Name: 培养的 果蝇 脑外植体中的神经干细胞再激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学习利用培养果蝇脑外植体技术重新激活静止神经干细胞的方法，通过添加外源因子和EDU标记分析神经母细胞再激活过程。该技术为研究干细胞静止与激活机制提供了可靠的实验平台。

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我们感谢LSAMP博士桥接项目（CNK）以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，资助号：R01-GM120421 和 R35-GM141886）提供的经费支持。我们感谢Conor Sipe博士提供图1。同时感谢Siegrist实验室所有成员的持续支持与指导。我们特别感谢Chhavi Sood和Gary Teeters仔细审阅手稿并提出宝贵意见。

1. 果蝇 幼虫采集
注意：开始前请准备好酵母平板、葡萄糊以及果蝇饲养盒：
<ol>
	<li>酵母糊：取一个小型容器，将 5 g 活性干酵母与 10 mL 水混合，搅拌成类似花生酱质地的糊状物。用塑料薄膜覆盖容器口，并用橡皮筋将其牢固固定。
	 
	注意：新鲜酵母糊在容器中会膨胀，若未牢固固定，可能将盖子顶开。酵母糊在室温（RT）下可保存数天。</li>
	<li>葡萄培养基平板：按照配方制备葡萄培养基平板（表 1）。若使用储存在 4°C 的平板，请在使用前将其置于室温下预热 1 小时。
	<ol>
		<li>在 4 L 锥形瓶中加入水（750 mL）和琼脂（18.75 g），旋摇混匀，于液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。</li>
		<li>在 1 L 锥形瓶中加入葡萄汁（250 mL）和蔗糖（25 g），放入大号搅拌子并在加热板上低温加热搅拌。待蔗糖完全溶解后，关闭热源，待瓶体冷却至可触摸时，加入 Tegosept（10%，4 mL）和丙酸（5 mL），并保持搅拌。</li>
		<li>高压灭菌完成后，让溶液冷却至瓶体可触摸（约 60 °C），然后加入葡萄汁混合液。</li>
		<li>将所有溶液合并至同一锥形瓶中，继续在加热板上搅拌。</li>
		<li>用移液器将溶液滴加至小型培养皿（35 mm）的盖子中，每盖约加 9 mL，或直至形成凸面穹顶状。</li>
		<li>可选：用火焰灼烧盖子表面以去除气泡。</li>
		<li>待平板凝固后，将葡萄培养基平板叠放于带密封盖的盒子中，并置于 4 °C 保存。平板可保存长达 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇饲养瓶（fly condo）：使用 18 号针头在 6 盎司方形底聚丙烯 Drosophila 培养瓶上打约 20 个孔。</li>
	<li>将成年果蝇（约 100 只 OregonR 或任意基因型）转移至果蝇饲养瓶中，用一个覆盖少量酵母糊的葡萄琼脂平板封口，并将酵母糊置于平板中央。用实验室胶带将平板固定在饲养瓶上。</li>
	<li>将容器倒置，使葡萄琼脂平板位于底部，放入 25 °C 培养箱中孵育 24 小时（图 2）。</li>
</ol>
<img alt="果蝇培养，遗传学实验示意图，显示试管中的果蝇置于实验室培养箱中。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：倒置果蝇瓶（“公寓”）中雄性和雌性 Drosophila 成虫的示意图。 塑料瓶上用18 G针头扎有微小穿孔，用于气体交换。瓶口用琼脂葡萄汁封口密封，倒置后置于25 °C培养箱中保存。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>24 小时后，更换葡萄糖琼脂平板，并换上一个新的、表面覆盖有酵母糊的平板。在更换时，迅速交换两个平板，同时轻轻敲击培养盒的侧面，以防止成年果蝇逃逸。</li>
	<li>用肉眼观察平板，评估平板上胚胎的数量。Drosophila 胚胎呈长椭圆形、白色，具有两条细丝状附属结构。</li>
	<li>如果平板上的胚胎数量极少（少于 100 个），则丢弃该平板（将琼脂刮入果蝇废弃物容器中，并保留塑料盖以重复使用）。在许多情况下，成年雌性果蝇在新培养盒中第一晚产卵数量较少。若属此情况，应再给予成年果蝇 24 小时以适应环境。</li>
	<li>如果平板上有大量胚胎（至少 100 个），则保留该平板，并使用平底刮刀小心去除酵母糊。</li>
	<li>去除酵母糊后，在解剖显微镜下使用金属挑针手动清除葡萄糖琼脂平板上的所有幼虫。在解剖显微镜下观察时，应能观察到爬行的幼虫以及胚胎。</li>
	<li>通过将金属挑针朝向单个幼虫的一侧轻轻刷动，将所有幼虫移除。幼虫具有黏性，会黏附在挑针上。一旦有一个幼虫黏附在挑针上，便可利用该幼虫进一步黏附更多的幼虫。 
	注意：幼虫倾向于彼此黏附。在此步骤中，幼虫是否受损并不重要，这些幼虫将被丢弃。</li>
	<li>挑取并清除所有幼虫后，将平板放回 25 °C 培养箱中。确保将平板置于一个可密封的较大容器中，并在该容器底部放置湿润的纸巾以保持湿度。</li>
	<li>30–60 分钟后，将平板重新取出并置于解剖显微镜下，此时小心挑取约 20–25 条来自同一葡萄糖琼脂平板的幼虫，以确保所挑取的幼虫是在 30–60 分钟时间窗口内刚刚孵化的。</li>
	<li>将带有 20–25 条刚孵化幼虫的工具尖端浸入一个装有 1–2 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿（60 mm）中，持续 2 分钟。</li>
	<li>2 分钟后，将培养皿倾斜，使液体聚集于底部。使用小型画笔将幼虫从液体中刷出，沿培养皿底部向上移动。</li>
	<li>用画笔收集所有幼虫，并将其转移至另一个新的培养皿（60 mm）中，该培养皿内含有 1–2 mL 70% 乙醇。重复步骤 1.15，使用画笔收集幼虫，并将其转移至另一个含有 1–2 mL 1× PBS 的新培养皿中。</li>
</ol>
2. 培养基与工具准备
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒实验台和工作区域，并静置晾干。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒解剖工具、镊子以及两个玻璃培养皿，并将其放置在实验台上晾干。</li>
	<li>配制添加物的Schneider培养基（SSM，表2），并置于冰上。</li>
	<li>用移液器将1 mL SSM加入每个玻璃培养皿中。</li>
	<li>使用带无菌吸头的微量移液器，将新孵化的幼虫从PBS培养皿转移至第一个玻璃培养皿中的SSM中；再使用带无菌吸头的微量移液器，将新孵化的幼虫转移至第二个玻璃培养皿中的SSM中。</li>
</ol>
3. 解剖与脑组织培养
<ol>
	<li>当幼虫转移至第二个盛有 SSM 的玻璃培养皿后，使用镊子和解剖显微镜将幼虫的脑组织解剖出来。根据需要调整放大倍数。</li>
	<li>用一把镊子夹住口钩，另一把镊子轻轻夹住幼虫体部中段，向相反方向拉动（图 3），使幼虫断裂为两部分。 
	注意：脑组织位于口钩正后方。注意脑周围可能附着其他组织。在去除这些组织时需格外小心，以免损伤脑组织</li>
</ol>
<img alt="解剖技术示意图；培养皿中幼虫脑部和口钩解剖结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：含SSM的玻璃培养皿中的 Drosophila 幼虫。 镊子已正确放置，用于解剖。幼虫脑部（深灰色）位于口钩（黑色）后方，两者均显示在幼虫体内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>解剖完15-20个脑组织后，向无菌12孔细胞培养板的一个孔中加入1 mL SSM。使用移液器和无菌吸头将 freshly dissected brains 转移至SSM中（图4A）。</li>
	<li>将含有脑组织的SSM培养液置于12孔细胞培养板中，放入25 °C培养箱中孵育24小时（图4A）。</li>
</ol>
<img alt="组织培养实验装置；脑解剖、孵育、移液器、多孔板示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：脑组织培养与免疫染色。（A）置于含1 mL SSM的12孔培养板中的完整脑组织。将培养板放入25 °C培养箱中孵育24 h。（B）用于免疫染色过程中承载脑组织外植体的72孔小托盘。使用设定为10 μL的P20微量移液器进行脑组织的洗涤及溶液转移。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 增殖实验、脑组织固定与抗体染色
<ol>
	<li>次日，配制1 mL EdU SSM溶液。用移液器吸取 10 μL 10 mM 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）储备液 990 μL 将 SSM（终浓度 EdU 为 0.1 mM）加入无菌微量离心管中并混匀。24 h 培养结束后，用移液器将 1 mL EdU SSM 加入无菌 12 孔培养板的某一孔中。</li>
	<li>使用带有无菌吸头的微量移液器，将脑组织从仅含SSM的孔转移至含有EdU SSM溶液的新孔中。37 °C下孵育1 h 25 °C.</li>
	<li>接下来，将EdU标记的脑组织转移到同一培养板中的另一个孔，该孔中含有1 mL固定液（4%多聚甲醛，参见 表3 20分钟（用于配方） 
	注意：多聚甲醛属于生物危害物质，必须妥善处理。</li>
	<li>固定后，使用移液器迅速将脑组织转移至72孔迷你托盘的孔中。每个孔可容纳10个脑组织及10-15 µL 液体（图4B）。将脑组织转移至迷你托盘后（每孔不超过10个脑组织），吸除固定液，并用溶液冲洗脑组织3次 10 µL 含0.1% Triton-X 100的1×PBT（磷酸盐缓冲液，pH 7.4） 
	注：冲洗是指使用移液器进行移液操作 10 µL 用1×PBT冲洗脑组织，移除液体，重复3次。</li>
	<li>接下来，将脑组织再次置于中，每次10分钟，共洗涤3次 10 µL 1× PBT。确保脑组织始终被液体覆盖。</li>
	<li>洗涤完成后，用移液器吸取 10 µL 加入封闭液（1× PBT 加 10% 正常山羊血清）至脑组织样本中。用封口膜沿托盘边缘密封，并盖上托盘盖。</li>
	<li>密封后，将迷你托盘放入一个带有湿毛巾的密封盒中，以提供湿润环境，防止蒸发。将装有托盘的盒子置于 4 °C 过夜。</li>
	<li>次日，配制一抗溶液。 
	注意：在本实验方案中，使用兔抗scribble抗体标记细胞膜，大鼠抗deadpan抗体标记神经母细胞，但也可使用其他多种一抗。
	<ol>
		<li>要配制一抗溶液，首先用封闭液对一抗进行稀释。例如，兔抗scribble抗体的终浓度为1:1000。因此，先将兔抗scribble抗体按1:100稀释（1 µL 抗体加 99 µL 封闭液）中，大鼠抗Deadpan抗体的终浓度为1:100。因此，首先将大鼠抗Deadpan抗体按1:10稀释1 µL 抗体加 9 µL 封闭液） 
		注意：这些稀释液可长期保存于 4 °C 如果同时添加叠氮化钠（0.05%）以抑制细菌生长。</li>
		<li>接下来，统计含有脑组织的孔数。孔的数量决定了所需配制的一抗溶液的体积。例如，如果有2个孔含有脑组织，则准备 20 µL 一抗溶液（适用于10个孔）， 100 µL等。要制作一个 20 µL 一抗溶液，加入 2 µL 每种一抗稀释度 16 µL 封闭液 
		注意：每种一抗的最终浓度分别为 1:1000 和 1:100。简而言之，配制一抗的初次稀释液时，其浓度应确保第二次稀释倍数始终为 1:10，从而达到相应的最终浓度。本实验中，兔抗 scribble 抗体的最终稀释倍数为 1:1000，大鼠抗 deadpan 抗体为 1:100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器吸取并移除封闭液 10 µL 并用移液器吸取 10 µL 每孔加入一抗溶液。</li>
	<li>用封口膜覆盖并密封托盘，然后将其放回装有湿毛巾的密封盒中。在指定温度下孵育过夜 4 °C. 
	注意：无需振荡，且强烈不建议振荡。抗体无需振荡或混匀即可渗透入脑组织。</li>
	<li>次日，使用微量移液器移除一抗溶液，并用缓冲液将脑组织冲洗 3 次 10 µL 1× PBT 中洗涤4次 10 µL 每次用1×PBT洗涤10分钟，共洗涤两次。在10分钟洗涤期间，配制二抗溶液。</li>
	<li>配制二抗溶液时，选择可识别一抗的二抗。本实验中使用了山羊抗兔Alexa Fluor 488和山羊抗大鼠Alexa 555。
	<ol>
		<li>移液器 1 µL 每种二抗分别加入微量离心管中 298 µL 加入封闭液，使每种二抗的终浓度为1:300。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次10分钟洗涤后，移除1x PBT并用移液器吸取 10 µL 加入二抗溶液至各孔中。用Parafilm封膜密封板，放回含湿毛巾的盒中。4℃孵育过夜。 4 °C. 
	注意：无需担心彻底清除所有残留 µL 在更换洗涤液、孵育一抗或二抗溶液的间隙期间，脑组织应始终完全浸没于少量液体中 µL 液体，这样即可。</li>
	<li>次日，使用微量移液器移除二抗溶液，并用缓冲液将脑组织冲洗3次 10 µL 每轮使用1× PBT缓冲液洗涤脑组织，共洗涤4次。 10 µL 每次用 1× PBT 洗涤 10 分钟，重复数次。</li>
	<li>在10分钟洗涤期间，配制EdU反应混合液以检测EdU掺入。按照生产商提供的说明书配制EdU反应混合液。</li>
	<li>最后一次洗涤后，吸除 1x PBT 并用移液器移取 10 µL 向每孔脑组织中加入 EdU 反应混合液。用封口膜密封微孔板，并用铝箔包裹。将微孔板置于实验台静置 30 分钟。</li>
	<li>孵育30分钟后，用缓冲液冲洗脑组织3次 10 µL 1× PBT 各一次，并用 PBT 清洗脑组织 3 次 10 µL 每次用1×PBT洗涤5分钟，重复若干次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，移除 1x PBT 并用移液器吸取 10 µL 基于甘油的封片剂溶液。密封培养板并置于 4 °C 过夜。</li>
</ol>
5. 脑组织的包埋与成像
<ol>
	<li>次日，准备显微镜载玻片（25 mm x 75 mm x 1 mm）：用胶水（例如瞬干胶）将一块 22 mm x 22 mm x 1 mm 的方形盖玻片粘在载玻片的每一端，形成一个“桥”，用于支撑更大的 22 mm x 50 mm x 1 mm 盖玻片，使其与载玻片之间留出一定空间（图 5A）。此空间可使脑组织有足够的活动余地以实现正确方向定位，同时防止其被压碎。</li>
</ol>
<img alt="脑部安装、显微镜示意图；前后方向定位、神经母细胞成像、细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：显示载玻片、组织方向及幼虫脑中细胞类型的示意图。（A）展示用于固定幼虫脑并准备成像的显微镜载玻片的可视化表示。（B）同时示出用于组织定向的参考线。（C）准备在共聚焦显微镜上成像的显微镜载玻片。（D）卡通图示出幼虫脑中部分细胞类型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>将 22 mm × 22 mm × 1 mm 的盖玻片用胶粘附至载玻片后，用移液器吸取含有一个脑组织的甘油基封片剂溶液 9.3 µL（来自微孔板中的一个孔），将其置于载玻片中央（图 5A）。 
	注意：幼虫脑组织可能黏附于移液器吸头，操作时需小心。为避免黏附，可先吸取抗荧光淬灭剂，再在 9.3 µL 体积的末段吸取单个脑组织。</li>
	<li>脑组织置于载玻片上后，轻柔地将 22 mm × 50 mm × 1 mm 的盖玻片覆盖其上。参照 图 5B 所示位置摆放脑组织，并轻轻移动盖玻片以调整脑组织方向。样品即可用于成像。</li>
	<li>使用配备高倍率、高数值孔径物镜的共聚焦显微镜（图 5C）以获取最佳图像。例如：60× 或 63×，1.4 NA 的油浸物镜。
	<ol>
		<li>成像时使脑组织的背侧表面靠近盖玻片（及物镜）。从腹侧表面（距离物镜最远）开始，以 1 µm 为间隔（Z 步长）采集贯穿整个脑半球的 Z 轴层扫图像。 
		注意：所用激光器取决于二抗。本方案中使用的激光波长分别为 488 nm 检测 Scribble 染色，555 nm 检测 Deadpan，633 nm 检测 EdU。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用 Fiji 开源软件分析大脑半球，并使用 Fiji 细胞计数插件进行细胞计数。</li>
</ol>

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
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<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

作者无竞争利益。

本文所述的脑组织外植体培养方法可在大多数实验室环境中进行。所需工具、操作步骤及数据收集过程均简单直接。利用该方法，可检验多种假设，包括与调控神经前体细胞（NB）重新激活和增殖相关的细胞信号级联反应及外源性因素有关的假设。在此，我们使用野生型OregonR动物发现，外源性胰岛素足以独立于其他个体特异性系统信号，重新激活处于静息状态的神经前体细胞。通过GAL4/UAS系统，还可实现细胞类型特异性的胰岛素通路组分的敲低或过表达，以更深入地理解PI3-激酶信号在神经前体细胞重新激活中的作用。除了遗传学手段外，还可通过调整培养基成分，进一步检验促进神经前体细胞重新激活和增殖的外源性信号或因子。例如，可验证添加类固醇激素蜕皮酮是否能够提高培养中神经前体细胞重新激活和增殖的比例。
尽管该方法较为直接，但我们早期遇到了一些技术难题。第一个技术难题是在更换培养基过程中对已解剖但未固定的脑组织造成的损伤。我们发现，与直接在孔内更换培养基相比，将脑组织转移至培养板的新孔中可减少组织损伤，因为当从孔中移除培养基时，脑组织会贴附在孔底，导致脑组织出现孔洞。为解决此问题，我们采用移液器将脑组织在液体中进行转移...

干细胞因其在再生医学中的潜在应用而备受关注1,2。许多动物，尤其是长寿物种，会在成体组织中维持干细胞的存在。这些定居的干细胞具有维持组织稳态的功能，并在机体受到物理损伤或疾病侵袭后参与组织修复3,4。成年动物体内的大多数干细胞处于静息状态，这是一种相对静止的状态，其特征是细胞周期停滞以及生长信号通路的失活5。当接收到外界信号刺激时，干细胞会退出静息状态，进入细胞周期，并开始产生具有特定组织谱系的子代细胞。例如，为了启动有效的免疫应答，抗原呈递细胞可诱导静息的初始T细胞进入细胞周期并发生克隆扩增6。当骨骼肌受到损伤时，肌肉卫星干细胞会进入细胞周期，生成子代成肌细胞以替代受损的肌原纤维5,7。尽管已明确静息干细胞能够响应外界信号，但在许多情况下，这些外界刺激因子的具体性质及其诱导干细胞活化的机制仍不清楚。深入理解静息干细胞如何响应外界信号并进入细胞周期，将有助于推动临床干细胞治疗的发展，并增进相关科学认知。
几十年来，模式生物一直被用于揭示调控发育过程及成体阶段干细胞增殖的基因和细胞信号通路。在Drosophila中，神经干细胞（NSCs）被称为神经母细胞（NBs），在发育过程中持续分裂，产生所有最终整合形成脑功能所需神经环路的神经元和胶质细胞8,9。与其他干细胞类似，NBs通过不对称分裂实现自我更新，在某些情况下也通过对称分裂扩大干细胞池。NBs在胚胎发生过程中被确定，大多数在胚胎发育末期进入静止状态，这一时期与母源营养物质储备的减少相一致（图1）。胚胎发生完成后，幼虫孵化并开始摄食。随着动物进食，NBs从静止状态重新激活并恢复细胞分裂10,11,12,13,14,15,16。由于Drosophila中枢神经系统相对简单，且NBs在特定时间点进入和退出静止状态，因此利用Drosophila研究静止状态的调控机制（包括进入与退出过程）尤为理想。
<img alt="果蝇神经母细胞增殖示意图；MBNB、CBNB 活性；发育阶段，摄食影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：中央脑神经母细胞（CB NBs，红色）与蘑菇体神经母细胞（MB NBs，蓝色）在发育过程中的相对增殖情况。 胚胎发育结束时，大多数神经母细胞（红线）停止增殖并进入静息状态。静息状态持续至新孵化的幼虫摄取首次完整食物后才被打破。本方法重点关注的时间点以红圈标出（1，静息状态；2，重新激活）。MB NBs（蓝色）是中央脑神经母细胞的一个亚群，在整个发育过程中持续分裂（每脑半球4个）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
动物摄食后，神经母细胞（NBs）及其胶质和气管微环境中的PI3-激酶和TOR生长信号通路被激活10,11,15,16。当撤除饮食营养或PI3-激酶水平降低时，NBs无法重新激活，胶质细胞和气管的生长也相应减弱10,11,15,16。目前的模型认为，脂肪体将NB的重新激活与幼虫生长相偶联，在动物摄食后释放一种全身性信号12,17,18。该信号的具体性质尚不明确，但可能促进脑中黑腹果蝇胰岛素样肽（Drosophila insulin-like peptide, Dilps）的表达与释放，从而在NB及其胶质和气管微环境中下游激活PI3-激酶。为了更深入理解这种全身性信号分子的本质，我们建立了一种在离体培养的脑组织外植体中重新激活静息NB的方法。利用该方法，可在去除整体动物系统性信号的情况下检测NB的重新激活。外源性因子可被重新添加至培养基中，并通过胸腺嘧啶类似物EdU的掺入情况来评估NB的重新激活。通过该方法，我们确定外源性胰岛素足以在脑外植体中重新激活静息的NB。后续研究将致力于鉴定其他可调控脑外植体中NB静息状态的因子，这些因子在回补时可能起正向或负向调节作用。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;micro;L 吸头</td><td>德文特科学公司</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 吸头</td><td>德内维尔科学</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L加样器</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛（10 × 10 mL）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>2912.60.0000</td><td>用于幼虫脑组织的固定</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 移液管</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>丹维尔科学</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24孔多孔培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>葡萄培养皿成分</td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C型冰箱</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>为……提供理想的温度 &gt;抗体溶液中孵育 24 小时</td></tr><tr><td>63倍物镜</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活性干酵母</td><td>大多数超市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>葡萄培养皿成分</td></tr><tr><td>Click-iT EdU细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 647染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10340</td><td>标记增殖细胞</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>22 mm × 22 mm × 1 mm 盖玻片，每包10片，4盎司包装</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>在显微镜载玻片的两端用瞬间胶粘上两张盖玻片。这可形成一个空间，使脑组织在成像时能够悬浮于抗荧光淬灭剂中。</td></tr><tr><td>盖玻片，22 mm × 50 mm × 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>将盖玻片置于载玻片上的两个方形盖玻片之间，确保成像过程中抗荧光淬灭剂中的脑组织不会移动。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>蔡司</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 proof（100%），Decon Labs，1 加仑瓶装</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>用于在将幼虫转入培养基中培养24小时之前清洗幼虫</td></tr><tr><td>胎牛血清（10%）</td><td>Sigma</td><td>F4135-100ML</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>用于解剖的精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>用于解剖的镊子。锋利时使用效果最佳。</td></tr><tr><td>用于杂交的果蝇培养瓶</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td><td>该瓶子用作容器，使果蝇可在葡萄培养基平板上产卵。</td></tr><tr><td>玻璃解剖皿（3孔）</td><td>这些已不再提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>在细胞培养过程中提供氧化保护。</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td>封闭剂</td></tr><tr><td>葡萄培养皿</td><td>自制</td><td>自制</td><td>用于收集新孵化卵的葡萄汁/琼脂糖平板</td></tr><tr><td>Image J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>免费下载：&amp;nbsp; https://fiji.sc</td><td>用于细胞计数和EdU再激活成像的平台</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>确保实验过程中温度、湿度和光照条件完全一致。</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>实验的自变量</td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td>用于分装培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>在细胞培养过程中提供支撑</td></tr><tr><td>Nunc 72孔微型培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>在此托盘中进行免疫染色步骤</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>用于密封培养板以防止蒸发的封板膜</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>用于防止细胞培养过程中细菌污染的抗生素。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>自制</td><td>自制</td><td>固定和染色步骤后用于清洗脑组织的溶剂</td></tr><tr><td>挑选</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td>用于从葡萄培养基上挑取幼虫</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-258</td><td>葡萄培养皿成分</td></tr><tr><td>兔子 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>用于免疫染色的抗体</td></tr><tr><td>大鼠 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>用于免疫染色的抗体</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>来自 Chris Doe 的礼物</td><td></td><td>用于免疫染色的抗体</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>用于免疫染色的抗体</td></tr><tr><td>施耐德氏培养基</td><td>Life Tech</td><td>21720024</td><td>含有促进细胞生长和增殖的营养成分</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂（5 × 2 mL）</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>防止荧光淬灭的试剂</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>高压灭菌自制 Milli-Q 水</td><td></td><td>溶液配制所需材料</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S2-12</td><td>葡萄培养皿成分</td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>大多数超市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>葡萄培养皿成分</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>Welch's 100% 葡萄汁</td><td>大多数超市</td><td></td><td>葡萄培养皿成分</td></tr></tbody></table>

培养条件下神经干细胞的再激活 果蝇 脑组织外植体

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

神经干细胞（NSCs）具有增殖、分化、凋亡以及进入和退出静息状态的能力。这些过程中的许多均由神经干细胞内在的遗传程序与局部及全身性的外在因素之间复杂的相互作用所调控。在遗传模式生物中， 黑腹果蝇，神经干细胞（NSCs），即神经母细胞（NBs），在胚胎向幼虫转变期间由静息状态转为增殖状态。在此期间，幼虫从卵壳中孵化并开始爬行，寻找食物营养。响应动物摄食，脂肪体——一种具有脂质储存能力的内分泌器官——产生信号并将其系统性释放到循环的血淋巴中。在脂肪体来源信号（FBDS）的刺激下， 果蝇 胰岛素样肽（Dilps）由脑部神经分泌性神经元和胶质细胞产生并释放，从而在神经母细胞（NBs）及其胶质和气管微环境中激活下游的PI3-激酶生长信号通路。尽管这是目前关于NBs从静息状态转换为增殖状态的主流模型，但前脑背侧结构（FBDS）来源的外在信号因子的本质仍不明确。为了更深入地理解外在系统性信号如何调控NBs退出静息状态，研究人员建立了一种在动物进食前体外培养早期幼虫脑组织的方法。利用该方法，可向培养基中添加外源性因子，并检测NBs退出静息状态的情况。我们发现，外源性胰岛素足以在全脑外植体中重新激活处于静息状态的NBs。由于该方法适用于大规模筛选，我们的目标是鉴定更多调控NBs静息与增殖决策的外在信号因子。鉴于调控神经干细胞（NSC）增殖决策的基因和通路在进化上高度保守，本实验的结果可能为临床再生治疗策略的优化提供重要启示。

将新孵化的OregonR野生型果蝇大脑解剖后，在含胰岛素的补充型Schneider培养基（SSM）中培养24小时。按照实验方案对组织进行固定和染色，使用抗Deadpan（Dpn）的一抗标记神经母细胞（NBs），抗Scribble的一抗标记细胞膜。加入胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（Edu）以检测S期进入及神经母细胞的再激活。培养24小时后，我们观察到大量Edu阳性且Dpn阳性的大尺寸神经母细胞（图6A-C）。随后，将新孵化的OregonR野生型果蝇大脑在不含胰岛素的补充型Schneider培养基中培养24小时。培养24小时后，除4个蘑菇体神经母细胞和1个腹外侧神经母细胞外，未观察到其他大尺寸的Edu阳性且Dpn阳性的神经母细胞（图6D-F）。蘑菇体和腹外侧神经母细胞是中枢脑神经母细胞的一个亚群，在胚胎至幼虫转变期间持续分裂。我们得出结论：在Schneider培养基中培养...

已建立一种在培养的黑腹果蝇（Drosophila）脑外植体中重新激活静息态神经干细胞的方法。利用该方法，可在调控神经干细胞静息、进入及退出过程中，将系统性信号与组织内在信号分离开来。

神经干细胞（NSCs）具有增殖、分化、凋亡以及进入和退出静息状态的能力。这些过程中的许多……

我们开发了一种在培养的果蝇脑外植体中重新激活静息态神经干细胞的方法。该方法可向培养基中添加外源性因子，并检测神经母细胞的再激活。通过更深入地理解静息态干细胞如何响应外界信号并进入细胞周期，有望开发出更有效的干细胞疗法。演示该实验步骤的是来自我实验室的研究科学家 Susan Doyle。首先，在解剖显微镜下小心地从葡萄琼脂平板上挑选约 20 至 25 只新孵化的幼虫。取一个培养皿，加入约 2 毫升 PBS，并将带有幼虫的工具尖端浸入 PBS 中 2 分钟。两分钟后，将培养皿倾斜，使液体汇集于底部，用小号画笔将幼虫从液体中刷至培养皿底部。用画笔收集所有幼虫，并在70%乙醇中短暂冲洗，然后将其转移回含有PBS的培养皿中。用70%乙醇喷洒操作区域、解剖工具、镊子以及两个玻璃培养皿，随后置于实验台上晾干。制备添加补充物的Schneider培养基（SSM），并将其置于冰上。将一毫升培养基移液至每个玻璃培养皿中。使用带有无菌吸头的微量移液器，将新孵化的幼虫从PBS培养皿转移至第一个玻璃培养皿中的SSM中。在解剖显微镜下，使用镊子从第二个玻璃培养皿中的幼虫体内解剖出脑组织，根据需要调整放大倍数，并用 SSM 浸润。用一把镊子夹住口钩，另一把镊子在幼虫体节中段轻轻夹住，向相反方向拉动，将幼虫分成两部分。每解剖 15 至 20 个脑组织后，向无菌 24 孔细胞培养板的一个孔中加入 1 毫升 SSM。使用微量移液器和无菌吸头，将 freshly dissected 脑组织转移至 SSM 中，随后在 25 摄氏度下孵育 24 小时。取 10 微升浓度为 10 毫摩尔的 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EDU）储备液，加入 990 微升 SSM，于无菌微量离心管中混匀，然后将 1 毫升 EDU SSM 溶液加入无菌 12 孔培养板的某一孔中。使用带无菌吸头的微量移液器，将脑组织从含有 SSM 的孔转移至含有 EDU SSM 溶液的新孔中，并在 25 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，将标记了EDU的大脑转移到同一培养板中的另一个孔中，加入一毫升固定液，使大脑固定20分钟。固定后，用微量移液器迅速将大脑转移至72孔小培养板的孔中。用10微升PBT对大脑清洗三次，并重复三次洗涤，每次10分钟，确保大脑始终被液体覆盖。用移液器将10微升封闭液滴加到脑组织上。盖上培养皿，并用封口膜沿边缘密封。该图显示了在含胰岛素的SSM培养基中培养24小时后，经染色检测到的大尺寸EDU阳性及Deadpan阳性神经母细胞。在无胰岛素的补充型Schneider培养基中培养24小时后，新孵化的Oregon R野生型大脑中除了四个蘑菇体神经母细胞和一个腹外侧神经母细胞外，未发现其他大尺寸的EDU阳性且Deadpan阳性的神经母细胞。在共聚焦成像过程中，偶尔会观察到一些脑半球存在损伤，例如脑组织外植体中出现小至大范围的孔洞。所有带有孔洞的大脑均未用于后续分析。小心解剖组织，并轻柔地使用移液器，以避免任何组织损伤。同时应尽可能保持无菌操作，防止污染培养物。由于可通过添加不同因子来轻松调控培养基成分，该技术可用于探究有关外源性信号与神经母细胞静息期进入和退出机制的未来假说。

neural-stem-cell-reactivation-in-cultured-drosophila-brain-explants

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科研

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神经科学

培养的 果蝇 脑外植体中的神经干细胞再激活

本视频展示了如何从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物。活体培养物的图像显示了神经突的生长，以及使用Fura-2对钙离子水平进行成像。...

晚期果蝇蛹脑中的原代神经元培养

本视频展示了从中肠胚期果蝇胚胎制备原代神经元培养物的方法。活细胞培养物的图像显示了接种后1小时的细胞状态，以及在碳酸氢盐为基础的限定培养基中生长2天后的分化神经元。这些神经元具有电兴奋性，并能形成突触连接。...

中肠胚期果蝇胚胎神经元培养物的制备

本文介绍了一种可模拟的方法 体内 发育 果蝇 蕈体在其中 离体...

ex vivo 培养完整发育中的Drosophila 大脑

本视频演示了一种鉴定外源因子启动果蝇（Drosophila）脑神经干细胞从静息状态重新活化的实验方案。通过解剖刚孵化的幼虫以分离其大脑组织，随后将脑组织置于含有或不含待测激素的培养基中进行培养，以评估该激素是否具有诱导神经干细胞重新活化和增殖的潜力。...

分析培养的果蝇脑外植体中神经干细胞的再激活

本文描述了一种利用果蝇幼虫腹神经索的损伤模型，用于研究中枢神经系统（CNS）的再生与修复。通过穿刺损伤，结合活体及固定样本的时间序列激光共聚焦显微镜成像，并利用专门开发的软件与遗传学工具进行定量分析，以探究中枢神经系统再生与修复的分子机制。...

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

本实验方案的目的是建立 离体果蝇...

单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

在此，我们介绍一种使用 黑腹果蝇 感觉神经元 - 树突分支（da）神经元损伤模型，该模型结合了 体内 活体成像、双光子激光轴突/树突切割技术，以及强大的果蝇遗传工具箱,...

一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila In Vivo 损伤模型

本文提供了对成年果蝇（Drosophila）造成穿透性创伤性脑损伤（PTBI）并检测由此引发的神经发生的详细实验方案。...

刺激与分析成年神经发生 果蝇 中枢脑

本文介绍了一种用于制备、解剖、封片和成像活体离体黑腹果蝇（Drosophila...

活细胞成像 黑腹果蝇 三龄幼虫大脑

学习利用培养果蝇脑外植体技术重新激活静止神经干细胞的方法，通过添加外源因子和EDU标记分析神经母细胞再激活过程。该技术为研究干细胞静止与激活机制提供了可靠的实验平台。

培养条件下神经干细胞的再激活果蝇脑组织外植体

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