Name: 马萨霉素的合成，一种革兰氏阳性细菌生长的小分子抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习马萨霉素的合成方法，这是一种抑制革兰氏阳性细菌生长的小分子化合物。本方案详细演示了针对枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌的合成步骤、薄层色谱验证及形态学应用。

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本研究由美国国家科学基金会资助，项目编号为2009522。对马萨里霉素的核磁共振（NMR）分析由美国国家科学基金会重大研究仪器项目资助，项目编号为1919644。本文材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。

1. 通用方法
注意：所有化合物均购自常规供应商，未经进一步纯化即直接使用。
<ol>
	<li>在预涂硅胶 XG F254 的铝板上进行薄层色谱（TLC）分析。通过紫外灯下观察或浸入显色剂中检测斑点 p-anisaldehyde 染色，或通过暴露于 I2 蒸气</li>
	<li>在400 MHz波谱仪上记录所有核磁共振（NMR）谱图。 
	注意： 1氢-核磁共振（H-NMR）和 13C-NMR 谱以残留溶剂峰为参照。耦合常数以 [Hz] 表示，化学位移以 [ppm] 表示。</li>
	<li>使用配备大气压固体分析探针的紧凑型质谱仪，记录麻沙米星的大气压化学电离（APCI）质谱图。</li>
</ol>
2. 马萨里霉素制备的一般步骤
注意：以下步骤需在通风橱中进行。
<ol>
	<li>分别在甲醇中配制每种反应物的 0.1 M 溶液：环己胺、环己基甲醛， o-碘苯甲酸和环己基异氰化物35. 
	警告：环己胺、环己基异氰酸酯和环己基甲醛具有可燃性，可引起皮肤腐蚀，并可能导致经口、经皮、吸入或生殖毒性。请将这些化合物远离明火、高温表面及点火源。操作时应穿戴适当的皮肤和眼部防护装备，在通风良好的区域进行，避免吸入蒸气或雾滴。储存时应将瓶盖 tightly closed（紧密封闭），置于阴凉、干燥处。环己基甲醛应置于干燥器中，并在 N₂ 氛围下储存。2 大气</li>
	<li>将5 mL环己胺（甲醇中0.1 M溶液）与5 mL环己基甲醛（甲醇中0.1 M溶液）加入带盖的圆底烧瓶中，使用磁力搅拌子在搅拌/加热板上搅拌30分钟 40 °C 在沙浴中进行。使用温度计监测温度，温度计置于沙表面下方约1 cm处。</li>
	<li>30 分钟后，向 2.2 步骤所得溶液中加入 5 mL 环己基异氰化物（甲醇中 0.1 M 溶液），并在 50 °C最后，加入5 mL的 o-碘苯甲酸（甲醇中的0.1 M溶液）加入反应混合物中，并继续在 55 °C 3-5 小时。</li>
	<li>反应混合物搅拌3小时后，每隔约1小时用薄层色谱（TLC）定期监测反应进程。</li>
	<li>剪取一块 3 cm × 6 cm 的铝背薄层色谱板。用 2 号铅笔在距底部约 1 cm 处画一条线。使用玻璃毛细管，点样约 5 µL 将反应混合物点样到薄层色谱板上并使其干燥。</li>
	<li>向一个150 mL烧杯中加入足量流动相（正己烷:异丙醇 = 90:10），以浸没烧杯底部。使用镊子小心将上述薄层色谱板放入烧杯中，确保色谱板均匀进入流动相。用一片铝箔覆盖烧杯口。 
	注意：确保流动相不要淹没点样线和样品点。</li>
	<li>让流动相沿薄层色谱板上升，直至距离板顶端约1 cm处。取出薄层色谱板，用铅笔画线标记流动相前沿的位置。将薄层色谱板置于通风橱中晾干。</li>
	<li>干燥后，将薄层色谱板放入盛有少量固体 I 的烧杯中2 用锡箔纸盖住烧杯。通过薄层色谱监测黄色/棕色斑点的出现。斑点显现后，取下薄层色谱板，用铅笔标记斑点的位置。补充图1). 
	注意：如果 I2 斑点未标记时，染料会随时间逐渐消散。也可通过紫外光在薄层色谱板上观察到斑点。 p-茴香醛染色，或高锰酸钾染色（参见 补充信息).</li>
	<li>计算 Rf 使用以下公式计算所有可视化斑点的数值： 
	Rf = <img alt="色谱公式，Rf 值计算，距离比，化学方法，分离分析" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>当仅观察到一个斑点且R值满足条件时，可认为反应已完成f 在薄层色谱板上可见 Rf = 0.3 的斑点。在减压条件下用旋转蒸发仪除去溶剂，并在高真空下干燥粗产物（呈黄棕色油状），直至甲醇完全蒸发。</li>
	<li>将干燥的粗产物溶于30 mL乙酸乙酯中，转移至分液漏斗。依次用1 M HCl（2 × 30 mL）、H2O（30 mL），饱和 NaHCO₃3 溶液（2 × 30 mL），H2O（30 mL）和饱和氯化钠溶液（2 × 30 mL）。弃去水相。 
	注意：在每次萃取中，乙酸乙酯层均为上层。每次萃取时，需剧烈振荡分液漏斗，其中含有乙酸乙酯和水相溶液（HCl、H2O, NaHCO₃3，或 NaCl），静置使各层充分分离。</li>
	<li>从分液漏斗中移除乙酸乙酯层，并收集至锥形瓶中。加入一药匙的 Na2SO4 （无水）以去除乙酸乙酯中的残留水分。 
	注意：当 Na2SO4 在烧瓶中自由流动，不结团。如果 Na2SO4 出现结块时，需额外加入一刮勺 Na2SO4 可以添加。</li>
	<li>将干燥的乙酸乙酯溶液通过1号滤纸过滤，以去除Na2SO4用少量乙酸乙酯洗涤滤纸。将滤过的乙酸乙酯溶液置于圆底烧瓶中，在减压条件下用旋转蒸发仪除去溶剂，待乙酸乙酯完全去除后，得到油状的masarimycin。</li>
	<li>将上述得到的masarimycin油状物溶于少量（1–2 mL）9:1的正己烷:异丙醇混合溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌至化合物完全溶解。</li>
	<li>使用12 g正相硅胶快速柱对溶解的masarimycin进行快速柱层析纯化。
	<ol>
		<li>使用仪器设定流速为15 mL/min，以10倍柱体积的流动相（正己烷:异丙醇=99:1）对闪式色谱柱进行平衡。 
		注意：平衡完成后，停止流速，将色谱柱上端与系统断开。</li>
		<li>使用5 mL注射器吸取溶解的masarimycin。将注射器直接连接至预平衡的快速柱顶端，并将溶液注入柱中。重新将上样后的柱子连接至快速色谱系统，并启动梯度洗脱。</li>
		<li>使用梯度洗脱，于12个柱体积内将流动相浓度逐渐调整至10:90的正己烷:异丙醇，从色谱柱中洗脱马萨里霉素。监测马萨里霉素的洗脱情况 通过 230 和 254 nm 处的吸收</li>
		<li>使用馏分收集器收集从色谱柱中洗脱出的化合物，每个馏分收集20 mL溶剂。 
		注意：若无快速色谱系统，可采用其他方法纯化 masarimycin 通过 重力硅胶柱，流动相为3:1（正己烷:乙酸乙酯）。可通过TLC（采用相同流动相）鉴定含有masarimycin的馏分。TLC斑点的显色可使用紫外光或碘蒸气。2 蒸气，或高锰酸钾染色。</li>
		<li>通过薄层色谱法（步骤 2.5–2.9）或配备大气固体分析探针的小型质谱仪进行质谱分析，鉴定含有 masarimycin 的组分。在真空条件下（约 0.3 mbar）干燥最终产物。 
		注意：马萨里霉素通常以无色油状物或固体形式获得，产率相对于反应中加入的环己基甲醛（以毫摩尔计）为55%–70%。通过称量纯化后的马萨里霉素质量，并结合以下公式计算反应的理论产量，从而确定马萨里霉素的最终产率： 
		%产率 = <img alt="纯度计算公式：纯化产物质量除以产物的理论质量。" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> × 100%</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过核磁共振（NMR）确认马萨里霉素的结构。
	<ol>
		<li>将约 10 mg 的 masarimycin 样品溶于 0.5 mL CDCl₃ 中3使用巴斯德移液管将溶液转移至5 mm核磁共振管中，并盖上管帽。将核磁共振管放入波谱仪中。</li>
		<li>获取 1H 和 13C NMR 谱图采用仪器制造商预设的实验程序获得。化学位移归属及代表性谱图见于 补充图 3-4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将马萨里霉素干燥保存或溶于DMSO（终浓度为25 mM）后于-20°C保存20 °C 直至使用。</li>
</ol>
3. 制备马萨里霉素的微波法
<ol>
	<li>在乙腈中分别配制环己胺、环己基醛、环己基异氰化物和邻碘苯甲酸的 0.6 M 溶液。</li>
	<li>向一个玻璃微波反应小瓶中加入搅拌子和 10 mL 乙腈。</li>
	<li>向该小瓶中加入 2 mL 环己胺（乙腈中 0.6 M）、2 mL 环己基醛（乙腈中 0.6 M）以及 7 mL 乙腈。</li>
	<li>将微波反应小瓶放入微波仪的转盘中。搅拌混合物，在 400 W 功率下于 50°C 加热 30 分钟，然后使其冷却至室温。</li>
	<li>向小瓶中加入 2 mL 邻碘苯甲酸（甲醇中 0.6 M）和 2 mL 环己基异氰化物（乙腈中 0.6 M）。搅拌混合物，在微波仪中以 400 W 功率加热至 100 °C，持续 40 分钟，然后使其冷却至室温。</li>
	<li>在步骤 3.5 完成后，通过薄层色谱（TLC，正己烷:异丙醇 = 90:10）并使用 I2 蒸气显色监测反应进程。 
	注意：若 TLC 显示反应未完成（即 TLC 上出现多个斑点），则将反应小瓶重新放入微波仪中，并按照步骤 3.5 所述条件再次加热。</li>
	<li>反应完成后，将溶液倒入 100 mL 圆底烧瓶中，并使用旋转蒸发仪蒸干至干燥。</li>
	<li>参照上述步骤 2.6–2.16 完成马萨里霉素的水相后处理、纯化及表征。</li>
</ol>
4. 协同与拮抗作用检测
<ol>
	<li>在含有5%（v/v）绵羊血的Mueller-Hinton（MH）琼脂平板上，于37 °C厌氧条件下培养Streptococcus pneumoniae R6。所有实验均使用在5 mL MH肉汤中、37 °C厌氧条件下培养至OD600约为0.4的第二代细胞。</li>
	<li>将抑制剂masarimycin和optochin分别在其相应溶剂中进行1:2系列稀释，使最终浓度范围涵盖每种抑制剂的最低抑菌浓度（MIC）值。
	<ol>
		<li>将masarimycin用二甲基亚砜（DMSO）进行初始稀释，使其浓度达到100 µM。此后，使用MH肉汤对masarimycin进行后续稀释。通过将市售optochin（见材料表）溶解于无菌MH肉汤中，制备optochin储备液（3.5 mM）。 
		注：masarimycin储备液以25 mM浓度溶于DMSO中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向无菌的96孔微孔板中，向每行加入2 µL的各optochin稀释液。在同一块板中，向每列加入2 µL的各masarimycin稀释液，从而在板上形成optochin与masarimycin浓度的阵列（图2）。</li>
	<li>向含有上述抑制剂的各孔中加入93 µL无菌MH肉汤。然后加入5 µL来自步骤4.1的菌液（OD600 ~0.4）接种微孔板。 
	注：96孔板的接种通常在厌氧工作站内的厌氧条件下进行。每孔最终体积为100 µL。</li>
	<li>在37 °C厌氧条件下培养18小时，随后向每孔加入30 µL浓度为0.01%（m/v）的刃天青钠盐溶液。将微孔板在室温下孵育15分钟，以使颜色充分显色并稳定。 
	注：刃天青溶液通过将该化合物溶解于蒸馏水中制备，可在4 °C保存最多两周。</li>
	<li>直接读取板上各孔的浓度值，并将未观察到细菌生长（呈现蓝色）的最低抑制剂浓度定义为[X]（见步骤4.7.1），即在共用药存在下该药物的最低抑菌浓度。 
	注：阳性细菌生长通过刃天青染料变为粉红色来识别。每种药物单独使用时的MIC值（即无共用药时）采用类似的刃天青MIC测定法35分别测定每种药物（补充图5）。masarimycin和optochin在S. pneumoniae中的MIC值分别为7.8 µM和15.85 µM。</li>
	<li>使用以下公式计算部分抑菌浓度（FIC）及FIC指数（FICI）。
	<ol>
		<li>FIC = [X]/MICx，其中[X]（来自步骤4.6）为在共用药存在下该药物的最低抑菌浓度，MICx为在无共用药时该药物的最低抑菌浓度。</li>
		<li>FICI = FICmasarimycin + FICantibiotic 
		注：FICI &lt; 0.5 表示协同作用，0.5 &lt; FICI &lt; 1 表示相加作用，1 &lt; FICI &lt; 4 表示无关作用，FICI &gt; 4 表示拮抗作用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 形态学研究
<ol>
	<li>在含有1.5% Bacto琼脂的Luria-Bertani（LB）琼脂平板（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl）上于37 °C培养Bacillus subtilis 11774。所有实验均使用在5 mL LB肉汤中于37 °C培养至OD600 = 1的第二代细胞。以与步骤4.1相同的方式培养S. pneumoniae。</li>
	<li>当B. subtilis的菌液密度达到OD600nm = 1，或S. pneumoniae达到OD600nm = 0.4时，用移液器向标记为“处理组”的培养管中加入masarimycin，终浓度为3.8 µM（B. subtilis MIC的0.75倍），或5.85 µM（S. pneumoniae MIC的0.75倍）。向标记为“对照组”的另一培养管中加入等体积的DMSO。</li>
	<li>对于B. subtilis，将样品置于37 °C、150 rpm振荡的培养箱中孵育90分钟。对于S. pneumoniae，在厌氧条件下静置孵育细胞。</li>
	<li>孵育90分钟后，将培养物与固定液按1:10（v/v）比例混合（培养基与固定液），在4 °C下过夜化学固定。固定完成后，用移液器取10–20 µL样品滴加至玻璃载玻片上，使其自然风干。随后使用本生灯加热载玻片，对风干样品进行热固定。</li>
	<li>热固定后，加入100 µL 0.1%（m/v）亚甲蓝染色液（溶于20%（v/v）乙醇中）对样品进行染色。染色孵育10分钟后，用dH2O洗去多余染料。然后将染色后的载玻片置于烘箱中，轻轻加热至60 °C，持续15–20分钟，使细胞处于同一焦平面。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在染色后的样品上以封片，再使用显微镜载玻片封固剂密封边缘。将封好的载玻片置于显微镜载物台上，使用明场显微镜在100倍放大倍数下调节焦距，获得清晰图像。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴镜油，使用1000倍放大倍数调节视野焦距。通过连接显微镜的相机及其配套软件采集显微图像。使用软件中的自动白平衡和光圈设置进行图像采集。 
	注：也可使用开源的ImageJ软件对图像进行后续处理。</li>
</ol>

Reid, C. W. 拥有与马萨里霉素特定应用相关的知识产权。

马萨里霉素是一种对B. subtilis35 和 S. pneumoniae37生长具有单微摩尔级抑菌活性的抑制剂。在B. subtilis中，已证实马萨里霉素可抑制GlcNAcase LytG35，而在S. pneumoniae细胞壁中的确切分子靶点尚未被确定37。采用经典有机合成或微波法合成马萨里霉素，均可获得较高产率和高纯度的产物。马萨里霉素产率偏低通常归因于环己基甲醛的氧化。为避免此问题，建议将环己基甲醛在惰性气氛下的干燥器中保存。醛基氧化为相应的羧酸时，可在瓶中观察到白色固体。购买小量环己基甲醛并避免长期储存，可显著减少该问题的发生。
由于存在混合物，马萨里霉素结构的核磁共振归属较为复杂 顺式 和 转 酰胺键的不同形式以及其周围的阻转异构体 o-碘苯基&#160;环结构导致多个...

肽聚糖（PG）是一种网状聚合物，在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均能界定细胞的形态与结构1,2该杂聚物是由短肽交联的氨基糖组成的基质。3,4,5,6 由交替连接的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）通过β-(1,4)糖苷键组成的骨架结构（图1)1连接在MurNAc的C-3乳酸基团上的是肽桥。肽聚糖的代谢涉及一套高度协调的生物合成与降解酶系统，以将新组分整合到细胞壁中7,8PG的降解由一类统称为自溶素的酶来完成9 并根据所断裂的化学键特异性进一步分类。自溶素参与多种细胞过程，包括细胞生长、细胞分裂、运动性、肽聚糖成熟、趋化性、蛋白质分泌、遗传感受态、分化以及致病性10,11. 阐明单个自溶素特定生物学功能具有相当挑战性，部分原因在于其功能上的冗余性。然而，近年来的生物物理研究8,12,13 和计算研究12 为PG代谢中的作用提供了新的见解。此外，近期研究报告进一步揭示了其合成过程14 以及膜介导的15,16,17 PG代谢的步骤。深入理解PG代谢中降解途径与合成途径之间的关系，可能揭示此前尚未开发的抗生素作用靶点。
尽管真核生物糖生物学的研究方法已取得显著进展，但细菌糖生物学、特别是肽聚糖（PG）代谢的研究进展却相对缓慢。目前研究PG代谢的化学方法包括荧光标记抗生素18、荧光探针19,20以及代谢标记21,22,23,24。这些新方法为研究细菌细胞壁代谢提供了新的途径。尽管其中一些策略能够实现PG的活体（in vivo）标记，但它们可能具有物种特异性19，或仅适用于缺失特定自溶素的菌株25。许多PG标记策略旨在用于分离的细胞壁26或体外（in vitro）重建的PG生物合成通路20,27,28。目前，荧光标记抗生素的应用仅限于生物合成步骤和转肽作用18。
当前对细菌自溶素及其在细胞壁代谢中作用的认识主要来源于遗传学和 体外 生化分析11,29,30,31,32尽管这些方法为研究这一重要类别的酶提供了大量信息，但解析其生物学功能仍具挑战性。例如，由于功能冗余33，尽管自溶素在细胞生长和分裂中具有重要作用，但在大多数情况下，缺失自溶素并不会阻止细菌生长。7,12另一个复杂之处在于，细菌自溶素的基因敲除可能引发元表型34元表型源于基因缺失所影响的通路与其他相互关联通路之间复杂的相互作用。例如，元表型可能由此产生 通过 直接效应，例如某种酶的缺失，或间接效应，例如调控因子的破坏。
目前，可用于研究肽聚糖（PG）降解的糖苷酶自溶素（如N-乙酰葡糖胺酶（GlcNAcase）和N-乙酰胞壁酸酶）的抑制剂非常有限。为解决这一问题，已鉴定并表征了一种二酰胺类化合物——马萨里霉素（masarimycin，曾称为fgkc）35，其为一种抑菌性抑制剂，可抑制Bacillus subtilis的生长，作用靶点为GlcNAcase LytG32（图1）。LytG是一种外切型GlcNAcase36，属于糖基水解酶家族73（GH73）中的第2簇成员，在营养生长期是主要的活性GlcNAcase32。据我们所知，马萨里霉素是首个可抑制细胞生长的、作用于肽聚糖的GlcNAcase抑制剂。对马萨里霉素在Streptococcus pneumoniae中的进一步研究表明，该化合物可能也抑制该生物体的细胞壁代谢过程37。本文报道了马萨里霉素的制备方法，以便将其作为化学生物学探针，用于研究革兰氏阳性菌B. subtilis和S. pneumoniae的生理特性。文中展示了在亚最低抑菌浓度下使用马萨里霉素处理后的形态学分析示例，以及协同/拮抗作用检测方法。利用作用机制明确的抗生素进行协同与拮抗试验，是探索细胞内不同生理过程之间关联的有效手段38,39,40。

<table><tbody><tr><td>2-碘苯甲酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>腐蚀性，刺激性，浅黄色至橙棕色粉末</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>易燃，刺激性，无色液体</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td><td>易燃，刺激性，无色液体</td></tr><tr><td>铝背板硅胶板</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>铝背板上的XG F254硅胶</td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>核磁共振溶剂</td></tr><tr><td>紧凑型质谱仪</td><td>Advion-Interchim</td><td>Advion CMS</td><td>配备APCI离子源和常压固体分析探针的紧凑型质谱仪</td></tr><tr><td>Corning Costar 96孔平底培养板-无菌</td><td>fisher chemical</td><td>07-200-90</td><td>用于协同/拮抗作用检测</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>fisher chemical</td><td>12-547</td><td>用于显微镜观察</td></tr><tr><td>环己烷甲醛</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td><td>易燃，刺激性，无色至粉红色液体</td></tr><tr><td>环己基异氰化物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>刺激性，无色液体，具有极难闻的气味</td></tr><tr><td>环己胺</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>腐蚀性，易燃，刺激性，无色液体（除非被污染）</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>易燃，刺激性，无色液体</td></tr><tr><td>闪式硅胶柱（12g）</td><td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>用于masarimycin纯化的闪式硅胶柱（12g）套装</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>显微镜固定剂</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>显微镜固定液用缓冲剂</td></tr><tr><td>己烷，异构体混合物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>对环境有害，易燃，刺激性，危害健康，无色液体</td></tr><tr><td>高性能紧凑型质谱仪</td><td>Advion</td><td>expression</td><td>常压固体分析探针（ASAP），低分辨率</td></tr><tr><td>High Vac</td><td>eppendorf</td><td>Vacufuge plus</td><td>利用离心力和温度辅助的真空系统</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>腐蚀性，刺激性，无色液体</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td><td>强酸</td></tr><tr><td>浸油</td><td>fisher chemical</td><td>12-365-19</td><td>用于显微镜观察</td></tr><tr><td>碘，重升华晶体</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>对环境有害，刺激性，危害健康，深灰色/紫色晶体</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>核磁共振谱图处理软件</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>易燃，有毒，危害健康，无色液体</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>用于细胞壁染色的显微镜染料</td></tr><tr><td>含5%绵羊血的Mueller-Hinton琼脂平板</td><td>fisher chemical</td><td>B21176X</td><td>肺炎链球菌的培养基</td></tr><tr><td>Mueller-Hinton肉汤</td><td>fisher chemical</td><td>DF0757-17-6</td><td>肺炎链球菌的培养基</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>fisher chemical</td><td>22-310397</td><td>用于显微镜观察</td></tr><tr><td>微波合成实验室工作站</td><td>MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>需在通风橱中使用的设备，配备合成转盘</td></tr><tr><td>核磁管</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>5 mm 核磁管，600 MHz</td></tr><tr><td>核磁共振（NMR）</td><td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>大型超导磁体（400 MHz）</td></tr><tr><td>奥普托欣</td><td>fisher chemical</td><td>AAB21627MC</td><td>盐酸乙基氢可酮</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Celltreat</td><td>229695</td><td>用于制备细菌培养用琼脂平板</td></tr><tr><td>Primo Star明场/相差显微镜，配备ERc5s相机</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于形态学研究</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>快速色谱纯化系统</td></tr><tr><td>刃天青</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>用于协同/拮抗作用检测</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Value &quot;The Collegiate&quot;</td><td>溶剂蒸发装置</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>刺激性，白色粉末</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>fisher chemical</td><td>S271-1</td><td>晶体状，无色</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备</td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>无水，颗粒状，白色</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>fisher chemical</td><td>BP1421-500</td><td>用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备</td></tr><tr><td>Whitney DG250工作站</td><td>Microbiology International</td><td>DG250</td><td>厌氧工作站。使用的厌氧气体混合物：5% 氢气，10% 二氧化碳，其余为氮气</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>fisher chemical</td><td>BP1422-500</td><td>用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备</td></tr><tr><td>Zen Lite（蓝色）软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于获取显微图像</td></tr></tbody></table>

masarimycin的合成：一种革兰氏阳性菌生长的小分子抑制剂

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

细菌细胞壁中的肽聚糖（PG）是一种独特的高分子结构，赋予细胞特定形态并提供对外界环境的保护。要理解细胞生长与分裂，关键在于了解PG降解如何影响其生物合成及细胞壁组装过程。近年来，已有通过引入修饰的糖类或氨基酸对PG进行代谢标记的研究报道。尽管可利用小分子抑制剂对生物合成步骤进行化学干预，但用于研究自溶素介导的PG降解的化学生物学工具仍较为匮乏。细菌自溶素是一类广泛存在的酶，参与肽聚糖高度协调的降解过程。本文提供了一种小分子探针masarimycin的详细制备方案，该探针为N-乙酰葡糖胺酶LytG的抑制剂 枯草芽孢杆菌， 以及细胞壁代谢在 肺炎链球菌抑制剂的制备 通过 提供了微波辅助与经典有机合成方法。阐述了其作为研究革兰氏阳性菌在生物学测定中生理学特性的工具的适用性。

马萨里霉素是一种小分子抑菌剂，可抑制 B. subtilis 和 S. pneumoniae 并已被证明可抑制外切型GlcNAcase LytG B. subtilis35,37 并靶向细胞壁 S. pneumoniae37马萨里霉素可通过经典有机合成或微波辅助有机合成方法高效制备，产率范围为55%–70%。其中，微波辅助合成具有显著缩短反应时间的优势。与传统合成方法需5–6小时相比，微波辅助合成可在2–3小时内完成，同时保持相当的产率。快速柱层析可实现马萨里霉素的高效纯化，获得高纯度产物。补充图1-2）。结构归属来自 1H 和 13C NMR 谱图及代表性谱图见于 补充图3-4.
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本文提供了一种制备抑菌性二酰胺类化合物马萨里霉素的详细方案，该小分子探针通过靶向细胞壁降解来抑制枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的生长。文中展示了其作为化学探针在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和肺炎链球菌（S. pneumoniae）中的协同/拮抗作用实验及形态学研究中的应用。

Masarimycin的合成：一种革兰氏阳性菌生长的小分子抑制剂

细菌细胞壁中的肽聚糖（PG）是一种独特的高分子结构，赋予细菌特定形态，并提供对周围环境的保护。

马萨里霉素是少数能够抑制细菌自溶素并阻断细菌细胞生长的抑制剂之一。它可用于研究化学失活与遗传失活自溶素之间的差异，并为研究细菌生理学提供了遗传学之外的正交研究手段。马萨里霉素的合成可能看似困难。严格遵循所示步骤。若对某一步骤反应是否成功存疑，应通过薄层色谱法及Rf值的变化进行确认。首先，分别在甲醇中配制0.1摩尔的环己胺、环己基甲醛、邻碘苯甲酸和环己基异氰化物溶液。加入磁力搅拌子，然后在带盖的圆底烧瓶中混合5 mL环己胺和5 mL环己基甲醛，并将烧瓶置于加热磁力搅拌器的沙浴中，在40 °C下搅拌30分钟。将温度计置于沙表面下方约1 cm处以监测温度。30分钟后，向溶液中加入5 mL环己基异氰化物，并在50 °C下继续搅拌20分钟。然后，向反应混合物中加入5毫升邻碘苯甲酸，在55摄氏度下继续搅拌3至5小时。搅拌3小时后，通过薄层色谱法（TLC）每约一小时定期监测反应进程。当TLC板上仅出现一个保留因子为0.3的斑点时，可认为反应已完成。在减压条件下用旋转蒸发仪除去溶剂。待甲醇完全蒸发后，将干燥的粗产物溶于30毫升乙酸乙酯中，并转移至分液漏斗。依次用1摩尔盐酸、水、饱和碳酸氢钠溶液、水以及饱和氯化钠溶液萃取乙酸乙酯相，每次萃取后弃去水相。然后，将分液漏斗中的乙酸乙酯层移除，并收集到锥形瓶中。加入一药匙无水硫酸钠以除去乙酸乙酯中的残留水分。将干燥后的乙酸乙酯溶液通过一号滤纸过滤，以除去硫酸钠。然后，用少量乙酸乙酯洗涤滤纸。将滤过的乙酸乙酯溶液在减压条件下用旋转蒸发仪蒸干，待乙酸乙酯完全去除后，得到油状的masarimycin。将masarimycin油溶于1至2毫升正己烷与异丙醇体积比为9:1的溶液中，并在磁力搅拌器上搅拌，直至整个化合物完全溶解。为了纯化溶解的masarimycin，使用12克正相硅胶快速柱进行快速色谱。用10倍柱体积的流动相平衡快速柱，仪器流速设定为每分钟15毫升。平衡完成后，用5毫升注射器吸取溶解的masarimycin。将注射器直接连接至已平衡的快速色谱柱顶部，并将溶液注入色谱柱中。将上样后的色谱柱重新连接至快速色谱系统，启动梯度洗脱。采用梯度洗脱法，以12个柱体积将流动相最终浓度逐渐调整至10:90的正己烷-异丙醇体系，从而将马萨里霉素从色谱柱中洗脱出来。通过在 230 和 254 纳米处的吸收值监测马萨里霉素的洗脱情况。进行形态学研究时，在 LB 琼脂平板上于 37 摄氏度培养枯草芽孢杆菌 11774。在所有后续实验中，使用在 5 毫升 LB 液体培养基中培养至 600 纳米处光密度达到 1 的第二代细胞。接下来，使用移液器将masarimycin加入标记为处理组的培养管中，使其终浓度为3.8微摩尔。对于标记为对照组的培养管，加入等体积的DMSO。将样品置于37摄氏度摇床中孵育90分钟，转速为150 RPM。90分钟后，在4摄氏度条件下，用培养基与固定缓冲液按1:10比例配制的混合液对培养物进行化学固定，过夜。次日，使用移液器将10至20微升化学固定的样品滴加到玻璃显微镜载玻片上，使其自然风干。随后，用本生灯加热玻璃片，对风干后的样品进行热固定。热固定后，用100微升0.1%亚甲蓝对样品进行染色。染色孵育10分钟后，用蒸馏水洗去多余的染料。然后，将染色后的玻片置于烘箱中，轻轻加热至60摄氏度，持续15至20分钟，使细胞处于同一焦平面。将盖玻片盖在染色后的细胞上，封固染色样本。然后使用显微镜载玻片封片剂密封边缘。将封固好的载玻片置于显微镜载物台上，利用明场显微镜在100倍放大倍数下调节焦距，使图像清晰。在显微镜载玻片上滴加一滴镜油，使用1000倍放大倍数将视野调至清晰。通过连接显微镜的相机及其配套软件采集显微图像。使用软件的自动白平衡和光圈设置来获取图像。快速色谱法可实现对马萨里霉素的快速纯化，并获得高纯度产物。本文展示了在肺炎链球菌中，该化合物与ATP酶抑制剂奥普托欣联用时协同或拮抗作用的评估结果。在联合用药条件下，能够抑制细菌生长（以蓝色显示）的最低化合物浓度被视为最小抑菌浓度值。相比之下，呈粉红色的孔表明有细菌生长。使用最小抑菌浓度0.75倍的马萨里霉素进行的表型实验显示，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）呈现香肠样表型，而肺炎链球菌（S.pneumoniae）则呈现聚集表型。请注意反应温度。通过薄层色谱（TLC）监测以确保反应完全。该方法可与荧光标记的抗生素联用，通过显微镜观察研究细胞壁的变化。

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马萨霉素的合成，一种革兰氏阳性细菌生长的小分子抑制剂

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异源天然产物生物合成的原理、实验步骤及其潜力：以大肠杆菌（E. coli）合成复杂抗生素红霉素A为例

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从天然产物到其生物合成基因簇：以Streptomyces diastatochromogenes Tü6028中多酮霉素为例的演示

本文建立并描述了一种由质谱引导的基因组挖掘方案。该方案基于基因组序列信息和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，旨在促进从复杂的微生物和植物提取物中鉴定分子。...

质谱引导的基因组挖掘作为发现新型天然产物的工具

本文介绍了一种利用3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的生物测定法，用于测试先前合成的螺环肟类化合物。...

功能化螺环杂环化合物的合成及细胞毒性检测

噻吩磺酰胺类化合物是高效且特异性的抑制剂 弧菌 群体感应调控因子LuxR/HapR，可阻断其活性 体内从而抑制毒力、运动性和生物膜相关基因的转录。本方案详细描述了这些化合物的合成与建模方法 计算机模拟，并进行检测 体内 针对 LuxR/HapR...

弧菌群体感应抑制剂的合成与检测

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

本研究建立了一种用于高通量筛选的检测方法 脓肿分枝杆菌...

抗分枝杆菌高通量药物筛选的检测方法开发

本方案介绍了一种优化的荧光检测筛选方法，用于鉴定天然产物/小分子蛋白合成抑制剂。该方法具有良好的实用性，既适用于本科生药物发现技术的教学，也适用于药物化学研究项目的实施。...

一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

本方案描述了一种制备并评估阳离子肽Mel4及肽模拟物RK758的抗菌活性与细胞毒性的方法。通过整合化学合成、重组表达及标准化功能检测，该方法为肽类分子及小分子模拟物的制备与测试提供了简化的操作流程。...

抗菌肽及其模拟物的制备与检测

本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。...

潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

学习马萨霉素的合成方法，这是一种抑制革兰氏阳性细菌生长的小分子化合物。本方案详细演示了针对枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌的合成步骤、薄层色谱验证及形态学应用。

Masarimycin的合成：一种革兰氏阳性菌生长的小分子抑制剂

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