培养的 果蝇 脑外植体中的神经干细胞再激活

我们开发了一种在培养的果蝇脑外植体中重新激活静止神经干细胞的方法。该方法可以向培养基提供外源因子，并且可以测定神经母细胞再活化。通过更好地了解静止干细胞如何响应外在线索并进入细胞周期，可以开发更好的干细胞疗法。

演示该程序的将是来自我实验室的研究科学家Susan Doyle。首先，在解剖显微镜下从葡萄琼脂平板中仔细挑选约20至25只新鲜孵化的幼虫。在培养皿中装满约两毫升PBS，并将含有幼虫的工具尖端浸入PBS中两分钟。

两分钟后，将培养皿倾斜一定角度以将底部的液体池化，并使用小油漆刷将幼虫从液体中刷出培养皿的底部。收集油漆刷上的所有幼虫，并用70%乙醇短暂冲洗幼虫，然后将其转移回含有PBS的培养皿中。用70%乙醇喷洒工作区域，解剖工具，镊子和两个玻璃表盘，让它们在工作台上干燥。

制作补充的施耐德培养基或SSM，并将其放在冰上。将一毫升培养基移入每个玻璃表盘中。使用带有无菌尖端的微量移液管，将新鲜孵化的幼虫从PBS板转移到第一个玻璃手表盘中的SSM。

使用SSM在解剖显微镜下使用镊子从放置在第二个玻璃手表盘中的幼虫中解剖大脑，并根据需要调整放大倍率。用一个镊子抓住嘴钩，另一个用镊子轻轻地抓住身体的一半，向相反的方向拉动，将幼虫分成两块。解剖15至20个大脑后，将一毫升SSM加入一个无菌24孔培养盘的孔中。

使用微量移液管和无菌尖端，将新鲜解剖的大脑转移到SSM中，然后将培养基与大脑在25摄氏度下孵育24小时。将10微升的5-乙炔基-2’脱氧尿苷或EDU与990微升SSM移液到无菌微量离心管中，混合，然后将一毫升EDU SSM移液到无菌12孔培养盘中。使用带有无菌尖端的微量移液管将大脑从含有SSM的孔转移到含有EDU SSM溶液的新孔中，并在25摄氏度下孵育一小时。

接下来，将EDU标记的大脑转移到含有一毫升固定剂的同一培养托盘中的另一个孔中，并允许大脑固定20分钟。固定后，使用微量移液管将大脑快速转移到72孔迷你托盘孔中。用10微升PBT冲洗大脑三次，每次重复三次洗涤10分钟，确保大脑始终覆盖一些液体。

将10微升的阻断溶液移液到大脑上。盖上托盘，并在边缘周围用一条石蜡膜密封。该图显示了大尺寸的EDU阳性和死区阳性神经母细胞在SSM中用胰岛素和染色培养24小时后。

在没有胰岛素的情况下补充施耐德培养基24小时后，新鲜孵化的俄勒冈R野生型大脑没有大尺寸的EDU阳性和死区阳性神经母细胞，除了四个蘑菇体神经母细胞和一个腹外侧神经母细胞。在共聚焦成像期间，偶尔会观察到一些受损的大脑半球，例如外植的脑组织中的小到大尺寸的孔。任何有孔的大脑都不用于分析。

仔细剖解组织并轻轻移液，以避免任何组织损伤。还要尽量无菌，不要污染您的培养物。由于培养基可以通过添加不同的因子轻松操纵，因此该技术可用于解决未来关于外在信号传导和神经母细胞静止进入和退出的假设。