使用微图案弹性体对单细胞收缩力进行简化的高通量分析

这项工作提出了一种灵活的方案，用于利用微孔格式的荧光标记弹性收缩表面（FLECS）技术，基于荧光蛋白微模式的可视化位移，对单细胞收缩力进行简化，无需干预的定量。

细胞产生的机械力对于全身各个器官的正常运作至关重要。加上肠道膀胱，心脏和其他。这些器官必须产生稳定的细胞收缩和松弛模式，以维持内部止血状态。

异常平滑肌细胞收缩可导致各种疾病的发作，包括肠道运动障碍的特征是肌肉收缩的肠道异常模式，以及膀胱过度活跃或功能不活跃等疾病。在气道中，一些收缩任何不规则模式的肌肉细胞会引发哮喘的超反应性。显然，细胞和组织内的收缩机制可能导致需要治疗方案的疾病。

由于这些条件可能直接源于细胞的功能失调的收缩行为，因此在筛选潜在的候选药物时，测量细胞收缩功能本身变得既合乎逻辑又必要。随着微技术的最新进展，我们开发了一种用户友好的基于微孔板的测定，可以定量测量单细胞收缩。在数十万个细胞中称为flex，也称为荧光标记的弹性收缩表面。

在这种方法中，我们嵌入了荧光蛋白微图案，以及软膜，当细胞对它们施加牵引力时，它们会变形和收缩。重要的是，蛋白质微观模式限制了细胞的位置，形状和扩散区域。测试条件统一，仅允许根据其尺寸变化进行简单测量。

总体而言，该平台包括基于浏览器的图像分析模块，可以直接分析可收缩的细胞力，而无需精细的处理程序或信托标记物的配准，并且可以由任何研究人员使用基本细胞培养物和具有低放大倍率的简单荧光显微镜进行操作。该技术在设计时考虑到了最终用户，旨在降低任何实验室科学家研究细胞力生物学的进入门槛，首先将20毫升培养基添加到慢性管中，获得设计用于测定细胞收缩性的24孔板。将移液器设置为500微升，并获得用于细胞病原体的细胞过滤器。

取下24孔板上的盖子，按原样举起板，然后继续轻轻地取下板顶部的塑料层。小心地将盘子放回原处。从每个孔中吸出顶层PBS，以防止任何溢出。

现在，一次一排，从孔中取出剩余的PBS，并快速填充500微升的细胞培养基。轻轻摇晃板，然后侧轻敲，以确保整个孔的底部都覆盖着溶液。一旦所有的孔都装满了介质，将盘子放在一边。

此时，从培养箱中检索细胞培养物。我们将进行一个坚实的关联协议。该协议的目的是产生每毫升50， 000个细胞的悬浮液。

在接种细胞之前，请确保通过过滤器过滤一次细胞，以便将细胞团块分解成单个细胞，小心地将500微升的细胞溶液放入每个孔中。细胞接种后，重要的是让板静置一小时，以便细胞可以直接沉淀到图案上。一小时后，将盘子放入培养箱过夜。

实验的第二部分包括将药物添加到24孔板中并对板进行荧光成像。对于方案的这一部分，我们有两个重要的要求来确保强大的细胞活力和反应。首先，DMSO在具有细胞的孔中的最终浓度不超过1%，这意味着我们需要从我们的药物储备中充分稀释100。

第二，我们不能将DMSO直接添加到孔中，因为它会撞击到混合物的底部，然后损害高浓度的细胞。相反，我们必须创建DMS0药物和培养基的中间溶液，我们可以将其彻底混合在一起，以避免高局部DSSO暴露于细胞。在该协议中，我们将进行六步八倍稀释，涵盖从40微摩尔到一纳米摩尔的范围 通过将30微升的储备药物溶液转移到连续的210微升体积的DMSO中并在每个转移步骤之间彻底混合来创建六步八倍稀释系列在我们的实验中， 我们将评估布比司汀的效果。

通过肌肉细胞在人体膀胱上。为了满足这两个要求，我们将首先创建中间药物DMSO和培养基解决方案。这产生了16.7倍的DMSO稀释度。

然后，我们将该中间药物溶液添加到我们的细胞中，使用比例产生额外的六倍稀释，导致总共100个完全稀释和1%DMSO的最终浓度为了实现这一点，对于每个储备药物溶液，将30微升药物混合到470微升细胞培养基中，然后将200微升该中间溶液转移到24孔板上的适当孔中， 每个孔中含有1000微升。这总共产生1%最终浓度的DMSO孵育物，持续适当的时间。在我们的实验中，我们孵育30分钟，当您准备成像时，在您的孔上添加一个活核污渍，从储备液中加入一到10， 000稀释液。

让它再孵育15分钟。当您准备成像时，您将需要一台荧光显微镜，该显微镜可以对标记的细胞核和荧光染料的荧光通道进行成像。微模式被标记为在我们的示例中是三C通道。

现在，我们将对blebbistatin细胞核进行荧光成像，以识别单个细胞，确保将染色细胞核成像在与您查看微图案完全相同的位置，以便它们可以在分析过程中对齐。将采集的图像上传到您的计算机，确保图像被正确标记，以便图案通道以下划线PT结尾。核通道中的图像以下划线dapi结尾。现在，我们将使用图像 J 将 tif 图像转换为 PNG 图像 一旦图像 J 打开，一次加载一个通道。

我们将首先加载图案通道并调整对比度，以便最大化信号，并最小化背景。此外，我们将平滑图像。根据我们的喜好修改图像后，我们将图像类型更改为八位。

然后将图像导出为 PNG 类型。然后选中该框，使用切片标签作为文件名。创建一个名为 PNG 的新文件夹。

然后将PNG文件保存在那里，要分析图像，请导航到Biodock dot AI，创建一个帐户并联系作者以免费访问分析模块。创建帐户后登录。在这里，您将能够上传新图像。

我们将把这个新的批次称为Web实验数据JoVE。现在，我们可以通过拖动图像然后删除它们来导入图像，按 OK.At 此时选择您的数据。然后单击分析，向下滚动到标记为"收缩力分析"的模块，然后点击选择。

将放大倍率设置为用于成像的相同值 数据完成后，单击它，然后我们可以选择下载数据。下载数据后，我们可以看到每个输入图像的叠加图像对。我们还可以访问汇总统计数据，该统计数据将为我们提供每组单元格的平均收缩率。

收缩的度量单位以像素为单位。从数据中可以看出，在仅用DMSO处理的孔中，与用blebbistatin处理的细胞相比，细胞的收缩要高得多。我们还可以访问在任何图像中检测到的每个模式的数据。

这为我们提供了有关图像位置，图像来源，位置类型，细胞数量，零一个或多个，微图案的大小以及细胞的计算收缩的详细信息。该铺层由微孔板内每个已识别的图案组成。此列表中的单单元格模式是平均值，用于计算其他文件中 PNG 图像的平均收缩。

您可以根据实验的需要对单个细胞数据进行排序和分析。对于视频的这一部分，我们将展示从24孔板收集的代表性数据，这些数据显示了用两种不同药物治疗的膀胱平滑肌细胞的反应数据。这些是分别用DMSO和blebbistatin处理的孔的图像。

在这里，我们可以看到仅用DMSO处理的细胞显示出大量的收缩微模式，但用blebbistatin处理的细胞更大，并且愿意注意到收缩较少。该直方图中的数据显示了由于对细胞的不同处理而导致的变异细胞收缩性。用布莱比司汀处理的细胞的分布中心低于用DMSO处理的细胞的分布中心。

这与前面图像中显示的信息一致。因为用布莱比司汀处理的细胞表现出更小的收缩。这表明用布比司汀治疗显着放松细胞。

这些数据集中的每组都有助于剂量反应曲线上的一个点，该点可以按照视频中显示的协议从单个24孔板收集。在这里，我们可以看到，鉴于药物浓度较高，胞质素D比blebbistan更有效，如较低的收缩值所示。如果您希望显著扩展实验，可以使用384孔板版本，这可以与自动化一起使用，以显着扩展实验。

这些数据可以从384孔板收集，而不是对24孔板上的每种药物进行六个稀释步骤，384孔板允许我们对具有多个重复的每种药物进行20个稀释步骤。雪花技术是独一无二的。它允许使用显微镜观察单细胞收缩，这是迄今为止不可能实现的。

因此，技术依赖于以荧光标记的蛋白质为图案的度量形式。系统模式是为细胞收缩而形成的，并允许精确测量任何给定药物对表型收缩的调节。当然，这项技术仍在积极开发，用于应用和许多不同的疾病领域，例如哮喘，心血管疾病，炎症免疫肿瘤学，当然还有我们的任何疾病适应症，其中异常细胞收缩在疾病进展中起着关键作用。

正如我们所展示的，这种基于微观图案化的测量细胞收缩力的技术为传统的牵引力显微镜提供了一种简化的替代方案，提供了直观的分析，观察图案缩小，并在大细胞群中提供单细胞分辨率。考虑到一些因素，这种方法可能会对使用太小的细胞（例如T细胞和嗜中性粒细胞）或不粘附的细胞类型构成挑战。此外，每周结合，主要相互结合或不完全扩散的细胞不会产生可测量的收缩信号。

该技术的用户必须仔细评估其特定细胞类型的不同可能的细胞培养基配方。因为不同的成分，生长因子，血清水平和pH敏感性可能驱动不同的行为。实验方案的优化应继续进行任何实验性工作流程的扩展。

最终，如果不需要单细胞分辨率，或者如果目标细胞类型具有最小的扩散能力，则可以将传统的吸引力显微镜方法用于此类实验。否则，我们希望这个工具为细胞生物学家研究细胞收缩和执行研究提供额外的途径。