的血凝块。</li>
	<li>使用弯头镊子将心脏向下牵拉，以更好地暴露升主动脉。</li>
	<li>进行插管 原位 使用22 G静脉导管（材料表）。在套管区域涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂，然后进行双重缝合结扎。向心脏注入额外的KH缓冲液，确认其流经套管导管。</li>
	<li>移除弯镊。将心脏与周围脏器分离，并用冰冻的KHB溶液逆行灌注心脏。4 °C通过静脉导管注入。</li>
	<li>将心脏连接至灌注系统的流入管路 通过 静脉导管。当使用温热缓冲液（37-37.5 °C以 7.5 mL/min 的流速灌注时，心脏开始自发搏动。</li>
	<li>用夹具固定装有跳动心脏、流出管道和温度探头的核磁共振管，并将其插入波谱仪的磁体孔中，确保心脏位于核磁共振探头的中心位置。</li>
</ol>
5. 获取心脏能量代谢与 pH 数据
<ol>
	<li>使用50°翻转角和1.1 s的TR，采集约1小时的31P谱。</li>
</ol>
6. DNP自旋极化与溶解
<ol>
	<li>制备含有28.5 mg的[1-13C]丙酮酸制剂。该制剂由11.1 mM至14.0 mM的OX063自由基组成，溶于纯酸中。</li>
	<li>准备4 mL溶解介质。溶解介质为TRIS-磷酸盐缓冲液，包含11.2 mM NaH2PO4、38.8 mM Na2HPO4、33 mM TRIS和2 mM HCl。该介质的组成需进行调整，使得将28.5 mg的[1-13C]丙酮酸制剂加入4 mL该缓冲液（溶解阶段）后，所得溶液的pH值为7.4。</li>
	<li>按照制造商说明（材料表），在溶解-动态核极化（dDNP）自旋极化装置中进行自旋极化和快速溶解。在94.110 GHz频率下施加微波辐照，对[1-13C]丙酮酸制剂在1.45 K至1.55 K条件下进行约1.5小时的极化。</li>
	<li>迅速将来自dDNP装置的4 mL超极化介质与充分氧合的溶液混合，使混合后的组成与灌注介质高度匹配。 
	注：在使用14 mM超极化[1-13C]丙酮酸进行超极化注射期间，灌注心脏的介质最终体积为26 mL。注射介质（混合后）的最终组成包含4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、70 mM NaCl、25 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、10 mM葡萄糖、1.2 mM CaCl2和72 U/L胰岛素。</li>
	<li>通过连续流动系统向离体心脏给予含超极化[1-13C]丙酮酸的介质29。 
	注：此操作旨在确保实验过程中心脏灌注不受任何干扰，并且超极化介质以已知速率和持续时间给药。</li>
</ol>
7. 超极化13C波谱学
<ol>
	<li>采用选择性饱和激发脉冲获取超极化13C数据15，施加2.5 ms的方波正弦（Sinc）脉冲，具体方法如前所述15,16。在6秒间隔内依次选择性激发[1-13C]乳酸盐和[13C]碳酸氢盐，以获得每种代谢物12秒的检测间隔。</li>
	<li>检测[1-13C]乳酸盐时，将选择性Sinc脉冲中心设在[1-13C]丙酮酸水合物频率（179.4 ppm），从而使[1-13C]丙酮酸与[1-13C]乳酸盐的C1信号强度比（lac）为0.113。</li>
	<li>检测[13C]碳酸氢盐时，将选择性Sinc脉冲中心设在157.7 ppm，该频率比[13C]碳酸氢盐信号（161.1 ppm）低场方向偏移214 Hz；这使得[1-13C]丙酮酸与[13C]碳酸氢盐的C1信号强度比（bic）为0.139。</li>
</ol>
8. 组织湿重和体积的测定
<ol>
	<li>实验结束时，将心脏从灌注系统上取下，并用滤纸轻轻吸干。随后称量心脏，获得组织湿重。</li>
	<li>根据先前测定的小鼠心脏密度值 1.05 g/cm3，计算心脏体积30。</li>
</ol>
9. ATP 含量定量
<ol>
	<li>对ATP标准样品的单次采集信号以及离体心脏在30分钟内的采集信号（重复时间TR为1.1秒，共1,640次采集）中的γ-ATP信号进行积分。</li>
	<li>通过将心脏γ-ATP信号的积分值与标准样品（材料表）的积分值进行比较，定量心脏中的ATP含量，其中标准样品的浓度已知（105 mM），并校正采集次数和弛豫效应的影响。</li>
</ol>
10. 解析心脏的 Pi 信号
注意：为了评估组织的 pH 值，首先需要将心肌的无机磷酸盐（Pi）信号从总无机磷酸盐信号（Pit）中分离出来。这可通过从 Pit 信号中扣除 KHB 中的 Pi 信号（PiKH）来实现。
<ol>
	<li>在显示单一 Pi 信号（PiKH，图 1A）的 KHB 的 31P 谱中，使用 Excel（材料表）将 PiKH 信号拟合为洛伦兹函数。</li>
	<li>核磁共振探头可见体积（Vp，1.375 mL）在样品管中不含心脏时含有更多的 KHB。为校正此填充效应，使用公式 1A 计算衰减的缓冲液信号（Pib）。 
	<img alt="渗透压公式；公式：Pi_b = Pi_kH ((Vp-Vh)/Vp)；科学计算。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">   公式 1A 
	其中 Vh 为心脏体积，由步骤 8 确定。</li>
	<li>根据公式 1B，从 Pit 中减去该信号，以获得仅来自灌注心脏的 Pi 信号（Pih，图 1B）。 
	<img alt="静态平衡公式：Pi_h=Pi_t-Pi_b，用于流体动力学中的压力分析。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2">   公式 1B</li>
</ol>
11. 多参数 pH 分析
<ol>
	<li>完成Pi的转换h 将信号化学位移分布相对于PCr的化学位移参照式2拟合至pH值31. 
	<img alt="pH 计算公式，pH 方程，pKa，对数，缓冲液，酸碱平衡，数学图解" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3">   公式 2 
	其中，Δδ 为化学位移差，pKa 为 6.72，δ 自由碱为 5.69，δ 自由酸为 3.27，如前所述31.</li>
	<li>校正由此产生的Pi非线性关系对pH分布曲线的影响h 化学位移标度和pH标度（依据Lutz等人的方法）32. 由此计算得到的典型pH分布如图所示 图1C.</li>
	<li>采用Lutz等人提出的方法，通过七个统计参数的多参数分析来评估组织pH分布.32. 此处展示了其中四个参数，因其对组织 pH 的描述性最强：1）全局最大 pH 值；2）加权平均 pH 值；3）加权中位 pH 值；以及 4）pH 图的偏度（图1C).</li>
</ol>
12. LDH 和 PDH 活性计算
注意：分别使用超极化代谢物[1-13C]乳酸和[13C]碳酸氢盐的生成速率来计算LDH和PDH活性。在产物选择性饱和激发方法15中，每种选择性激发仅检测新合成的超极化代谢物。
<ol>
	<li>使用超极化 [1-13C]丙酮酸信号作为参考，以确定相应代谢物的生成水平。
	<ol>
		<li>在灌注超极化培养基期间，NMR 管中的 [1-13C]丙酮酸浓度先升高（流入阶段），随后达到平台期（最大浓度为 14 mM），然后下降（流出阶段）。</li>
		<li>为了确定丙酮酸浓度达到稳定水平（平台期）的时间点，使用有效弛豫常数 Teff 对 T1 弛豫和射频脉冲引起的信号衰减进行校正，从而校正 [1-13C]丙酮酸信号。</li>
		<li>针对每次注射，根据其对 [1-13C]丙酮酸衰减曲线的校正能力来定义 Teff，以反映该流动动力学特征（公式 3）。 
		<img alt="校正后的丙酮酸方程，同位素标记，衰减校正，生化分析。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 4">   公式 3 
		其中 <img alt="静态平衡公式，Spyrbic(t)，用于科学分析和计算的符号方程。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 5"> 是在 [13C]碳酸氢根信号采集期间获得的 [1-13C]丙酮酸信号。本研究中实验所得的平均 Teff 为 35.8 s ± 2.3 s（n = 5 个心脏）。</li>
		<li>选择浓度在最大校正后 [1-13C]丙酮酸信号的 10% 范围内的数据点，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第 12.1 步所选时间点，使用相应的 [1-13C]乳酸和 [13C]碳酸氢根生成数据，根据公式 4A 和公式 4B 计算代谢物生成速率，前提是代谢物信号的信噪比（SNR）大于 2（分析阈值）。此类时间点选择的典型示例如 图 2B 所示（高亮的时间窗口）。</li>
	<li>使用公式 4A 和公式 4B 计算每个选定数据点的生成速率： 
	<img alt="乳酸脱氢酶动力学方程，用于乳酸和丙酮酸浓度分析；生化分析方法。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 17">   公式 4A 
	<img alt="丙酮酸脱氢酶反应速率方程；生化研究中的动力学分析。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 6">   公式 4B 
	其中 <img alt="乳酸脱氢酶活性函数 \(v_{\text{LDH}}(t)\) 的动力学分析方程。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 7"> 和 <img alt="丙酮酸脱氢酶速率符号表示 v_PDH(t) 的方程。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 8"> 分别表示每个时间点 [1-13C]乳酸或 [13C]碳酸氢根的生成速率。<img alt="静态平衡，ΣFx=0，MA=0，示意图；力的分析，机械优势。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 9"> 和 <img alt="流体动力学方程，ρ_bic，科研中的符号。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 10"> 分别表示 [1-13C]丙酮酸及其产物 [1-13C]乳酸或 [13C]碳酸氢根的相对激发因子。这两个因子先前已被确定为 0.113 和 0.13929。Vp 是 NMR 探头检测到的体积（1.375 mL），TR 表示连续两次产物选择性饱和激发之间的时间间隔（每种产物为 12 s），<img alt="静态平衡，ΣF=0，方程，教育用途，力学平衡概念，物理课程。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 11"> 和 <img alt="静态平衡公式 Sbic(t)，用于动态分析；方程示意图。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 12"> 分别为 [1-13C]乳酸和 [13C]碳酸氢根的信号，而 <img alt="静态平衡公式 S&lt;sub&gt;pyr_lac&lt;/sub&gt;(t)。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 13"> 和 <img alt="静态平衡方程 \(S_{pyr\_bic}(t)\)，在机械系统分析中相关。" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 14"> 分别为在 [1-13C]乳酸和 [13C]碳酸氢根激发期间采集的 [1-13C]丙酮酸信号。[Pyr] 是 [1-13C]丙酮酸浓度，在平台期为 14 mM。
	<ol>
		<li>确定每个时间点的速率，然后对每次超极化注射的数据取平均值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们展示了一种实验装置，旨在研究离体小鼠心脏模型中高极化[1-13C]丙酮酸的代谢、组织能量学及pH值。
该方案中的关键步骤如下：1）确保缓冲液的pH值为7.4；2）确保缓冲液中包含所有组分；3）通过注射肝素防止心脏血管内血液凝固；4）通过降低代谢活性（注射KCl并使用冰冻缓冲液）避免心脏缺血损伤；5）在整个操作过程中避免向心脏引入气泡；6）通过观察组织颜色变化（由深红色变为浅粉色）验证主动脉插管成功；7）当心脏转移至温热缓冲液后，确保灌注持续进行；8）密切监测位于心脏旁核磁共振谱仪中NMR管内的温度，并维持在37 °C；9）在整个测量过程中检查磁场均匀性；10）使用准确且经过校准的射频脉冲参数。
技术的改进与故障排除 
本研究中采用了以下几项改进措施：1）手术后使用冰冻的KHB缓冲液进行灌注，以保护心脏；2）在整个实验过程中对缓冲液的pH值进行了验证，以确保该参数处于可控状态，不会成为结果变异的来源。这些验证在制备和实验的各个步骤中进行，使用了pH计、pH指示试纸...

心脏代谢的改变与多种心肌病相关，且常常构成潜在病理生理机制的基础1。然而，研究活体组织中的代谢存在诸多障碍，因为大多数生化检测需要对组织进行匀浆、细胞裂解和/或放射性示踪。因此，迫切需要开发新工具以研究活体组织中的心肌代谢。利用超极化13C标记底物进行磁共振（MR）检测，可通过将标记位点的MR信噪比（SNR）提高数个数量级，实现对活体组织代谢的实时测量2，且无需使用电离辐射3。本文介绍了一种用于研究离体小鼠心脏快速代谢的实验装置、数据采集方法和分析方法，同时并行提供有关组织总体能量状态和酸度的指标。心肌pH值是一个重要的指标，因为在心肌缺血、不良性肥厚和心力衰竭等心脏疾病和病理状态的早期阶段，酸碱平衡即已发生紊乱6。
超极化[1-13C]乳酸和[13C]碳酸氢根由超极化[1-13C]丙酮酸生成，有助于测定乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸脱氢酶（PDH）的生成速率。以往大多数在离体啮齿类动物心脏中使用超极化底物的研究，要么采用复杂的动力学模型来推导LDH和PDH的酶活性，要么仅报告超极化产物与底物的信号强度比值，而未计算实际的酶活性速率2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。本研究采用了产物选择性饱和激发方法15，该方法可无需依赖模型地监测酶活性15,16。通过该方法，确定了绝对酶反应速率（即单位时间内生成产物的摩尔数）。31P波谱技术用于检测无机磷酸盐（Pi）、磷酸肌酸（PCr）和三磷酸腺苷（ATP）的信号。采用多参数分析方法表征心脏的pH分布，该分布表现为组织中Pi信号的非均一化学位移。
逆向灌注小鼠心脏（Langendorff心脏）17,18,19&#160;是一种完整跳动心脏的离体（ex vivo）模型。在此模型中，心脏的存活性和pH值可至少维持80分钟20，并且已显示出在经历长时间缺血损伤后具有恢复潜力21,22。然而，微手术过程中无意的变异可能导致不同心脏间组织存活性的差异。先前的研究已报道过该心脏模型随时间推移而出现的功能退化19；例如，每小时可观察到收缩功能下降5%–10%18。已有研究表明，三磷酸腺苷（ATP）信号可反映心肌的能量状态和存活性23。在此，我们注意到，尽管灌注和氧气供应保持连续，灌注心脏的ATP含量仍偶尔表现出非预期的存活性水平变异。本文表明，将乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸脱氢酶（PDH）的反应速率标准化为心脏的ATP含量，可降低这些速率在不同心脏间的差异性。
在以下方案中，我们描述了用于心脏插管、离体及随后在核磁共振波谱仪中灌注的小鼠心脏手术操作流程。值得注意的是，此前已有其他手术方法被用于小鼠心脏的分离与灌注24,25。
本文还描述了用于获取跳动心脏中酶反应速率相关数据的方法（采用13C波谱法和超极化[1-13C]丙酮酸盐），以及评估心脏活力和酸度的方法（采用31P核磁共振波谱法）。最后，阐述了用于测定代谢酶活性、组织活力和酸度的分析方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP 极化仪</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense，3.35 T，临床前溶解型动态核极化（DNP）超极化系统</td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪&amp;nbsp;</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR Cube，5.8 T，配备10 mm宽带探头</td></tr><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>温度探针</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>与核磁共振兼容的温度探针</td></tr><tr><td>Somnosuite 低流量麻醉系统</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;导管、管路与缝合线&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂固化硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 内径 3.1 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细聚醚醚酮（PEEK）管路</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>内径 0.040&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>静脉导管&amp;nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>线径 3-0</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品与药品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C]丙酮酸</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>37% 盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>门冬胰岛素（诺和锐）</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Gadot Group</td><td></td><td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS（生物技术级）</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>三苯甲基自由基 OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;核磁共振标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C 标准样品</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>苯-D6 中含 40% 对二氧六环</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;31&lt;/sup&gt;P 标准样品</td><td>实验室自制</td><td></td><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中含 105 mM ATP 和 120 mM 苯基磷酸</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用超极化 [1-13c]丙酮酸及 13c/31p 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

代谢是细胞生命活动中重要过程的基础。阐明代谢网络在活体组织中的功能机制，对于理解疾病机理和设计治疗方案具有关键意义。本文描述了一种实时研究逆行灌流小鼠心脏中细胞内代谢活性的实验流程与方法。心脏被分离 原位&#160;与心脏骤停同时进行以最大限度减少心肌缺血，并在核磁共振（NMR）波谱仪内进行灌注。在波谱仪内并持续灌注条件下，超极化[1-13C]丙酮酸被给予心脏，随后的超极化[1-13C]乳酸和[13C]碳酸氢盐的生成速率用于实时测定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的活性。该代谢活性基于超极化[1-13采用无模型的产物选择性饱和激发采集方法，通过核磁共振波谱法对C]丙酮酸进行定量分析。 31采用磷-31谱（P spectroscopy）在超极化采集过程中监测心脏能量代谢和pH值。该系统在研究健康及病变小鼠心脏代谢活性方面具有独特优势。

的 31灌注KHB的鼠心及仅缓冲液的31P谱图如图所示 图1A在心脏中观察到α-、β-和γ-ATP、PCr及Pi的信号。Pi信号由两个主要组分构成：较高场强区域（信号左侧）的Pi信号主要来源于pH为7.4的KHB；较低场强区域（信号右侧）的Pi信号更宽且不均一，源于更酸性的环境。后一种模式来自心肌组织。通过减去KHB的Pi信号，可提取心肌组织的Pi信号图1B）然后将 ppm 标度转换为 pH 标度（图1C）。通过计算组织无机磷（Pi）信号的加权均值、加权中位数、全局最大值和偏度，进行多参数分析以研究pH值。图1C).
<img alt="显示心脏和KH缓冲液中磷酸盐代谢的核磁共振谱；图形比较Pi峰和pH偏移。" class="xfigimg...

我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化13C标记的代谢物。采用专门的13C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数31P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。

使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

代谢是细胞生命活动的重要过程的基础。阐明代谢网络在活体组织中的功能机制，可提供关键的……

大家好。在本视频中，您将学习如何对灌注小鼠心脏进行超极化磁共振研究。实验室的医学博士/理学博士生 David Shaul 将指导您完成各项技术与操作步骤。今天我们将学习一种研究超极化碳-13丙酮酸代谢的方案，并结合磷-31核磁共振波谱技术。丙酮酸代谢处于有氧代谢与无氧代谢的交汇点，因此在研究心脏的各种生理病理状态方面具有重要价值。接下来，让我们开始吧。将小鼠心脏分离后置于10毫米核磁共振（NMR）管内，用克雷布斯-亨斯莱特缓冲液进行灌注。随后将心脏插入核磁共振波谱仪中，通过检测三磷酸腺苷、磷酸肌酸和无机磷酸盐的共振信号，记录³¹P谱以观察心肌能量代谢状态和pH值。同时，将一个在第一位碳上标记有碳-13的丙酮酸盐样品进行超极化。溶解后，将其注入心脏，以实现实时测量乳酸、无机物以及丙酮酸盐的代谢活动。实验前一天，配制400毫升改良的Krebs-Henseleit缓冲液。第一步，将这些成分溶于双蒸水中。然后用该氧气混合物通气处理该溶液 20 分钟，随后加入氯化钙。调节 pH 至 7.4。在实验当天，加入葡萄糖和胰岛素。将水浴锅温度设置为40摄氏度。将装有200毫升KH缓冲液的培养基瓶放入水浴锅中。使用蠕动泵循环KH缓冲液。连接一条进液管和两条出液管。将进液管和出液管插入加热的KH缓冲液中。使用氧气混合器混合95% O2和5% CO2，然后将氧气管插入预热的KH缓冲液中。打开蠕动泵，并调节至恒定流速为7.5毫升/分钟。在引入心脏之前，我们需要对系统进行校准。因此，将流入和流出管道插入一根10毫米的核磁共振（NMR）试管中，并插入与NMR兼容的光学温度探针。将该NMR试管插入磁体孔腔中。将加热槽调节至 42 摄氏度，并使用核磁共振（NMR）加热系统将磁体内部温度调节至 37 摄氏度。请注意，NMR 温度实际上是通过磁体内部缓冲液中的 KH 缓冲液，利用与 NMR 兼容的温度探头进行监测的。现在，我们可以使用 31P 谱学方法来观测缓冲液中无机磷酸盐的信号。这是进行手术所需的设备。将100毫升KH缓冲液置于冰上，并用相同的氧气混合气体进行鼓泡。在诱导阶段，将小鼠置于麻醉箱中，使用3.3%异氟烷与室内空气混合进行麻醉，气体流速为每分钟340毫升。将小鼠转移至鼻腔麻醉装置。在相同流速下将异氟烷浓度降至2.9%。轻捏小鼠足部以确认无足底疼痛反射，且小鼠已完全麻醉。向小鼠腹腔注射 300 单位肝素钠。在剑突下方 2 厘米处切开皮肤。切开腹壁以暴露腹腔。将剪刀钳置于剑突与胸壁皮肤之间，用于牵拉胸壁以暴露膈肌。穿刺膈肌右叶，随后剪开其余部分的膈肌。沿胸壁正中线剪开，注意避免接触心脏和血管等深层器官。向心脏左心室注射200单位的肝素钠。向心脏注射0.1毫升0.5摩尔的KCL以实现心脏停搏。将胸腺组织向前牵拉，并从其根部剪除，以暴露其下方的主动脉。尽量去除尽可能多的胸腺组织，同时避免损

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用超极化[1-13C]丙酮酸和 13C / 31P NMR波谱研究分离灌注小鼠心脏中的心脏代谢

采用Langendorff模式的离体心脏灌流结合31P核磁共振波谱法，将生物化学与生理学整合于同一实验中。该方案可在连续监测心脏生理功能的同时，动态测定心肌高能磷酸化合物的含量及其转换速率。若操作正确，此技术是评估心脏能量代谢的有力手段。...

使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

多室动态模体用于模拟使用超极化磁共振试剂进行代谢研究时感兴趣的某些生物学特性。...

使用多室动态单酶仿体研究超极化磁共振造影剂

以下方案描述了用于定量测定离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的缓冲液的配制与使用方法。同时讨论了样品分析和数据解读所采用的方法。...

离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法

动态核极化结合后续样品溶解技术已实现对生物系统中代谢过程的实时研究。超极化[1-13C]丙酮酸用于研究前列腺癌细胞系中的乳酸脱氢酶活性 体外.

超极化13C代谢磁共振波谱与成像

本文介绍了一种在灌注心脏中使用心室内光学导管的方法，用于对心脏壁进行跨壁吸收光谱分析。所获得的数据可在此广泛应用的实验模型中，同步提供关于组织氧张力、底物利用和膜电位的信息，同时结合心脏功能的测量指标。...

用于灌注哺乳动物心脏跨壁吸收光谱监测细胞代谢的腔内心脏侧向发光导管

我们介绍了一种利用快速变场弛豫测量法测定通过动态核极化实现超极化的13C富集化合物的自旋-晶格弛豫时间随磁场变化的实验方案。具体而言，我们以[1-13C]丙酮酸为例进行了演示，但该方案可推广至其他超极化底物。...

测量超极化[1-13C]丙酮酸的自旋-晶格弛豫磁化率随磁场的变化

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。...

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。...

离体灌注大鼠心脏的光学标测

以下方案概述了分离、通气并连接小鼠肺脏以测量稳态或脉动性肺血管压力-流量关系的过程，旨在量化血流、气流、气道变化及血管变化对右心室后负荷的影响。...

采用脉动流灌注的离体、通气并插管小鼠肺脏的表征

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)2 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物...

使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基

关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

学习使用超极化[1-¹³C]丙酮酸结合³¹P核磁共振波谱技术，实时监测离体灌注小鼠心脏的代谢通量与能量状态。该方法可定量分析乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶活性，为研究生理及病理状态下的心脏代谢提供高灵敏度工具。

使用超极化 [1-¹³C]丙酮酸及 ¹³C/³¹P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

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