Name: 量子点偶联SARS-CoV-2穗状三聚体的高通量共聚焦成像，以追踪HEK293T细胞中的结合和内吞作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解量子点偶联SARS-CoV-2刺突蛋白的高通量共聚焦成像技术，用于追踪HEK293T细胞中的病毒结合与内吞过程。该方法可实时监测病毒入侵机制，为抗病毒药物筛选提供新平台。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院转化科学促进中心院内研究计划的支持。海军研究实验室提供了资金资助 通过 其内部的纳米科学研究所。试剂制备得到了支持 通过 NRL 新冠肺炎基础基金

本研究中使用的 HEK293T 细胞系是一种永生化细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。
1. 细胞培养与接种
<ol>
	<li>在无菌生物安全柜内，穿戴个人防护装备（包括实验手套、实验服和护目镜），通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和250 µg/mL G418，配制细胞培养基。
	<ol>
		<li>配制500 mL培养基时，加入443.75 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL P/S和1.25 mL G418。</li>
		<li>使用0.2 µm滤膜滤瓶过滤，并保持无菌状态，避免细菌污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌生物安全柜内，将20,000个细胞悬浮于100 µL细胞培养基中，接种至黑色、透明底、聚-D-赖氨酸包被的96孔板的内部60个孔中；在外部36个孔中每孔加入100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
	<ol>
		<li>细胞计数时，向18 µL细胞悬液中加入2 µL吖啶橙和碘化丙啶染色剂。</li>
		<li>取10 µL该溶液加入细胞计数载片的一侧加样区。</li>
		<li>重复步骤1.2.1和1.2.2，使载片两侧均完成加样。</li>
		<li>将载片放入自动细胞计数仪中。</li>
		<li>选择荧光计数程序，点击计数。对载片两侧进行计数，并计算两个活细胞密度的平均值。</li>
		<li>计算所需细胞悬液体积：将所需细胞总数除以平均细胞密度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种后在光学显微镜下检查各孔，确保达到适当的细胞密度和均匀分布。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中过夜培养。</li>
</ol>
2. 使用 QD-Spike 处理细胞
<ol>
	<li>通过成像培养基稀释，制备0.1%牛血清白蛋白（BSA）。
	<ol>
		<li>对于10 mL成像培养基，加入130 µL的7.5% BSA并混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在12孔储液槽或检测板中，使用含0.1% BSA的成像培养基将440 nM QD-Spike（SARS-CoV-2，分离株USA-WA1/2020）储备液稀释至20 nM。
	<ol>
		<li>对于1个孔的QD-Spike，将2.27 µL的440 nM QD-Spike加入47.73 µL含0.1% BSA的成像培养基中，终浓度为20 nM。</li>
		<li>进行六点1:3倍比稀释（每点设三个重复），将14.26 µL QD-Spike加入285.74 µL含0.1% BSA的成像培养基中，配制最高浓度20 nM的溶液；取100 µL 20 nM QD-Spike加入200 µL含0.1% BSA的成像培养基中，得到第二浓度点6.67 nM QD-Spike；重复此步骤四次，共获得六个浓度点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多通道移液器吸除各孔中的全部废弃培养基；使用多通道移液器用成像培养基洗涤一次（每孔100 µL）。</li>
	<li>吸除每孔100 µL成像培养基，再向每孔回加50 µL QD-Spike溶液。</li>
	<li>将板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育3小时。随后进入第4步。</li>
</ol>
3. 固定与细胞核染色
<ol>
	<li>在无菌生物安全柜内，穿戴个人防护装备（包括实验手套、实验服和护目镜），用含0.1% BSA的成像培养基配制4%多聚甲醛（PFA）溶液。</li>
	<li>从每个孔中吸出50 µL QD-Spike溶液，并向每孔加入100 µL的4% PFA。
	<ol>
		<li>切勿让孔板干燥。建议使用自动化多通道移液器以避免孔内液体干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>室温孵育15分钟。</li>
	<li>用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。</li>
	<li>将5 mM的深红色核染料原液用PBS稀释1000倍，配制工作液。</li>
	<li>吸去PBS，每孔加入50 µL稀释后的核染料。</li>
	<li>室温孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤三次。</li>
	<li>立即成像或使用板封膜密封后于日后成像。将板置于4 °C保存，荧光信号可稳定数周以上。</li>
</ol>
4. 采集设置与成像
<ol>
	<li>启动成像平台的软件。打开高内涵成像平台，状态栏上的指示灯应亮起。如果设备未连接，软件将进入离线分析模式。</li>
	<li>登录成像平台。</li>
	<li>创建新的采集方案。
	<ol>
		<li>选择板类型 为96孔透明底成像板。 
		注意：仪器中的板类型选择可能有所不同，可通过加载正确的板定义进行自定义，这些定义包括板的尺寸参数，如高度、宽度及其他用于定义孔间距和焦点位置的距离。</li>
		<li>选择光学模式为共聚焦，放大倍数为40倍水浸物镜。</li>
		<li>选择像素合并（Binning）为1。</li>
		<li>按照步骤4.3.5–4.3.8所述选择通道及荧光激发/发射波长。设置完成后拍摄快照以查看图像，并确保设置合适。 
		注意：数字相差成像（DPC）可在无需细胞染色或荧光染料的情况下实现活细胞的可视化。不建议用于固定细胞。</li>
		<li>为DPC选择合适的模式，例如高对比度模式，以获得轮廓清晰的细胞形态。拍摄快照以确认该设置是否合适，可通过图像窗口进行观察。</li>
		<li>选择FITC通道，用于ACE2-GFP细胞系，以便可视化细胞内ACE2的转运过程。</li>
		<li>若需为量子点（QD）通道创建自定义通道，请点击该通道的三角形下拉菜单，选择激发波长在405 nm范围、发射波长在608 nm范围的设置。</li>
		<li>若细胞已固定并使用了深红色核染料，则选择远红通道，其发射波长大于630 nm，可用于进一步界定细胞轮廓并作为细胞掩膜。</li>
		<li>选择一个具有较强胞质QD信号的孔，用于设定曝光时间、激光功率和Z轴高度位置。请参照步骤4.3.10–4.3.13进行操作。</li>
		<li>检查默认高度是否能生成细胞处于理想焦平面的图像。若目标细胞器为内吞的点状结构，则Z轴位置应低于以质膜为目标细胞器时的位置。</li>
		<li>选择一个曝光时间，使图像明亮，且灰度值至少为背景信号的三倍以上。通常该时间在100至300 ms之间。在20 nM浓度下，使用200 ms曝光时间和80%激光功率时，灰度值应约为6000 a.u.。</li>
		<li>通过在各通道使用“快照”功能生成的图像上右键单击，并选择显示强度，来检查灰度值。然后左键单击目标对象或背景区域，查看对应像素的灰度值。</li>
		<li>调节激光功率，以微调目标对象的强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存采集方案。</li>
	<li>切换至运行实验，并输入板名称。</li>
	<li>运行实验。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>将数据导入成像软件。
	<ol>
		<li>获取所有图像后，将测量结果导出至成像软件。此过程需要预先建立服务器并创建账户。创建一个屏幕用于将数据导出到成像软件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在成像软件中，选择 图像分析 以开始构建分析方案。</li>
	<li>通过在屏幕列表中右键单击文件并点击 选择，加载成像实验的测量数据。成像孔及其对应视野的板图应显示在窗口左下角。</li>
	<li>选择一个细胞质中具有明亮量子点（QD）信号的孔，以开始图像分割。</li>
	<li>在 输入图像模块 中，选择 平场校正。</li>
	<li>通过选择 识别细胞核，向方案中添加下一个模块。
	<ol>
		<li>此处使用DPC或远红通道作为细胞核标记。</li>
		<li>首先选择能够准确分割目标的方法，然后通过下拉菜单和滑块调节进一步优化分割效果。 
		注意：良好的分割应能准确定义细胞核、细胞和斑点的兴趣区域（ROI）。每个ROI内仅应包含标记物阳性的像素，背景信号应被排除。若ROI中包含了背景信号，可降低方法的灵敏度或提高强度阈值，以增强分割算法的严谨性。此原则适用于所有“识别”模块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，添加 识别细胞质模块 以确定细胞质区域。
	<ol>
		<li>在此情况下，使用ACE2-GFP通道进行细胞质分割。</li>
		<li>选择最能准确识别每个细胞细胞质的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随后，添加 识别斑点模块 以识别量子点-刺突蛋白（QD-Spike）点状信号。
	<ol>
		<li>选择 细胞核 作为ROI群体。</li>
		<li>选择 细胞 作为ROI区域，以捕获整个细胞内的点状信号。</li>
		<li>选择最能准确识别每个细胞中量子点斑点的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当该孔中所有目标均被准确分割和识别后，选择其他孔进行验证，以确保所用模块和参数设置可普遍适用于其他孔及其他实验条件。</li>
	<li>为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算强度属性。</li>
	<li>为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算形态学属性。</li>
	<li>为所有已分割的目标（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 计算纹理属性。</li>
	<li>通过为各群体（包括细胞核和斑点）选择相应参数来定义结果。目标数量可作为细胞活力的间接衡量指标。</li>
</ol>
6. 导出数据
<ol>
	<li>单击批量分析。在进入下一步（步骤6.2）之前，请等待分析完成。 
	注意：批量分析允许图像分析软件服务器加载分析协议，并使用选定的测量参数对数据进行远程分析。</li>
	<li>将数据集导出到本地计算机或网络驱动器。
	<ol>
		<li>通过下载并打开连接文件，将图像分析软件与计算机上的辅助应用程序连接。</li>
		<li>选择结果文件类型（.txt、.csv、.html 或原生 XML）。</li>
		<li>使用下拉菜单选择文件夹设置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 在电子表格中分析数据
<ol>
	<li>打开导出的文件。如果文件为 .csv 格式，请将其另存为 .xls 文件格式，以便使用数据透视表。如果文件路径过长，请将 .xls 文件保存在文件夹层级结构中更上层的位置，以避免保存时出错。</li>
	<li>在电子表格中添加列，用于标明每个孔的实验条件。例如，细胞类型、QD-Spike 变体、QD-Spike 浓度、孵育时间等。</li>
	<li>选择数据透视表功能，并以添加的条件作为行，以测量参数作为列来构建表格。为每个参数选择相应的计算方式，例如平均值、标准差、中位数、最小值、最大值或计数。</li>
	<li>将数据归一化至对照样本，其中未结合的量子点（QDs）设为 0%，最高浓度的 QD-Spike 设为 100%。 
	注意：若评估中和抗体等抑制剂的效果，应将数据归一化至仅含培养基处理的细胞（100% 效能）和不含抑制剂的 QD-Spike 处理组（0% 效能）。</li>
	<li>使用绘图软件绘制数据图表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方法提供了使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中功能化量子点（QDs）进行成像的必要步骤。该方法最适合用于以内吞作用为主要病毒入侵途径而非依赖TMPRSS2和膜融合的细胞，因为它能够研究SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）与hACE2的内吞过程。由于量子点模型的特性以及商品化刺突三聚体上存在的C端His标签，任何由TMPRSS2对刺突蛋白S1和S2结构域的切割都将导致量子点仅保留在S2结构域上12。鉴于受体结合域（RBD）位于S1中，这可能会阻止内化过程的发生。因此，如果细胞表面事件的顺序是精确发生的，即hACE2首先结合，随后TMPRSS2切割刺突蛋白，则预期结果为无内化现象的阴性信号。
由于本实验方案涉及细胞过程的成像，培养的细胞必须能够允许病毒感染，并表达hACE2。可通过瞬时转染将hACE2导入细胞，或构建稳定表达hACE2的细胞系17。建议使用抗hACE2抗体进行免疫荧光实验，以验证hACE2的表达与定位，除非hACE2带有荧光蛋白标签（如GFP），可在显微镜下直接观察...

荧光显微镜技术使研究人员能够利用特异性染料观察细胞内部的精细结构与动态过程1，基因编码的荧光蛋白2，以及以量子点（QDs）形式存在的荧光纳米颗粒3对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）的全球大流行，研究人员已采用荧光显微镜技术来研究该病毒在细胞质膜和细胞质中与细胞相互作用的机制。例如，研究人员已能够深入了解病毒颗粒表面的SARS-CoV-2刺突蛋白与人源血管紧张素转换酶2（hACE2）在人细胞表面的结合过程以及随后的内化过程 通过 质膜融合，以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用4,5对SARS-CoV-2从细胞中出胞的过程也获得了重要见解 通过 利用细胞荧光成像技术观察冠状病毒特有的一种此前被认为存在的溶酶体特征 通过 传统的高尔基体囊泡出芽方式，与其他许多病毒相同6细胞荧光显微技术作为几乎所有生物学研究领域的核心技术，其应用范围和广度已不断拓展，从全动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动化高内涵多参数成像均有涉及。本文采用自动化高内涵共聚焦显微技术，结合荧光量子点标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白，研究该病毒的细胞入侵过程。
利用生物成像平台生成的图像进行高内涵分析，能够比使用多模式微孔板读数仪获得的单个参数（如整孔荧光强度）提取出更多有价值的生物学信息7。通过使用自动分割算法对视野中的对象进行分离，可针对每个对象或对象群体，在各可用的荧光通道中分析其强度、面积和纹理等参数8。将多个测量指标整合为多变量数据集，是进行表型分析的有效方法。当目标表型明确时，例如以点状结构形式存在的量子点（QD）内化现象，可利用与点状结构相关的参数（如大小、数量和强度）来评估处理措施的有效性。
基于云的高内涵成像分析软件可兼容多种仪器数据输出，包括高内涵成像平台。通过使用基于云的服务器进行图像存储和在线分析，用户可以从成像仪器或数据存储的网络驱动器上传其数据。该实验方案的分析部分在云软件环境中进行，分析结果可导出为多种文件格式，用于后续的数据可视化。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）由非结构蛋白和结构蛋白组成，这些蛋白有助于病毒的组装与复制。SARS-CoV-2刺突蛋白包含两个结构域，称为S1和S2，其中S1含有受体结合域，负责与细胞质膜上的hACE2相互作用9。研究还发现，刺突蛋白可与细胞质膜上的其他分子相互作用，这些分子可能作为除hACE2之外的共受体10,11。在整个刺突蛋白序列中，特别是在S1/S2交界区域，存在蛋白酶切割位点，可在跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）作用下实现膜融合12。目前已有多种重组SARS-CoV-2刺突蛋白产品，包括来自不同商业供应商的单独受体结合域、S1、S2、S1+S2以及完整的刺突三聚体蛋白，用于科研活动13。
在本研究中，量子点（QD）表面被修饰以含有组氨酸标签的重组刺突蛋白三聚体（QD-Spike）。美国海军研究实验室光学纳米材料部门制备的量子点具有硒化镉核心和硫化锌外壳14,15。量子点表面的锌可与重组蛋白中的组氨酸残基配位，形成在形态和功能上均模拟SARS-CoV-2病毒颗粒的功能化量子点。此前已有文献描述过利用量子点偶联受体结合域制备此类纳米颗粒及蛋白偶联的方法15。本方法详细说明了细胞培养准备、量子点处理、图像采集以及数据分析的实验流程，可指导研究人员在人源细胞的生理环境中研究SARS-CoV-2刺突蛋白的活性。

<table><tbody><tr><td>32% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>用于量子点处理后细胞的固定，终浓度为 3.2%&lt;br/&gt; 用于在Opti-MEM I中稳定量子点并防止非特异性相互作用，终浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>7.5% 牛血清白蛋白</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>用作荧光细胞计数的细胞活力染料</td></tr><tr><td>吖啶橙/碘化丙啶染色剂</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>用于接种细胞和检测QD-Spike的微孔板</td></tr><tr><td>黑色透明底96孔聚-D-赖氨酸包被板</td><td>Greiner</td><td>655946</td><td>用于支持细胞培养，DMEM补充剂</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>Cytiva/HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>基于云的高内涵图像分析软件；V2.9.1</td></tr><tr><td>Columbus Analyzer</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>用于细胞固定后细胞核和细胞体的标记，深红色核染料</td></tr><tr><td>DRAQ5 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62252</td><td>HEK293T细胞培养的基础培养基</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良必需培养基，D-葡萄糖（4.5g/L），L-谷氨酰胺，丙酮酸钠（110 mg/L），酚红</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>用于从Columbus导出数据后的数据整理；V2110 Microsoft 365</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>用于继续筛选hACE2-GFP阳性细胞，DMEM补充剂</td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-gn-5</td><td>稳定表达与GFP标记的人血管紧张素转换酶2的HEK293T人胚胎肾细胞系</td></tr><tr><td>HEK293T hACE2-GFP</td><td>Codex Biosolutions</td><td>CB-97100-203</td><td>全自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>Luna全自动细胞计数仪</td><td>Logos Biosystems</td><td>NA</td><td>用于荧光细胞计数</td></tr><tr><td>Luna细胞计数载片</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>高内涵成像平台</td></tr><tr><td>Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>成像培养基，用于细胞与量子点共孵育</td></tr><tr><td>Opti-MEM I减血清培养基</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液，用于传代和检测过程中细胞的洗涤</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>用于防止细胞培养中的细菌污染，DMEM补充剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>用于作图、数据可视化和统计分析；V9.1.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合及刺突蛋白内吞的监测</td></tr><tr><td>量子点608 nm-刺突蛋白（QD&lt;sub&gt;608&lt;/sub&gt;-Spike）</td><td>由美国海军研究实验室定制</td><td></td><td>用于抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40592-MM57</td><td>用于传代过程中使细胞从培养瓶中解离</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的sars-cov-2刺突蛋白三聚体在hek293t细胞中的结合与内吞过程

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

新型细胞荧光显微技术的发展推动了药物发现领域的高通量筛选方法。量子点是一类具有优异光物理特性的荧光纳米颗粒，表现出明亮且稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形结构，通过适当修饰其表面化学性质，可实现与生物分子的偶联，用于细胞相关应用。这些光学特性，结合其与生物分子功能化的能力，使其成为研究受体-配体相互作用和细胞内转运过程的理想工具。本文介绍一种利用量子点追踪SARS-CoV-2刺突蛋白结合与内吞作用的方法。本实验方案可为希望利用量子点研究蛋白质-蛋白质相互作用及其在细胞生理环境下转运过程的实验人员提供参考指南。

经处理后，量子点（QDs）将被细胞内化，因为纳米颗粒会与细胞质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。利用表达ACE2-GFP的细胞系，可通过荧光显微镜观察量子点与ACE2的转位过程。内化后，量子点与ACE2的信号表现出强烈的共定位。基于这些图像，可进行图像分割及后续分析，以提取相关参数，例如斑点数量（图1，图2B）。图1A展示了用不同浓度的QD-Spike处理的细胞或仅使用培养基作为对照的细胞拼接图像。实验使用了三个通道，包括数字相差（DPC）、异硫氰酸荧光素（FITC）以及定制的量子点通道（激发波长405 nm，发射波长608 nm）。DPC提供细胞整体形态的图像，可大致反映整个细胞的形态结构。感兴趣区域与DPC信号重叠，足以用于检测内化的量子点。FITC通道显示ACE2-GFP的定位发生改变，并在与QD-Spike共定位的区域发生聚集。随着QD-Spike浓度降低，量子点不再可见，ACE2-GFP信号与对照组相似。合并通道展示了ACE2-GFP与QD-Spik...

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2 的结合，以及随后结合蛋白内吞进入细胞质的过程。

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

新型细胞荧光显微技术的发展推动了药物发现领域的高通量筛选方法。量子点……

我们已建立了一种针对SARS-CoV-2的平台技术，该技术可适用于其他以刺突蛋白介导的细胞识别和入侵作为细胞病毒感染第一步的病毒。量子点具有高亮度和高稳定性，其表面可进行功能化修饰，用于多种细胞应用。利用该方法，我们能够可视化并定量检测刺突蛋白进入细胞的过程。配制0.1% BSA：将130微升7.5% BSA加入10毫升成像培养基中混合。进行6.1倍三倍系列稀释时，取14.26微升QD Spike加入285.74微升0.1% BSA中，以配制最高浓度为20纳摩尔的溶液。然后，将100微升20纳摩尔或QD Spike加入200微升0.1% BSA中，配制第二步稀释的6.67纳摩尔QD Spike。使用多通道移液器从每个孔中完全移除所有用过的培养基，用多通道移液器每孔加入100微升成像培养基洗涤一次，随后吸出100微升成像培养基。每孔重新加入50微升QD Spike溶液，并将培养板置于含5%二氧化碳、37°C的湿润培养箱中孵育3小时。穿戴防护装备，在无菌生物安全柜内配制4%PFA和0.1%PSA成像介质，使用自动化多通道移液器从每个孔中吸出50微升QD Spike，并向每孔加入100微升4%PFA，以避免孔内液体干燥。室温孵育15分钟，随后用PBS洗涤三次，通过将5 mM的储备液以1:1000比例稀释于PBS中配制深红色核染料，吸除PBS后，每孔重新加入50微升稀释后的核染料。室温孵育30分钟，再用PBS洗涤三次，随后对培养板进行成像，或使用板封膜密封以备后续成像使用。将培养板置于 4°C 保存。启动成像平台的软件。登录成像平台后，通过选择培养板类型为 96 孔透明底成像板、光学模式为共聚焦、放大倍数为 40 倍水浸物镜、binning 设置为 1，创建新的采集方案。选择高对比度等数字面部对比模式，以获得轮廓清晰的细胞体。拍摄快照以确认图像窗口中该视野合适，并选择适配的C通道，用于ACE2-GFP细胞系，以观察细胞内ACE2的转运情况。如需创建自定义的量子点（QD）通道，请点击三角形下拉菜单，选择激发波长在405纳米范围、发射波长在608纳米范围的通道，然后选择一个具有较强胞质QD信号的孔，以设定曝光时间、激光功率和Z轴高度位置。检查默认高度是否能在目标焦平面上获得细胞的清晰图像。内吞斑点的Z轴位置将低于质膜的Z轴位置。选择一个曝光时间，通常在100至300毫秒之间，以获得亮度足够、灰度值至少为背景信号三倍以上的图像。在20纳摩尔时，灰度值应约为6,000个原子单位，曝光时间为200毫秒，激光功率为80%。通过右键单击使用快照功能在各通道中生成的图像并选择“显示强度”，然后左键单击目标对象或背景，查看该像素的灰度值，并调整激光功率以微调目标对象的强度。保存采集方案，切换至“运行实验”，输入板名称，然后运行实验。通过荧光显微镜和表达 ACE2-GFP 的细胞系，对量子点和 ACE2 的转位过程进行可视化观察。随后进行图像分割与分析，以提取斑点计数等关键参数。首先，从细胞核标记通道中分割出细胞核，以生成感兴趣区域（ROI）群体。然后，使用 ACE2-GFP 通道对细胞进行分割，勾画出感兴趣区域（ROI）。最后，从细胞的 ROI 区域中分割出 QD 608 Spike 荧光点，结果显示内化的 QD 与 ACE2 信号表现出强烈的共定位。在 HEK 293T 细胞中，使用六种不同浓度的 QD Spike 进行了浓度响应实验。确定量子点的光浓度时，量子点的使用浓度可低至2.22 纳摩尔，但建议使用10 纳摩尔或更高的浓度，以确保产生稳定的信号响应。在量子点与蛋白结合过程中，可能会发生蛋白聚集现象。在量子点溶液中可观察到明亮的团块状沉淀物，即为聚集物。在HEK 293T细胞实验中，量子点在加入细胞前与中和抗体在30 微克/微升的起始浓度下共同孵育，这些抗体阻断了量子点的结合与内化过程，导致与仅使用量子点处理的细胞相比，荧光斑点数量减少。该实验方法还可用于高通量筛选、中和抗体的先导评估，以鉴定可阻断病毒进入的潜在抗病毒药物，并可加以改进以研究新出现的变异株。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

量子点偶联SARS-CoV-2穗状三聚体的高通量共聚焦成像，以追踪HEK293T细胞中的结合和内吞作用

Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

来源： Tran, B. N., et. al. 利用高通量共聚焦成像技术追踪量子点偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞作用。J. Vis. Exp.

可视化剂量依赖性刺突蛋白摄取的量子点偶联物技术

本视频演示了杂交链式反应（HCR）-荧光原位杂交（FISH）技术在可视化SARS-CoV-2亚基因组RNA空间分布中的应用。将HCR与免疫荧光技术相结合，有望在单细胞水平上揭示宿主与病毒之间的相互作用。...

利用免疫-RNA 荧光原位杂交技术可视化 SARS-CoV-2

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本方案描述了一种基于荧光共振能量转移和荧光寿命成像显微技术，用于定量可视化SNARE蛋白复合物形成的新方法。...

利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

结合细胞表面靶受体的抗体可引起构象变化和受体聚集。这些动态变化对于表征靶细胞中药物开发具有重要意义。本方案利用共聚焦显微镜结合ImageJ/FIJI中的图像相关光谱学方法，定量分析细胞表面受体聚集的程度。...

共聚焦显微镜通过图像相关光谱法揭示细胞表面受体聚集现象

在此，我们介绍一种简单的方法，该方法结合了RNA荧光原位杂交 将RNA原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合，用于可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该方案可能有助于加深理解SARS-CoV-2...

使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

了解量子点偶联SARS-CoV-2刺突蛋白的高通量共聚焦成像技术，用于追踪HEK293T细胞中的病毒结合与内吞过程。该方法可实时监测病毒入侵机制，为抗病毒药物筛选提供新平台。

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

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