利用瞬时表达系统在哺乳动物细胞中高效且可扩展地生产全长人源亨廷顿蛋白变体

本方案旨在低毫克规模下生产全长亨廷顿蛋白变体，可为亨廷顿病（HD）研究人员提供稳定、高质量的蛋白质。本实验操作由Curia实验室的研究科学家Michael Harris进行示范。

首先，将1克聚乙烯亚胺25 K加入1升无内毒素水中，充分搅拌。使用100毫摩尔盐酸将pH值调节至2.0，并持续搅拌直至聚乙烯亚胺完全溶解。然后使用100毫摩尔氢氧化钠溶液将pH值调节至7.0，并将溶液通过0.2微米滤膜过滤。

将过滤后的溶液分装，并于-20摄氏度保存。在37摄氏度、90转/分钟、5%二氧化碳的湿润摇床培养箱中，使用添加青霉素-链霉素的生长培养基培养HEK293细胞，培养18至24小时。转染前一天，将细胞以约1.2 × 10⁶个细胞/毫升的密度稀释于5升锥形瓶中的2升生长培养基中，继续培养18至24小时。

孵育结束后，按照制造商的说明，使用自动细胞计数仪测定细胞密度和活力。计算转染所需的聚乙烯亚胺和质粒用量后，分别将聚乙烯亚胺和质粒稀释于 100 毫升 PBS 中，并在室温下孵育 5 分钟。然后，通过轻轻涡旋混合稀释后的质粒和聚乙烯亚胺，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。

将混合物加入细胞培养物中，轻轻旋转混匀。然后，让细胞培养生长24小时。次日，向培养物中加入丁酸钠溶液，使其终浓度为2毫摩尔，并按1:1,000的体积比加入抗团聚和抗泡沫试剂，随后将细胞置于加湿的摇床培养箱中孵育48小时。

在测定细胞活力和密度后，以 2,000 G 离心 30 分钟收集细胞，并在纯化前将细胞沉淀于 -80 摄氏度保存。使用 FPLC 进行抗 FLAG 纯化时，将 12 至 25 毫升抗 FLAG 树脂以每分钟 4 毫升的流速用缓冲液 A 装入空柱中，并调节压杆高度，以消除压杆末端与树脂床之间的空隙。接着，将解冻的细胞沉淀悬浮于预冷的裂解缓冲液中，并在 1,000 psi 压力下，将细胞悬液通过高剪切均质器匀浆一次。

使用配备兼容固定角转子的离心机，在 20,000 G 条件下离心澄清裂解液一小时。在 FPLC 的“方法”窗口中进行程序设置，通过样品泵上样澄清后的裂解液，并按照文本稿件中的描述，用指定柱体积的缓冲液 A、B、C、D 及洗脱缓冲液洗涤层析柱。运行结束后，取 10 微升峰馏分，采用 SDS-PAGE 进行分析。

合并具有理想纯度的峰组分，并保留约 50 微升合并的洗脱液用于后续 SDS-PAGE 分析。使用 FPLC 开始平衡 SEC 柱，并通过 50 毫升超大进样环加载抗 FLAG 洗脱液。运行 SEC 缓冲液后，于 4°C 下过夜进行 SEC 分离。

将洗脱图谱与标准的HTT洗脱图谱进行比较，以区分单体、二聚体以及更高阶的寡聚体峰。根据凝胶过滤层析柱的洗脱图谱，合并单体HTT组分；如需要，可分别合并更高阶的寡聚体和二聚体HTT组分。使用100千道尔顿的离心浓缩器在4°C条件下浓缩合并后的HTT蛋白。

计算蛋白质浓度后，将少于100微升的纯化HTT蛋白分装至耐冷冻的微量离心管中。使用液氮速冻分装样品，并于-80摄氏度保存。所有分析型SEC-MALS实验均需在4摄氏度下进行，使用配备紫外检测器、多角度光散射检测器和差示折射率检测器的HPLC系统，并采用0.185作为HTT的折射率增量值。

使用经过滤的高效液相色谱级水冲洗泵和检测器，并将超高效液相色谱柱连接至系统。先用经过滤的水平衡色谱柱，再用SEC-MALS缓冲液平衡，直至所有检测器信号达到基线。以每分钟0.3毫升的流速，每次进样15分钟，注入2微升的BSA溶液。

检查数据质量，基于 BSA 谱图进行归一化、峰对齐和峰展宽校正，并为后续的 HTT 样本运行创建模板。使用浮筒在室温水浴中快速解冻一支 FL Q23-HTT 样本。使用 0.1 微米旋转滤器过滤 HTT。

注入 2 至 4 微升 HTT 样品，在 4 摄氏度下以每分钟 0.3 毫升的流速运行 15 分钟。使用配套软件分析色谱和光散射数据，并生成 Zimm 图以确定每个峰的重均分子质量。在本研究中，采用两步柱纯化方法，HTT 的纯度超过 95%，主要污染物为分子伴侣 Hsp70，该污染物在抗 FLAG 亲和纯化步骤中通过氯化镁和 ATP 的充分洗涤被去除。全长 HTT 的过表达可能导致蛋白质断裂，但本方法制备的 FL Q23-HTT 在电泳中呈现单一条带，其分子量为 350 千道尔顿，表明未发生断裂。

抗体与FL Q23-HTT反应后的Western印迹分析表明，该蛋白被成功分离且无明显可检测的截短片段，因为未观察到任何与额外片段相关的条带。全长HTT多聚谷氨酰胺（poly-Q）长度变异体Q23、Q48和Q73在Western印迹中表现出预期的反应结果，针对多聚谷氨酰胺的单克隆抗体MW1信号强度随Q长度增加而逐渐增强。在所测试的HPLC色谱柱中，SEC色谱柱在HTT单体与二聚体之间表现出足够的分辨能力，能够区分其摩尔质量。

SEC纯化的全长HTT在凝胶电泳中显示出对应于不同寡聚状态的多条条带，这可能是由于存在多个疏水区域，这些区域在凝胶迁移过程中促进了高阶寡聚体的形成。纯化的HTT在蓝色天然PAGE上显示出三条主要条带，其估计分子量分别为643、927和1,070千道尔顿，可能分别代表HTT的单体、二聚体和三聚体形式。正确处理纯化的亨廷顿蛋白对于避免可溶性聚集体中高阶寡聚体的产生至关重要。

最终使用者必须迅速操作，将样品分装至预冷的离心管中，然后立即进行速冻。长期稳定性测试可在样品于零下80摄氏度长期储存后进行。重复进行高效液相色谱-尺寸排阻色谱-多角度激光散射（HPLC SEC-MALS）分析，可确认样品的单体含量是否发生变化。