Name: 使用瞬时表达系统高效、可扩展地生产哺乳动物细胞中的全长人类亨廷顿蛋白变异 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解在HEK293细胞中利用瞬时表达系统高效生产全长亨廷顿蛋白变异的方法。该方案通过抗FLAG亲和层析和SEC-MALS技术实现超过95%的纯度，为亨廷顿病研究提供高质量蛋白。

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我们感谢纽约州立大学布法罗分校药学与药理科学系对HTT进行的质谱分析。本工作是与CHDI基金会合作完成的。我们特别感谢CHDI基金会的Elizabeth M. Doherty、Ignacio Munoz-Sanjuan、Douglas Macdonald以及Curia的Rory Curtis，在本论文撰写过程中提供的宝贵意见。我们还感谢Michele Luche、Mithra Mahmoudi和Stephanie Fox对本研究工作的支持。

1. 设计与构建用于 FLAG 标签 HTT 哺乳动物表达的载体
<ol>
	<li>从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取全长人源HTT蛋白序列（P42858）。 
	注意：研究人员在设计HTT突变体构建体时，需熟悉HTT的结构域组成，并维持HTT核心的三维结构。</li>
	<li>根据P42858序列，申请基因合成服务，对序列进行人源细胞表达的密码子优化。将多聚谷氨酰胺（polyQ）长度从Q16更改为所需长度（本研究中首个构建体选择Q23），并合成全长HTT基因。 
	注意：本研究中，经密码子优化的全长Q23-HTT构建体以插入片段形式构建于pUC18质粒中递送。</li>
	<li>可选步骤：在构建体中添加便于克隆不同Q长度及蛋白纯化的功能元件。 
	&#8203;注意：在构建体的C末端添加了烟草蚀刻病毒（tobacco etch virus, TEV）蛋白酶切割位点和FLAG纯化标签（AAAENLYFQGDYKDDDDK）。在构建体中设计了两个HindIII酶切位点，以包围polyQ区域（引入HindIII位点不改变翻译后的蛋白序列）。该设计使研究人员可通过限制性内切酶消化与连接反应更换HTT的Q长度，而无需重新合成全长HTT基因。</li>
</ol>
2. 将合成的 HTT 结构克隆至 pcDNA3.1 中。
<ol>
	<li>在 37 °C 下，使用 NheI 和 PmeI 各 2 µL，对 5 µg pUC18-Q23-HTT 和 5 µg pcDNA3.1 进行 2 小时的酶切消化。</li>
	<li>运行 0.5% w/v 琼脂糖凝胶，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化 Q23-HTT 片段和酶切后的 pcDNA3.1 载体。使用可测量微量样品的紫外分光光度计通过 OD280 测定纯化 DNA 的浓度。 
	注意：通常测得 OD260/280 比值在 1.8 至 2.0 之间。合成的全长 HTT 以插入片段形式提供，两端带有 NheI 和 PmeI 位点，克隆于 pUC18 质粒中。若 HTT 的合成方式不同，应选用其他限制性内切酶。</li>
	<li>在连接反应中使用 10 ng 酶切后的 pcDNA3.1 载体。按照 HTT 与 pcDNA3.1 的 1:1 摩尔比，在 10 µL 反应体系中，于室温下使用 T4 DNA 连接酶反应 5 分钟，连接纯化的 DNA 片段。</li>
	<li>按照连接酶生产商提供的操作说明，将连接产物转化至感受态 E. coli 细胞（参见材料表）。</li>
	<li>挑取 6 个单克隆菌落，在 37 °C 下，于含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 4–6 mL LB 培养基中过夜培养。</li>
	<li>从每份过夜培养物中取出 1 mL，加入甘油至终浓度为 25% v/v，将甘油保存液存于 -80 °C。其余培养物使用质粒小提试剂盒，按照说明书步骤进行质粒纯化。</li>
	<li>使用跨越质粒转录区域的测序引物对所有质粒进行测序。选择测序结果正确的甘油保存液作为主甘油保存液，其余弃去。</li>
	<li>可选：可委托基因合成服务，合成包含不同 Q 长度（Q48、Q73 和 Exon1）的 DNA 片段，该片段位于 pcDNA3.1-Q23-HTT 质粒的两个 HindIII 位点之间。使用 HindIII 酶切 pcDNA3.1-Q23-HTT 和新合成的 DNA，然后如步骤 2.2–2.7 所述，使用 T4 连接酶重新连接，构建含有不同 polyQ 长度的全长 HTT 的 pcDNA3.1 质粒。 
	注意：本研究所用的质粒构建体也可直接从科里尔研究所亨廷顿病社区资源库（www.coriell.org/1/CHDI）获取；参见&#160;材料表。</li>
</ol>
3. 大规模转染用无内毒素质粒DNA的GIGA制备
<ol>
	<li>将含有 pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG 的细菌甘油菌种划线接种于含羧苄青霉素（100 µg/mL）的 LB 琼脂平板上。在 37 °C 培养 16–24 小时，直至出现单菌落。</li>
	<li>挑取单菌落，接种至 5 mL 含羧苄青霉素（100 µg/mL）的质粒扩增专用富集培养基中，于 37 °C 培养 8 小时。</li>
	<li>选用无内毒素的 GIGA 质粒提取试剂盒，按照该质粒 GIGA 试剂盒说明书中的步骤纯化 pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG 质粒。</li>
	<li>使用基于鲎试剂（limulus amoebocyte lysate, LAL）的内毒素定量检测试剂盒测定质粒的内毒素水平，并依照试剂盒制造商提供的操作说明进行检测。 
	&#8203;注意：高质量、低内毒素水平的质粒提取对于获得良好的转染效率至关重要。采用本方案，每升细菌培养物可获得 20–40 mg 质粒（超螺旋形式&#62;80%），质粒浓度&#62; 4 mg/mL。正确纯化的质粒其内毒素含量应&#60; 30 EU/mg。OD260/280 比值通常在 1.8 至 2.0 之间。</li>
</ol>
4. 使用聚乙烯亚胺（PEI）对2 L HEK293细胞进行大规模转染
<ol>
	<li>将1 g PEI 25K加入1 L无内毒素水中，搅拌。使用100 mM HCl调节pH至2.0，并持续搅拌直至PEI 25K完全溶解。再用100 mM NaOH溶液调节pH至7.0，并通过0.2 µm滤膜过滤。分装后于-20 °C保存，可保存长达一年。 
	注意：PEI分装样品可在4 °C保存最多两周，但解冻后切勿再次冷冻。</li>
	<li>在加有青霉素-链霉素（青霉素终浓度为5 U/mL，链霉素为5 µg/mL）的生长培养基（见材料表）中，于37 °C、90 rpm、5% CO2的加湿摇床培养箱中培养HEK293细胞18–24小时。转染前一天，用5 L锥形瓶中的生长培养基将细胞稀释至2 L，细胞密度约为1.2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>继续在37 °C、90 rpm、5% CO2条件下培养18–24小时。使用可自动测量细胞密度和活率的细胞计数仪，按照用户手册操作测定细胞参数。 
	注意：细胞密度应翻倍，活率应&#62;95%。转染前细胞密度应约为2.0 × 106–2.4 × 106 个细胞/mL。必要时，在转染前将细胞稀释至所需密度。</li>
	<li>计算转染所需的质粒和PEI用量；每升细胞培养物使用1 mg质粒和3 mg PEI。对于2 L转染，分配所需的2 mg质粒和6 mg PEI。</li>
	<li>将质粒和PEI分别用磷酸盐缓冲液稀释，稀释体积为细胞培养总体积的1/20th（对于2 L转染，各为100 mL），室温孵育5分钟。轻轻旋转混匀稀释后的质粒与PEI溶液，室温孵育30分钟。 
	注意：孵育后混合物会略显浑浊。</li>
	<li>将混合物加入细胞培养物中，轻轻旋转混匀。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2、90 rpm条件下继续培养24小时。</li>
	<li>加入2 M丁酸钠溶液，使其终浓度为2 mM。向培养物中加入1:1000（v/v）防结块剂和1:1000（v/v）消泡剂。</li>
	<li>将锥形瓶转移至32 °C、90 rpm、5% CO2的加湿摇床培养箱中，继续培养48小时。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪，按照用户手册操作，测定细胞密度和活率等细胞参数。</li>
	<li>取2.0 × 106个细胞（体积 = 2.0 × 106/细胞密度）转移至微量离心管中。在离心机中以2,000 × g离心1分钟，收集细胞沉淀，用于第5节的Western blot分析。</li>
	<li>以2,000 × g离心30分钟收集细胞，将细胞沉淀于-80 °C保存，用于后续纯化。</li>
</ol>
5. 通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析 HEK293 细胞裂解液以评估 HTT 表达水平
<ol>
	<li>取2.0 × 10的等分试样6 来自大规模转染HEK293细胞培养物的先前冻存细胞（步骤4.11）。加入250 µL含50 µg/mL皂苷、5 mM EDTA和1×蛋白酶抑制剂混合物的Tris缓冲盐水（TBS），用移液器反复吹打数次以重悬细胞沉淀。</li>
	<li>轻轻旋转试管，在 4 °C 下孵育 30 分钟，使用小型旋转仪裂解细胞。在 17,000 × g 5 分钟。</li>
	<li>加入1/3rd 向 supernatant 中加入 4x 还原性十二烷基硫酸锂（LDS）上样缓冲液，70 °C 加热 10 分钟。</li>
	<li>将5-20 µL细胞裂解液上样至预制的3-8% Tris-乙酸盐PAGE胶。使用与凝胶兼容的1x Tris-乙酸盐SDS电泳缓冲液，在150 V恒定电压下电泳60分钟。 
	注意：本研究对全长HTT的分析采用Tris-乙酸SDS-PAGE，因为对于分子量超过300 kDa的蛋白质，该方法比其他类型的SDS-PAGE具有更高的分辨率。本研究中所用蛋白质亦可直接从科里尔研究所亨廷顿病社区资源库（www.coriell.org/1/CHDI）获取；详见&#160;材料表.</li>
	<li>进行蛋白质印迹实验时，使用经转移缓冲液平衡的厚型转印滤纸、经甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜以及SDS-PAGE凝胶组装转印夹心结构。根据制造商使用说明书，利用半干式蛋白质印迹仪将蛋白质转移至PVDF膜上。 
	注意：对于 10 cm × 10 cm 的膜，通常在 135 mA 条件下电泳 20–30 分钟即可。</li>
	<li>拆解转印夹心结构，将膜置于含5%（w/v）脱脂奶粉的TBST（20 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、0.1%（v/v）Tween-20）中封闭。</li>
	<li>在室温下，将膜置于摇床上，用15 mL一抗溶液孵育1小时（抗FLAG单克隆抗体按1:2,500稀释，其余一抗均按1:2,000稀释）。 
	注意：本研究中使用的一抗包括抗-FLAG M2、MAB5492、MAB5490、MAB2166、MAB3E10、MAB4E10、MAB2168、MAB8A4（参见 材料表).</li>
	<li>用 30–50 mL TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在含有5% w/v脱脂奶粉的15 mL TBST中，加入1:15,000稀释的荧光染料标记的山羊抗小鼠IgG二抗，将膜置于摇床上室温孵育。</li>
	<li>使用与二抗相匹配的激发波长，在荧光成像仪上观察 Western 印迹条带。根据成像仪配套软件的用户手册，使用该软件对条带信号进行定量分析。 
	&#8203;注意：可使用纯化的 HTT 作为标准品进行定量 Western 印迹分析。HTT 的线性标准曲线范围因仪器而异，本实验室使用抗 FLAG 抗体建立的标准曲线范围为每泳道 25 ng 至 250 ng HTT。HTT 的 Western 印迹应无降解条带，通常观察到的总 HTT 表达水平为每细胞 2–4 pg。请参考先前发表的实验方案32 有关如何进行定量 Western 印迹的详细信息。</li>
</ol>
6. 使用抗FLAG柱和SEC对HTT进行快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化
<ol>
	<li>抗FLAG纯化
	<ol>
		<li>估算纯化所需的FLAG树脂量（通常，每纯化2-4 L转染细胞培养物需使用12 mL抗FLAG M2亲和树脂）。使用FPLC系统，以缓冲液A（见材料表）在4 mL/min流速下将12-25 mL抗FLAG树脂装填至空柱中（见材料表）。调节活塞高度，确保活塞末端与树脂床之间无间隙。</li>
		<li>按照每1 g细胞沉淀使用10 mL裂解缓冲液的比例，将细胞沉淀在预冷的裂解缓冲液（见材料表）中解冻并重悬。</li>
		<li>将细胞悬液以10,000 psi压力通过高剪切均质器处理一次。在配备合适固定角转子的离心机中，于20,000 × g离心1小时，澄清裂解液。</li>
		<li>设定FPLC系统（所用软件见材料表），并运行以下程序：
		<ol>
			<li>通过样品泵上样澄清后的裂解液。</li>
			<li>用4个柱体积（CVs）的缓冲液A（见材料表）洗涤。</li>
			<li>用4个柱体积的缓冲液B（见材料表）洗涤。</li>
			<li>用8个柱体积的缓冲液C（见材料表）洗涤。</li>
			<li>用3个柱体积的缓冲液D（见材料表）洗涤。</li>
			<li>用3个柱体积的洗脱缓冲液（见材料表）洗脱。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>取10 µL峰值馏分进行SDS-PAGE分析。收集并合并具有目标纯度的峰值馏分。保留约50 µL合并洗脱液用于SDS-PAGE分析。 
		注：通常仅出现一个单一峰，该峰内所有馏分中HTT纯度约为90%。</li>
		<li>使用5个柱体积的再生缓冲液（见材料表）再生抗FLAG柱，随后用5个柱体积的缓冲液A重新平衡柱子。 
		注：抗FLAG树脂可重复使用最多五次，或直至每升相对产率降至首次纯化时的50%为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用凝胶过滤柱进行尺寸排阻层析（SEC）纯化
	<ol>
		<li>使用凝胶过滤缓冲液（见材料表）预先平衡允许分离分子量（MW）&#62; 500 kDa蛋白的凝胶过滤柱（所用柱见材料表），平衡体积为2 × CV。</li>
		<li>通过50 mL超大进样环直接上样抗FLAG洗脱液（来自步骤6.1.5）。每次进样运行1.2 × CV的凝胶过滤缓冲液。在4 °C下过夜运行凝胶过滤分离。 
		注：本研究所选凝胶过滤柱最多可上样5 mL或15 mL蛋白样品。可编程FPLC系统以实现多次自动进样。样品方法脚本也作为补充文件1和补充文件2提供。</li>
		<li>将洗脱图谱与标准HTT洗脱图谱进行比较，以区分单体、二聚体及更高阶寡聚体峰。根据凝胶过滤柱的洗脱图谱合并单体HTT馏分。如需要，可分别合并更高阶寡聚体和二聚体HTT馏分。</li>
		<li>使用100 kDa超滤离心浓缩管在4 °C下浓缩合并的HTT蛋白。通过将OD280值除以相应的消光系数计算蛋白浓度（Q23-HTT、Q48-HTT、Q73-HTT和ΔExon1-HTT的理论消光系数分别为0.776、0.769、0.762和0.798 (mg/mL)-1cm-1，用于计算）。保持HTT浓度≤ 1.0 mg/mL。 
		注：浓缩过程中必须密切监测，过度浓缩会导致蛋白聚集。</li>
		<li>将纯化的HTT蛋白分装至耐低温的微量离心管中，每管体积&#60; 100 µL。使用液氮速冻分装样品，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 采用分析型高效液相色谱结合SEC-MALS-dRI分析HTT的多分散性
<ol>
	<li>在配备紫外检测器、多角度光散射检测器和差示折射率（dRI）检测器的高效液相色谱（HPLC）系统上，于 4 °C 条件下进行所有分析型 SEC-MALS 实验。</li>
	<li>在将超高效液相色谱（UHPLC）柱连接至系统之前，使用经过滤（0.1 µm）的 HPLC 级水冲洗泵和检测器。</li>
	<li>将 UHPLC 色谱柱（参见材料表中所用色谱柱）连接至系统。先用经过滤（0.1 µm）的水平衡色谱柱，再用 SEC-MALS 缓冲液（表 1）平衡，直至所有检测器信号达到基线稳定。</li>
	<li>以 0.3 mL/min 的流速，每次进样 2 µL 浓度为 6 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA），运行 15 分钟，并检查数据质量。根据 BSA 的洗脱曲线进行归一化、峰对齐和峰展宽校正，并为后续 HTT 样品的运行建立模板。</li>
	<li>使用浮子在室温水浴中快速解冻一管 FL Q23-HTT 样品。将 HTT 样品通过 0.1 µm 的离心滤膜过滤。进样 2–4 µL HTT 样品，在 4 °C 条件下以 0.3 mL/min 的流速运行 15 分钟&#160;。</li>
	<li>使用配套软件分析色谱和光散射数据（参见材料表）。采用 dRI 检测器作为浓度检测器，并将 HTT 的折射率增量（dn/dc）设为 0.185。生成 Zimm 图以确定每个峰的重均分子质量33,34。 
	注：HTT 的折射率增量通过 SEDFIT 软件35，以 HTT 的氨基酸一级序列作为输入计算得出，结果为 0.185。 
	&#8203;注：HTT 单体的分子量通过 SEC-MALS 测定约为 370 kDa ± 30 kDa。纯化的 HTT 样品中单体含量通常在 60% 至 75% 之间（本实验室数据）。单体含量较低可能表明在操作过程中需更加谨慎，以防止聚集发生。</li>
</ol>
8. 采用蓝色天然PAGE分析HTT的多分散性
<ol>
	<li>通过将 50 mL 的 20x 蓝色天然 PAGE 电泳缓冲液（参见材料表）与 950 mL 的 H2O 混合，配制 1 L 阳极缓冲液。通过将 100 mL 的 20x 蓝色天然 PAGE 电泳缓冲液与 100 mL 的蓝色天然 PAGE 阴极添加剂（20x）及 1,800 mL 的 H2O 混合，配制 2 L 深蓝色阴极缓冲液。使用前将缓冲液冷却至 4 °C&#160;。</li>
	<li>使用浮筒在室温水浴中快速解冻一管 FL Q23-HTT 样品。解冻后的蛋白样品使用前置于冰上保存。</li>
	<li>将 5 µg 的 FL Q23-HTT（~1 mg/mL）、1 µL 的 0.5% G250 添加剂、2.5 µL 的 4x 蓝色天然 PAGE 上样缓冲液与水混合，使最终体积达到 10 µL。</li>
	<li>将混合后的 FL Q23-HTT 样品上样至 3-12% 预制 Bis-Tris 凝胶。在同一块凝胶中上样 7.5 µL 未染色蛋白标准品作为标准参照。</li>
	<li>将电泳槽前部加入深蓝色阴极缓冲液，后部加入阳极缓冲液。 
	注：在上样完成后再加入缓冲液，以便于观察上样过程。</li>
	<li>在 4 °C 冷室中以 150 V 电压电泳 120 分钟。</li>
	<li>使用脱色液（表 1）对凝胶进行脱色，直至观察到条带；随后将凝胶转移至水中。在成像系统中对凝胶进行成像与记录。 
	&#8203;注：蓝色天然 PAGE 最初设计用于分析膜蛋白。本实验室将其改进为一种评估 HTT 单体含量的替代方法。该方法通过结合 HTT 的疏水区域，在无去垢剂的缓冲条件下防止其形成聚集体。传统的天然 PAGE 若不使用考马斯亮蓝 G250，会导致 HTT 形成可溶性寡聚体和聚集体，这可能是由于 HTT 分子中存在多个疏水口袋所致。</li>
</ol>
9. 采用SDS-PAGE结合考马斯亮蓝或银染法分析HTT纯度
<ol>
	<li>向纯化的 FL Q23-HTT 中加入 4x LDS 上样缓冲液和 10x 还原试剂，使上样缓冲液和还原试剂的终浓度均为 1x。</li>
	<li>将样品置于干式加热块中，在 70 °C 下加热 10 分钟。</li>
	<li>每孔最多上样 1 µg 蛋白质至 3-8% Tris 乙酸盐凝胶中，使用 Tris-乙酸盐 SDS 电泳缓冲液在 150 V 条件下电泳运行 1 小时。 
	注意：本研究中使用的蛋白质也可直接从科里尔研究所亨廷顿病社区资源库（www.coriell.org/1/CHDI）获取；详见材料表。</li>
	<li>考马斯亮蓝染色
	<ol>
		<li>用 H2O 洗涤凝胶 5 分钟。</li>
		<li>将凝胶置于考马斯亮蓝染色液（表 1）中，在 30 mL 染色液中摇动染色 15 分钟。</li>
		<li>用 50 mL H2O 摇动脱色 5 分钟，重复两次。在成像仪上观察并记录考马斯亮蓝染色的凝胶结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用商用银染试剂盒进行银染。
	<ol>
		<li>SDS-PAGE 电泳结束后，在室温下用固定液（表 1）固定凝胶 1 小时至过夜。</li>
		<li>按照试剂盒说明书进行染色、洗涤和显影操作。</li>
		<li>一旦条带达到理想强度，立即终止显影步骤。</li>
		<li>使用配备可见光源的凝胶成像系统记录凝胶图像。 
		注意：通过本方案可检测纯度&#62;95% 的 HTT 蛋白。有关定量蛋白质分析的具体操作，请参见先前发表的方案32。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
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作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

本文介绍了一种瞬时转染、表达与纯化方法，可用于生成多种全长HTT蛋白构建体，其纯度和均一性均适合用作免疫分析和质谱分析开发的标准品、Western blot分析的对照以及结构-功能研究。该瞬时表达方法具有可扩展性和多功能性，使研究人员能够比此前报道的稳定细胞系或基于病毒的方法更高效地获得毫克级的全长HTT变异体21,22,23,24。通常情况下，在质粒构建完成后，采用该瞬时表达方法进行2 L规模的蛋白生产，可在不到一周的时间内获得2–5 mg高纯度的全长HTT蛋白，每升细胞培养物的典型产量为1–2.5 mg全长HTT。
本文所述的瞬时表达方法克服了稳定细胞系表达中的诸多障碍，例如建立细胞系所需时间较长，以及在储存和维持稳定细胞系方面存在的困难。与市场上其他转染试剂相比，PEI 的成本相对较低，使得大规模转染在经济上具有可行性。该方案也存在一些局限性：转染效率在很大程度上依赖于质粒的质量、细胞的最佳生长状态，以及 PEI 的储存和配制情况。操作人员需在这些关键步骤中格外注意并实施质量控制，以避免蛋白产量大幅下降。本方案中使用的抗 FLAG 树脂成本也相对较高，且在多次纯化和再生后对 FL HTT 的捕获能力会降低。部分研究人员可能会发现，改用其他标签以实现亲和树脂更稳定的再生更为实用。
为优化全长HTT蛋白的表达水平，测试了多种细胞系及表达条件。选择HEK293细胞进行全长HTT蛋白的表达，因其蛋白表达水平高，且易于在悬浮培养体系中操作，使该方法适用于摇瓶或生物反应器中的大规模表达。相较于常规的37 °C培养温度，在较低温度（如32 °C）下培养可获得更高的全长HTT蛋白表达水平。较低温度可能减缓蛋白质合成速率，从而促进全长HTT的正确折叠40。然而，这一现象并非全长HTT或所测试细胞系所特有。降低转染后培养温度的方法已广泛应用于CHO细胞中药用蛋白的表达。尽管其机制尚未完全阐明，但普遍认为低温可将细胞周期阻滞于G1期，并将细胞能量重新分配至蛋白质生产41。
从哺乳动物细胞中纯化的全长HTT与分子伴侣Hsp70共洗脱24，而通过Mg-ATP洗涤步骤可去除Hsp70蛋白。有趣的是，在昆虫细胞表达系统中纯化的全长HTT则未观察到共洗脱的Hsp7021,22,23。这可能反映了全长HTT在哺乳动物细胞与昆虫细胞中翻译后修饰（PTMs）的差异，或热休克蛋白对全长HTT过表达的不同应答。一旦重组蛋白去除了Hsp70，就需要使用CHAPS或DDM等非离子型去垢剂来稳定全长HTT的单体形式。
采用蓝色天然PAGE和SEC-MALS分析了全长HTT变异体的寡聚化状态。通过蓝色天然PAGE或SEC-MALS分析均发现少量二聚体及更高阶的HTT寡聚体存在。值得注意的是，全长HTT形成的高阶寡聚体似乎与polyQ长度无关，即使是外显子1缺失突变体也表现出相似的寡聚体-二聚体-单体比例。这些构建体之间寡聚体含量的实际差异可能源于每批样品在制备和处理过程中的微小差别。与HTT外显子1形成的聚集体和纤维不同40,41，全长HTT的高阶寡聚体保持可溶性，可通过SEC和天然PAGE进行分析。
纯化的单体全长HTT仅具有相对稳定性。在4 °C下长期储存、室温下短时间孵育，或浓度&#62;1 mg/mL 均会导致单体全长HTT转化为二聚体及更高阶的寡聚体形式，即使在这些条件下未观察到明显的沉淀。如先前所述24，在储存缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，500 mM NaCl，5% v/v 甘油，0.5% w/v CHAPS，以及5 mM DTT）中，浓度保持在≤1 mg/mL的纯化单体全长HTT在-80 °C下相对稳定。以该方式制备并储存的全长HTT经历多达6次冻融循环后，未出现蛋白可见沉淀，尽管SEC-MALS分析显示其略有向更高寡聚状态迁移的趋势（补充图S2）。此外，通过SDS-PAGE分析了多次冻融循环后的样品，未观察到可见沉淀物，SDS-PAGE也未检测到聚集体或额外的降解产物（补充图S3）。纯化全长HTT的长期稳定性仍在研究中。在缺乏明确的长期数据之前，建议将纯化的全长HTT在-80 °C下储存不超过6个月。
亨廷顿病（HD）研究领域对高质量的重组全长亨廷顿蛋白（FL HTT）变异体及其制备方法需求迫切。这些蛋白被用作免疫分析和质谱（MS）分析的标准品、结构研究以及新型全长HTT特异性检测方法开发的重要工具。本文所述的大规模瞬时表达方法能够稳定地生产出毫克量级、纯度超过&#62;95%的全长HTT变异体，为HTT相关研究提供了关键工具。目前，为支持亨廷顿病研究而常规制备数十毫克高纯度的全长HTT多聚谷氨酰胺（polyQ）变异体及其他突变体已成为可能。

亨廷顿病（Huntington's disease, HD）是一种罕见的神经退行性疾病，主要表现为运动不稳和不自主运动，以及认知和精神方面的改变，例如性格变化和淡漠1,2。HD 与亨廷顿基因（HTT）第一外显子中 CAG 重复序列的异常扩增有关，当重复次数超过 35 次时即可致病，且 CAG 重复次数越多，发病年龄越早3,4。HTT 基因的翻译产物——亨廷顿蛋白（huntingtin protein, HTT）——在神经元存活和大脑发育过程中发挥重要作用5,6,7,8,9。
HTT 是一种支架蛋白，据报道参与多种细胞过程，包括囊泡运输、细胞分裂、纤毛形成以及自噬10,11。然而，亨廷顿病（HD）的分子发病机制尚未完全明确，目前仍缺乏对介导多聚谷氨酰胺（polyQ）异常扩展型 mHTT 病理效应的关键蛋白相互作用因子的鉴定。一些研究表明，突变型 HTT（mHTT）可能因其扩增后的 HTT 蛋白易于发生寡聚化而获得毒性功能，因为在 HD 患者及疾病动物模型的神经元和胶质细胞中均已发现 HTT 蛋白聚集体12,13,14,15,16,17。为了推动对全长 HTT 及 mHTT 变体功能与结构的研究，并为检测方法开发提供高质量的蛋白标准品，亟需建立一种稳定且可放大的均一重组蛋白供应体系。
由于其尺寸较大（氨基酸残基1-3,144，编号基于多聚谷氨酰胺长度Q23）、蛋白水解不稳定以及易于聚集的特性，全长HTT（FL HTT）难以作为可溶性蛋白进行表达和分离。此前，HTT的外显子1区域（氨基酸残基2-90）已通过多种可增强蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中溶解度的标签实现大规模表达与纯化18,19,20。全长HTT首次在昆虫细胞表达系统中利用杆状病毒成功表达并纯化21,22，并报道了经化学交联的全长Q23-HTT和Q78-HTT的低分辨率（30 Å）电子显微镜（EM）结构23。当利用稳定细胞系或腺病毒表达系统在人源细胞中成功产生带有天然翻译后修饰（PTMs）的全长Q17、Q46和Q128-HTT后，对HTT结构的研究进一步推进24。这些研究表明，尽管纯化的HTT主要以单体形式存在，但也倾向于形成高级寡聚体和聚集体。
对具有高度扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）区域的全长突变亨廷顿蛋白（FL Q128-HTT）进行分析型超速离心分析，结果显示其形成的寡聚体和聚集物组分多于非扩展polyQ区域的蛋白24。通过使用稳定细胞系，研究人员已成功采用共表达其相互作用伴侣HAP40的策略来稳定全长HTT蛋白。利用纯化的蛋白复合物，已解析出全长HTT与HAP40复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构，平均分辨率达到4 Å（PDB:6EZ8）25。该共表达策略已被成功应用于杆状病毒表达系统，并从昆虫细胞中表达和纯化出一系列具有不同polyQ长度的高质量HTT变异体26。此后，更多具有不同polyQ长度的HTT与HAP40复合物的冷冻电镜结构以及更高分辨率的结构相继被解析，并已存入蛋白质数据库27,28（PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O）。
我们优化了一种在HEK293细胞中使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染和表达的方法，用于快速瞬时表达全长HTT蛋白。作为原理验证，首先采用对先前报道的纯化方法24的改进方案，对含有23个谷氨酰胺的全长HTT变体（FL Q23-HTT）进行了纯化和表征。该瞬时转染方法操作简便、效率高且可放大；每升培养液可获得1–2 mg的纯化HTT蛋白，产量与此前报道的稳定细胞系方法相当24。由于该蛋白在人源细胞系中表达，因此在进行质谱蛋白质组学分析时，所获得的HTT蛋白更可能具有天然的人源翻译后修饰11,29,30,31。我们利用该方法生产了毫克量级的FL Q48-HTT、FL Q73-HTT以及外显子1缺失型（ΔExon1-HTT）的全长HTT变体，证明该瞬时表达方法在无需耗时构建稳定细胞系的情况下，能够快速生产多种HTT蛋白变体，具有显著优势。
以下方案展示了本研究作者实验室中用于细胞培养、转染、蛋白纯化及纯化后蛋白表征的标准方法，以从2 L细胞培养物中制备全长Q23-HTT蛋白。该方案可放大至更大规模的培养体系，或经调整用于纯化其他HTT变异体。在本实验室中，已成功使用相同方案完成多达10 L的全长HTT培养，并对HTT的各种定点突变、截短突变及其同源蛋白进行了纯化。纯化所得的全长HTT蛋白包含高比例的单体，同时存在二聚体及更高阶的寡聚体。在所制备的不同变异体（Q23、Q48、Q73及缺失Exon1）中均观察到相似的聚集特征。由于若操作不当可能发生聚集，因此开展了制剂配方与冻融稳定性研究，以确定最佳的蛋白操作条件。本文还描述了蓝色天然PAGE和SEC/MALS-RI等方法，用于在质量控制过程中分析HTT的寡聚状态。为促进亨廷顿病（HD）研究领域的发展，本研究中所使用的质粒和HTT蛋白均已存入科里尔研究所（Coriell Institute）的HD社区资源库（www.coriell.org/1/CHDI）。

<table><tbody><tr><td>100 kDa 浓缩器-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>实验方案章节编号-6.2.4</td></tr><tr><td>20x 蓝色天然 PAGE 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>实验方案章节编号-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>实验方案章节编号-5.1</td></tr><tr><td>4x 蓝色天然 PAGE 上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>实验方案章节编号-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS 上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>实验方案章节编号-5.3</td></tr><tr><td>5 L 锥形瓶</td><td>Corning</td><td>431685</td><td>实验方案章节编号-4.2</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>实验方案章节编号-2.2</td></tr><tr><td>防结块剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>实验方案章节编号-4.8</td></tr><tr><td>抗 FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>实验方案章节编号-6.1.1</td></tr><tr><td>抗 FLAG M2 抗体</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>消泡剂-Excell 消泡剂</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>实验方案章节编号-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>实验方案章节编号-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2.5 &amp;micro;m x 4.6 mm x 150 mm&lt;br/&gt; 实验方案章节编号-7.3</td></tr><tr><td>蓝色天然 PAGE 5% G-250 样品添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>实验方案章节编号-8.3</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>实验方案章节编号-2.5</td></tr><tr><td>离心机 - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>实验方案章节编号-6.1.3</td></tr><tr><td>细胞计数仪 - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>实验方案章节编号-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>实验方案章节编号-6.1.4.6</td></tr><tr><td>感受态大肠杆菌细胞-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>实验方案章节编号-2.4</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>实验方案章节编号-5.1</td></tr><tr><td>差示折光检测器</td><td>Wyatt</td><td></td><td>实验方案章节编号-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDK 肽</td><td>Genscript</td><td></td><td>多肽合成服务&lt;br/&gt; 实验方案章节编号-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>实验方案章节编号-5.1</td></tr><tr><td>内毒素去除型质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>实验方案章节编号-3.3</td></tr><tr><td>无内毒素水</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>实验方案章节编号-4.1</td></tr><tr><td>内毒素定量检测试剂盒-CRL Endosafe Nexgen-PTS 检测系统</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>实验方案章节编号-3.4</td></tr><tr><td>固定角转子 A23-6x100</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>实验方案章节编号-6.1.3</td></tr><tr><td>FPLC 软件- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>实验方案章节编号-6.1.4</td></tr><tr><td>基因合成</td><td>Genscript</td><td></td><td>基因合成服务&lt;br/&gt; 实验方案章节编号-1.2</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific 甘油（符合 ACS 标准）</td><td>G33-4</td><td>实验方案章节编号-5.6</td></tr><tr><td>培养基-Expi293 表达培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>实验方案章节编号-4.2</td></tr><tr><td>HEK293 细胞</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>实验方案章节编号-4</td></tr><tr><td>高剪切均质器-Microfluidizer</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>实验方案章节编号-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>实验方案章节编号-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>图像分析软件&lt;br/&gt; 实验方案章节编号-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>实验方案章节编号-5.7</td></tr><tr><td>多角度光散射检测器</td><td>Wyatt</td><td></td><td>实验方案章节编号-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark 未染色蛋白质标准品</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>实验方案章节编号-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>实验方案章节编号-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>提供高保真版本&lt;br/&gt; 实验方案章节编号-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&amp;ndash;8% 醋酸-Tris 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>实验方案章节编号-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-醋酸 SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>实验方案章节编号-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>实验方案章节编号-4.1</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>实验方案章节编号-4.2</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>实验方案章节编号-4.5</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>实验方案章节编号-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>实验方案章节编号-2.2</td></tr><tr><td>预制 Bis-tris 凝胶- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>实验方案章节编号-8.4</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>实验方案章节编号-5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS 分析软件 - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>实验方案章节编号-7.6</td></tr><tr><td>二抗 -IRdye 800 CW 山羊抗小鼠 IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>实验方案章节编号-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>实验方案章节编号-6.2</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>实验方案章节编号-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>实验方案章节编号-6.1.1</td></tr><tr><td>紫外分光光度计 - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>实验方案章节编号-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>实验方案章节编号-6.1.1</td></tr></tbody></table>

利用瞬时表达系统在哺乳动物细胞中高效且可扩展地生产全长人源亨廷顿蛋白变体

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

全长亨廷顿蛋白（FL HTT）是一种大型（氨基酸序列1-3,144）、普遍表达的含多聚谷氨酰胺（polyQ）结构域的蛋白质，分子量约为350 kDa。尽管全长HTT的细胞功能尚未完全明确，但当polyQ重复序列发生突变并扩展至约36次以上时，会引发亨廷顿病（HD），且polyQ长度与发病年龄大致相关。为了更深入理解结构对突变型HTT（mHTT）功能的影响，需要大量该蛋白。以往通过强力霉素诱导的稳定细胞系表达，已在哺乳动物细胞中实现了亚毫克级的FL HTT生产。然而，稳定细胞系的蛋白表达存在一定的局限性，而瞬时转染方法可克服这些限制。
本文介绍了一种利用密码子优化质粒通过聚乙烯亚胺（PEI）瞬时转染实现全长HTT蛋白（FL HTT）及其变体低毫克量高效制备的可靠方法。该方法具有可扩展性（&gt;10 mg），并能稳定地从每升细胞培养物中获得1–2 mg高度纯化的全长HTT蛋白。与先前报道一致，纯化后的全长HTT蛋白在溶液中表现出高度动态特性，具有形成二聚体及高级寡聚体的倾向。减缓寡聚体形成的关键在于，在尺寸排阻色谱过程中迅速操作，以分离单体组分与二聚体及高级寡聚体组分。
采用尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）分析纯化的HTT蛋白中二聚体及更高阶寡聚体的含量。在全长HTT（FL HTT）的不同多聚谷氨酰胺长度（Q23、Q48 和 Q73）与寡聚体含量之间未观察到相关性。缺失外显子1的构建体（aa 91-3,144）表现出与全长HTT（aa 1-3,144）相当的寡聚化倾向。本文描述了通过SEC/MALS-折射率（RI）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹（western blot）、天然PAGE和蓝色天然PAGE进行的蛋白制备、纯化和表征方法。

我们提供了可扩展的实验方案，涵盖在HEK293细胞中设计构建体、瞬时转染以及全长人源亨廷顿蛋白变体的表达与纯化。

全长亨廷顿蛋白（FL HTT）是一种大分子蛋白（氨基酸序列1-3,144），广泛表达，含有多聚谷氨酰胺（polyQ）结构域，分子量约为350...

本方案旨在低毫克规模下生产全长亨廷顿蛋白变体，可为亨廷顿病（HD）研究人员提供稳定、高质量的蛋白质。本实验操作由Curia实验室的研究科学家Michael Harris进行示范。首先，将1克聚乙烯亚胺25 K加入1升无内毒素水中，充分搅拌。使用100毫摩尔盐酸将pH值调节至2.0，并持续搅拌直至聚乙烯亚胺完全溶解。然后使用100毫摩尔氢氧化钠溶液将pH值调节至7.0，并将溶液通过0.2微米滤膜过滤。将过滤后的溶液分装，并于-20摄氏度保存。在37摄氏度、90转/分钟、5%二氧化碳的湿润摇床培养箱中，使用添加青霉素-链霉素的生长培养基培养HEK293细胞，培养18至24小时。转染前一天，将细胞以约1.2 × 10⁶个细胞/毫升的密度稀释于5升锥形瓶中的2升生长培养基中，继续培养18至24小时。孵育结束后，按照制造商的说明，使用自动细胞计数仪测定细胞密度和活力。计算转染所需的聚乙烯亚胺和质粒用量后，分别将聚乙烯亚胺和质粒稀释于 100 毫升 PBS 中，并在室温下孵育 5 分钟。然后，通过轻轻涡旋混合稀释后的质粒和聚乙烯亚胺，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。将混合物加入细胞培养物中，轻轻旋转混匀。然后，让细胞培养生长24小时。次日，向培养物中加入丁酸钠溶液，使其终浓度为2毫摩尔，并按1:1,000的体积比加入抗团聚和抗泡沫试剂，随后将细胞置于加湿的摇床培养箱中孵育48小时。在测定细胞活力和密度后，以 2,000 G 离心 30 分钟收集细胞，并在纯化前将细胞沉淀于 -80 摄氏度保存。使用 FPLC 进行抗 FLAG 纯化时，将 12 至 25 毫升抗 FLAG 树脂以每分钟 4 毫升的流速用缓冲液 A 装入空柱中，并调节压杆高度，以消除压杆末端与树脂床之间的空隙。接着，将解冻的细胞沉淀悬浮于预冷的裂解缓冲液中，并在 1,000 psi 压力下，将细胞悬液通过高剪切均质器匀浆一次。使用配备兼容固定角转子的离心机，在 20,000 G 条件下离心澄清裂解液一小时。在 FPLC 的“方法”窗口中进行程序设置，通过样品泵上样澄清后的裂解液，并按照文本稿件中的描述，用指定柱体积的缓冲液 A、B、C、D 及洗脱缓冲液洗涤层析柱。运行结束后，取 10 微升峰馏分，采用 SDS-PAGE 进行分析。合并具有理想纯度的峰组分，并保留约 50 微升合并的洗脱液用于后续 SDS-PAGE 分析。使用 FPLC 开始平衡 SEC 柱，并通过 50 毫升超大进样环加载抗 FLAG 洗脱液。运行 SEC 缓冲液后，于 4°C 下过夜进行 SEC 分离。将洗脱图谱与标准的HTT洗脱图谱进行比较，以区分单体、二聚体以及更高阶的寡聚体峰。根据凝胶过滤层析柱的洗脱图谱，合并单体HTT组分；如需要，可分别合并更高阶的寡聚体和二聚体HTT组分。使用100千道尔顿的离心浓缩器在4°C条件下浓缩合并后的HTT蛋白。计算蛋白质浓度后，将少于100微升的纯化HTT蛋白分装至耐冷冻的微量离心管中。使用液氮速冻分装样品，并于-80摄氏度保存。所有分析型SEC-MALS实验均需在4摄氏度下进行，使用配备紫外检测器、多角度光散射检测器和差示折射率检测器的HPLC系统，并采用0.185作为HTT的折射率增量值。使用经过滤的高效液相色谱级水冲洗泵和检测器，并将超高效液相色谱柱连接至系统。先用经过滤的水平衡色谱柱，再用SEC-MALS缓冲液平衡，直至所有检测器信号达到基线。以每分钟0.3毫升的流速，每次进样15分钟，注入2微升的BSA溶液。检查数据质量，基于 BSA 谱图进行归一化、峰对齐和峰展宽校正，并为后续的 HTT 样本运行创建模板。使用浮筒在室温水浴中快速解冻一支 FL Q23-HTT 样本。使用 0.1 微米旋转滤器过滤 HTT。注入 2 至 4 微升 HTT 样品，在 4 摄氏度下以每分钟 0.3 毫升的流速运行 15 分钟。使用配套软件分析色谱和光散射数据，并生成 Zimm 图以确定每个峰的重均分子质量。在本研究中，采用两步柱纯化方法，HTT 的纯度超过 95%，主要污染物为分子伴侣 Hsp70，该污染物在抗 FLAG 亲和纯化步骤中通过氯化镁和 ATP 的充分洗涤被去除。全长 HTT 的过表达可能导致蛋白质断裂，但本方法制备的 FL Q23-HTT 在电泳中呈现单一条带，其分子量为 350 千道尔顿，表明未发生断裂。抗体与FL Q23-HTT反应后的Western印迹分析表明，该蛋白被成功分离且无明显可检测的截短片段，因为未观察到任何与额外片段相关的条带。全长HTT多聚谷氨酰胺（poly-Q）长度变异体Q23、Q48和Q73在Western印迹中表现出预期的反应结果，针对多聚谷氨酰胺的单克隆抗体MW1信号强度随Q长度增加而逐渐增强。在所测试的HPLC色谱柱中，SEC色谱柱在HTT单体与二聚体之间表现出足够的分辨能力，能够区分其摩尔质量。SEC纯化的全长HTT在凝胶电泳中显示出对应于不同寡聚状态的多条条带，这可能是由于存在多个疏水区域，这些区域在凝胶迁移过程中促进了高阶寡聚体的形成。纯化的HTT在蓝色天然PAGE上显示出三条主要条带，其估计分子量分别为643、927和1,070千道尔顿，可能分别代表HTT的单体、二聚体和三聚体形式。正确处理纯化的亨廷顿蛋白对于避免可溶性聚集体中高阶寡聚体的产生至关重要。最终使用者必须迅速操作，将样品分装至预冷的离心管中，然后立即进行速冻。长期稳定性测试可在样品于零下80摄氏度长期储存后进行。重复进行高效液相色谱-尺寸排阻色谱-多角度激光散射（HPLC SEC-MALS）分析，可确认样品的单体含量是否发生变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用瞬时表达系统高效、可扩展地生产哺乳动物细胞中的全长人类亨廷顿蛋白变异

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。...

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。...

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。...

用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

本文介绍了一种使用HEK293T细胞的低成本颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量、高纯度、完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶。...

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

这是一种快速且成本效益高的方案，用于表达分泌型糖基化哺乳动物蛋白，并通过单步纯化获得足量均一的蛋白，适用于X射线晶体学及其他生物物理研究。...

用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。...

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本文介绍了一种基于小泛素样修饰蛋白（SUMO）瞬时融合的稳定且经过优化的实验方案，可用于制备毫克级的亨廷顿蛋白外显子1（Httex1）的天然、无标签单体及纤维。...

利用SUMO融合策略生成天然无标签的亨廷顿蛋白外显子1单体及纤维

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

在HEK293细胞中以低成本表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），并通过亲和层析进行纯化。随后在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接单生物素标记。与 commercially available BDNF 相比，BDNFAvi 及单生物素化BDNFAvi...

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

了解在HEK293细胞中利用瞬时表达系统高效生产全长亨廷顿蛋白变异的方法。该方案通过抗FLAG亲和层析和SEC-MALS技术实现超过95%的纯度，为亨廷顿病研究提供高质量蛋白。

利用瞬时表达系统在哺乳动物细胞中高效且可扩展地生产全长人源亨廷顿蛋白变体

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