使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

细胞产生的机械力对于全身多种器官的正常功能至关重要，包括肠道、膀胱、心脏等。这些器官必须产生稳定的细胞收缩和舒张模式，以维持机体内部的稳态。

平滑肌细胞的异常收缩可导致多种疾病的发生，包括以肠道肌肉收缩模式异常为特征的肠动力障碍，以及膀胱过度活跃或活动不足等病症。在气道中，某些以不规则模式收缩的肌细胞可引发哮喘性高反应性。显然，细胞和组织内的收缩机制可能引发需要治疗干预的疾病。

由于这些疾病状态可直接源于细胞收缩功能的异常，因此在筛选潜在药物候选物时，对细胞收缩功能本身进行测量就变得既合理又必要。随着微技术的最新进展，我们开发出一种基于微孔板的用户友好型检测方法，可在数十万计的细胞中实现单个细胞收缩的定量测量，该方法称为Flex，也被称为荧光标记弹性可收缩表面。

在此方法中，我们嵌入荧光蛋白微图案，即柔软薄膜，当细胞对其施加牵引力时，这些薄膜会发生形变和收缩。重要的是，蛋白微图案可限制细胞的位置、形状和铺展面积。统一的测试条件使得仅通过测量其尺寸变化即可进行简单测定。

总体而言，该平台包含一个基于浏览器的图像分析模块，能够简便地分析可收缩细胞的受力情况，无需复杂的操作步骤或标记物注册，任何具备基础细胞培养技能并拥有低倍荧光显微镜的研究人员均可操作。该技术在设计时充分考虑了最终用户的需求，旨在降低实验室科研人员研究细胞力学生物学的门槛。首先，向离心管中加入 20 毫升培养基，取一个专用于检测细胞收缩能力的 24 孔板。将移液器设定为 500 微升，并为细胞通路获取一个细胞筛网。

取下24孔板的盖子，以这种方式手持培养板，然后轻轻揭去板子上方的塑料薄膜层。小心地将培养板放回原位。用移液器吸去每个孔中上层的PBS，以防止液体溢出。

现在，逐行依次移除孔中剩余的 PBS，并迅速加入 500 微升细胞培养基。轻轻摇动培养板，并轻敲其侧面，确保孔的整个底部均被液体覆盖。待所有孔均加入培养基后，将培养板放置一旁。

此时，从培养箱中取出您的细胞培养物。我们将进行固体结合实验方案。该方案的目的是制备每毫升含 50,000 个细胞的悬液。

在接种细胞之前，需将细胞悬液通过滤网过滤一次，以将细胞团块分散成单个细胞。随后，小心地将500微升细胞悬液加入每个孔中。细胞接种后，应将培养板静置1小时，以便细胞沉降并直接贴附于图案表面。1小时后，将培养板放入培养箱中过夜培养。

实验的第二部分包括将药物加入24孔板并对该板进行荧光成像。在本实验步骤中，我们有两个重要要求，以确保细胞存活率和反应的可靠性。第一，含有细胞的孔中DMSO的最终浓度不得超过1%，这意味着我们需要对药物储备液进行100倍的完全稀释。

第二个原因是，我们不能将DMSO直接加入孔中，因为它会沉降到混合液底部，导致细胞局部暴露于高浓度DMSO而受到损伤。相反，我们必须先配制一个含有DMSO药物与培养基的中间溶液，充分混匀后使用，以避免细胞受到局部高浓度DMSO的影响。在本实验方案中，我们将进行六步八倍稀释，浓度范围从40微摩尔（μM）降至1纳摩尔（nM）。通过将30微升（μL）的药物原液依次转移至210微升（μL）的DMSO溶液中，并在每次转移后充分混匀，从而建立六步八倍稀释系列。在本实验中，我们将评估blebbistatin的作用效果。

通过肌肉细胞作用于人膀胱。为了同时满足这两个要求，我们将首先制备一种中间药物DMSO与培养基的混合溶液，该溶液可使DMSO稀释16.7倍。

然后，我们将该中间药物溶液按比例加入细胞中，使药物溶液进一步稀释六倍，最终实现总体100倍的稀释，DMSO终浓度为1%。具体操作如下：针对每种药物储备液，取30微升药物加入470微升细胞培养基中混匀，配制成中间溶液；随后取200微升该中间溶液加入24孔板的相应孔中（每孔已含有1000微升培养基）。此操作最终使DMSO浓度达到1%。在适当时间孵育，本实验中孵育30分钟。当准备进行成像时，在所有孔中加入活细胞核染料，使用储备液1:10,000的稀释比例。

继续孵育15分钟。当准备进行成像时，需要使用配备有荧光通道的荧光显微镜，以同时对标记的细胞核和荧光染料进行成像。微图案标记的是三C通道，在本示例中即为tri C通道。

现在，我们将对用blebbistatin染色的细胞核进行荧光成像，以识别单个细胞。务必在与观察微图案相同的位置对染色的细胞核进行成像，以便在分析过程中能够对齐图像。将采集到的图像上传至计算机，并确保图像已正确命名，其中图案通道的文件名以“_PT”结尾，细胞核通道的图像文件名以“_dapi”结尾。接下来，我们将使用ImageJ将tif图像转换为PNG图像。打开ImageJ后，一次加载一个通道的图像。

我们将首先加载图案通道并调整对比度，以最大化信号强度，同时最小化背景干扰。此外，我们将对图像进行平滑处理。当图像被修改至满意状态后，再将图像类型更改为8位。

然后将图像导出为 PNG 格式。接着勾选复选框，使用切片标签作为文件名。创建一个名为 PNGs 的新文件夹。

然后将 PNG 文件保存至此处。要分析图像，请访问 Biodock dot AI，创建账户并联系作者以获得分析模块的免费访问权限。账户创建完成后即可登录。在此界面中，您可上传新图像。

我们将此新批次命名为网络实验数据 JoVE。现在，我们可以通过拖拽图像并将其释放来导入图像，然后按“确定”。此时，选择您的数据，然后单击“分析”，向下滚动至标记为“收缩性分析”的模块，然后点击“选择”。

将放大倍数设置为与成像时相同的数值。数据采集完成后，点击该数据，然后选择下载数据。数据下载完成后，即可查看每张输入图像对应的叠加图像对。我们还可以获得一个汇总统计结果，该结果将提供每组细胞的平均收缩值。

收缩的测量单位为像素。通过观察数据可以看出，在仅用DMSO处理的孔中，细胞的收缩程度明显高于用blebbistatin处理的细胞。我们还可以获取在任意图像中检测到的每一个图案的详细数据。

这为我们提供了有关图像位置、图像来源、位置类型、细胞数量（零个、一个或多个）、微图案大小以及细胞收缩率计算结果的详细信息。该数据层包含微孔板内每一个已识别的图案。从该列表中的单细胞图案取平均值，用于计算另一文件中PNG图像的平均收缩率。

您可以根据实验需求对单细胞数据进行筛选和分析。在本视频部分中，我们将展示从24孔板中可获取的代表性数据，这些数据反映了经两种不同药物处理的膀胱平滑肌细胞的反应情况。这些图像分别显示了用DMSO和blebbistatin处理的孔。

在此，我们可以观察到，仅用DMSO处理的细胞呈现出大量收缩的微小图案，而用blebbistatin处理的细胞则更大且更为舒展，表明其收缩程度较低。该直方图中的数据展示了不同处理条件下细胞收缩力的变化情况。经blebbistatin处理的细胞分布中心低于经DMSO处理的细胞分布中心。

这与之前图像中显示的信息一致。用blebbistatin处理的细胞收缩程度明显更小，表明blebbistatin处理可显著使细胞松弛。

这些数据集中的每一组均可在单个24孔板上获得剂量-反应曲线上的一个数据点，具体操作遵循视频中展示的方案。此处我们可以观察到，与blebbistatin相比，细胞松弛素D的效力更强，这体现在较高药物浓度下收缩程度的数值更低。如果您希望显著扩大实验规模，可采用384孔板版本，并可结合自动化设备大幅提高实验通量。

这些数据可从384孔板中采集，与在24孔板上每种药物仅进行六次稀释步骤相比，384孔板使我们能够对每种药物进行20次稀释步骤，并设置多个重复。Snowflakes技术具有独特性，它能够通过显微镜实现单细胞收缩的可视化观察，而这一点在此前一直无法实现。

因此，该技术依赖于用荧光标记蛋白构建的指标形式。这种系统性模式可用于细胞收缩研究，并能够精确测量任何给定药物对收缩表型调控的影响。当然，该技术目前仍在积极开发中，应用于多种不同的疾病领域，例如哮喘、心血管疾病、炎症、免疫肿瘤学，以及任何细胞异常收缩在疾病进展中起关键作用的其他疾病适应症。

正如我们所展示的，这种基于微图案化技术的细胞收缩力测量方法为传统的牵引力显微镜提供了一种简化的替代方案，能够通过直观观察图案的收缩实现分析，并可在大量细胞群体中实现单细胞分辨率。需要注意的是，该方法在应用于某些尺寸过小的细胞（如T细胞和中性粒细胞）或不易贴壁的细胞类型时可能存在挑战。此外，那些结合力较弱、主要相互黏附或无法充分铺展的细胞，将无法产生可测量的收缩信号。

使用该技术的研究人员必须针对其特定的细胞类型，仔细评估不同可能的细胞培养基配方，因为不同的组分、生长因子、血清水平和pH敏感性可能会导致细胞行为的差异。实验流程的优化应在任何实验工作流程放大之前进行。

如果无需单细胞分辨率，或者目标细胞类型的铺展能力极低，则可采用传统的牵引力显微镜方法进行此类实验。否则，我们希望本工具能为细胞生物学家研究细胞收缩并开展相关研究提供一条新的途径。