Name: 完整小鼠和斑马鱼大脑的深组织三光子荧光显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习深组织三光子荧光显微镜技术，用于小鼠和斑马鱼大脑的活体高分辨率成像。该方法可深入观察神经元结构与功能，助力阿尔茨海默病和自闭症等神经系统疾病的研究。

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本工作由 NSF DBI-1707312 康奈尔大学 NeuroNex 中心和 NIH 1U01NS103516 资助。

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li>
<li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li>
<li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li>
<li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+Ca2%2B+imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li>
<li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177(2019).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light%2C+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+C+%22Topics+in+Fluorescence+Spectroscopy.+5%22">Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5</a>. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).</li>
<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).</li>
<li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1%2C700+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205(2020).</li>
<li>Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li>
<li>Huang, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li>
<li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li>
<li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).</li>
<li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案详细说明了使用商用显微镜和激光光源建立三光子成像（3P成像）的逐步操作流程。与双光子显微成像（2PM）相比，三光子显微成像（3PM）在需要深入组织光学观测的应用中具有优势，例如小鼠脑 hippocampus 区域的成像。尽管3PM主要应用于神经科学领域，但它也有望用于其他组织，如淋巴结、骨骼和肿瘤，以实现深层组织的观察。
必须验证成像系统是否接近散粒噪声极限，以确保在光电倍增管（PMT）之后，检测和数据采集电子元件对图像引入的噪声可忽略不计。所检测光子数的不确定性从根本上受限于光子散粒噪声。在典型的多光子显微镜中，使用高增益光电探测器（例如光电倍增管）即可实现接近散粒噪声极限的性能。光子散粒噪声遵循泊松统计分布，其分布的标准差等于该分布均值的平方根。为验证系统是否达到散粒噪声极限性能，请遵循方案部分的步骤1.14。
为避免H引起的光衰减2O，使用 D2O用于浸没时效果较好，特别是对于约1,700 nm的激发。当D2若使用 O，则必须更换 D2约每10分钟一次，或使用大量D2O 以避免 D2O/H2成像过程中防止气体交换。也可将 D2来自室内的氧气3. 如果使用长工作距离（WD）物镜（例如，工作距离为4 mm或更长）进行成像，则浸没液体的厚度可超过2-3 mm。增加的厚度会使H2即使在约1,300 nm处，O吸收也不可忽略21因此，D2即使使用长工作距离的物镜，在1,300 nm 3PM中也可能需要补偿O。
由于三光子（3P）荧光强度与焦点处激发脉冲能量的三次方成正比（公式（1）），因此设定合适的激光功率对于在获得足够三光子荧光信号的同时避免活体组织中的热效应和非线性损伤尤为重要。平均激光功率应保持在热损伤阈值以下。例如，在小鼠脑组织中，为避免热损伤，当激发波长为~1,300 nm、成像深度为1 mm、视场（FOV）为230 µm × 230 µm时，小鼠脑表面的平均激光功率应保持在约100 mW或以下21。类似地，在~1,700 nm激发、深度约1 mm、视场约230 µm × 230 µm时，平均功率应保持在约50 mW或以下（未发表数据）。此外，为避免激发饱和及潜在的非线性损伤，激发脉冲能量应分别控制在~1,300 nm时低于<img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">2 nJ，以及~1,700 nm时低于<img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">3 nJ30。
由于组织对光的吸收和散射，脉冲能量在穿透1个有效衰减长度（EAL）的组织后，会衰减至初始值的1/e（约37%）。EAL在不同组织中以及不同激发波长下各不相同；例如，在小鼠脑新皮层中，激发波长分别为约1,300 nm和约1,700 nm时，EAL分别约为300 µm和400 µm3,29（图5）。因此，为了在深度为n个EAL的位置保持相同的聚焦脉冲能量（例如1 nJ/脉冲），表面脉冲能量需乘以1 nJ × en。为了实现对结构和功能动态的快速成像，宜采用高重复频率（1 MHz或更高）的激发激光器，以获得较高的帧率5,6,7,10。然而，脉冲能量需求与激光平均功率的限制制约了可使用的重复频率。
例如，当我们在4个衰减长度（EAL）的中等深度区域成像时（即在1300 nm激发下，小鼠大脑皮层约1.2 mm深度），需要在样品表面提供约55 nJ/脉冲的能量，以保证焦点处维持1 nJ/脉冲。当平均功率限制为100 mW时，可采用约2 MHz的激光重复频率。然而，当成像深度增加至7个EAL时，为在焦点处保持1 nJ/脉冲，样品表面所需的脉冲能量需提高至约1100 nJ/脉冲。假设为避免热损伤，最大平均功率仍为100 mW，则激光重复频率应降低至0.1 MHz，以在样品表面实现1100 nJ/脉冲的能量。表 1 总结了小鼠大脑皮层成像的典型条件。需要注意的是，表 1 中的成像深度假设在整个小鼠大脑皮层中EAL是均匀的。
此外，由于深部组织三光子显微成像（3PM）中激光功率的限制，成像帧率与图像像素尺寸之间存在权衡关系，这一点在钙成像等功能成像中尤为重要。在每个成像深度下，激光的最大可用重复频率由焦点处所需的脉冲能量和可应用的平均激光功率决定，如上所述，例如在相当于约4个等效衰减长度（EAL）的深度处，使用1,300 nm激发时，重复频率为2 MHz。通常情况下，每个像素至少需要一个激光脉冲。因此，像素的最短驻留时间由激光重复频率决定，例如在2 MHz激发下，像素驻留时间为0.5 µs/像素。
为了在三光子（3P）成像中保持高空间分辨率（横向分辨率约1 µm），理想情况下应将1个像素设置为约1 µm2的面积，例如，对于250 × 250 µm2的视场（FOV），采用256 × 256像素。因此，若要在具有较大视场（例如250 × 250 µm2，256 × 256像素）的情况下实现快速成像，0.5 MHz、1 MHz和2 MHz的脉冲重复频率分别可提供约7.6、约15和约30帧/秒的理论最大帧率。同样，根据目标成像深度、扫描速度和视场大小，优化激光重复频率至关重要，以确保在热损伤阈值以下提供足够的脉冲能量。为了提高成像速度，可采用自适应激发光源，通过按需向神经元递送激光脉冲，将所有激发脉冲集中于神经元（即感兴趣区域）31。
与双光子显微成像（2PM）相比，三光子显微成像（3PM）在活体组织深层成像以及透过高散射介质（例如颅骨、骨骼和小鼠脑白质层（即外囊））成像方面具有优势。更长的有效衰减长度（EAL）以及三光子激发（3PE）的高阶非线性激发特性有利于深层组织成像。例如，在对小鼠皮层中的GCaMP6进行成像时，在深度小于<img alt="静态平衡；ΣFx≤0；示意图；物理学；平衡分析；力矢量；稳定性条件。" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3">690 µm（即约等于1,300 nm波长下的2.3个EAL）的浅层区域，使用920 nm激发的双光子荧光信号强于使用1,300 nm激发的三光子荧光信号21。然而，由于1,300 nm波长下的EAL比920 nm更长，当成像深度达到约690 µm及更深时，三光子激发产生的荧光信号强于双光子激发（2PE）21。该深度被称为“信号交叉深度”，即在相同重复频率和相同最大允许平均功率条件下，2PE与3PE所产生的荧光信号强度相等的深度21。信号交叉深度取决于2PE和3PE的激发波长以及所使用的荧光分子。
在实际应用中，由于920 nm激发的水吸收较弱，因此允许使用比1,300 nm激发更高的平均激光功率。然而，双光子激发（2PE）的较高平均功率仅能将信号交叉深度推进0.9个衰减长度（EALs）4。此外，当样品标记密度较高时，三光子激发（3PE）具有显著更高的信背比（SBR）优势。因此，即使在尚未达到信号交叉深度之前，三光子显微镜（3PM）的成像效果也可能优于双光子显微镜（2PM）。例如，在对小鼠脑血管系统进行成像时，其体积分数（即标记密度）约为2%，在约700 µm深度处，使用100 mW激发功率的1,300 nm三光子显微成像效果优于使用200 mW激发功率的920 nm双光子显微成像，荧光素作为标记物。
在穿过薄而高度散射的组织层进行成像时，三光子显微镜（3PM）也具有优势，因为这类组织层可能会扭曲激发光的点扩散函数，并产生离焦背景4。例如，在穿透小鼠大脑完整颅骨时，即使成像深度较浅（距脑表面<100 µm），双光子显微镜（2PM）图像仍会受到离焦背景的影响13。类似地，在使用1,280 nm激发光穿透小鼠脑内白质时，双光子显微镜也观察到了类似的离焦背景现象32。因此，当通过浑浊组织层对生物组织进行成像时，无论标记密度如何，三光子显微镜在实现高对比度成像方面均优于双光子显微镜。
我们最近报道了一种微珠仿体及理论分析，表明三光子显微成像（3PM）的成像深度极限超过8个有效衰减长度（EALs）33；在小鼠大脑皮层中，8个EALs相当于使用约1700 nm激发光时的约3 mm深度。然而，目前可用的激光器尚不具备足够的脉冲能量，以在小鼠脑组织中实现8个EALs的成像深度。更强激光器的进一步发展将推动3PM当前的成像深度极限。

在生命科学领域，多光子显微技术（MPM），例如双光子显微成像（2PM）和三光子显微成像（3PM），已成为实现深层组织成像的有力工具 在体 在散射组织中实现高时空分辨率和高对比度成像。此外，与单光子共聚焦显微镜相比，这些方法引起的光漂白更少。1,2,3,4与双光子显微成像（2PM）相比，三光子显微成像（3PM）在深层组织成像方面具有优势，主要归因于两个特征：（i）采用更长波长的激发光（约1,300 nm或约1,700 nm），可减少组织对光的散射；（ii）更高阶的激发过程（即3PM中的荧光信号与激发光功率的三次方成正比，而2PM中为二次方），可有效抑制非特异性背景荧光3因此，三光子显微镜（3PM）能够在活体组织更深层区域实现高对比度成像，例如完整成年小鼠脑中的海马区3,5,6,7,8,9,10,11 成年斑马鱼的整个前脑12，包括 Ca2+ 活动记录与多色观察。此外，通过小鼠和成年斑马鱼的完整颅骨，已利用三光子显微镜（3PM）获得高对比度图像。12,13.
目前，适用于约1300 nm和约1700 nm波长进行三光子激发（3PE）的激发激光光源已可商业化获得。由于激光扫描系统在双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM）中基本相同，因此在生物学实验室中，通过安装 commercially available 的三光子激发激光器，即可将现有的双光子系统改装为三光子系统。三光子荧光信号的强度取决于激光功率、脉冲持续时间、激光重复频率以及物镜的数值孔径（NA）。假设为衍射极限聚焦（即激发光束完全充满物镜的后光阑），公式（1）描述了由三光子激发产生的焦体积内时间平均的荧光光子通量。
<img alt="用于光子学和光谱学研究的非线性光学方程；数学公式表示。" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> （1）
何处 f 是激光重复频率， τ 是激光脉冲持续时间（半高全宽）， ϕ 是系统的收集效率， η 是荧光量子效率， σ3 是三光子吸收截面， C 是荧光团的浓度， n0 是样品介质（如水）的折射率， λ 是真空中的激发波长， NA 物镜的数值孔径， a3 是焦体积的空间积分常数， <img alt="静态平衡公式 ⟨P(t)⟩ 在物理方程分析中的应用" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 是物镜下激发光子通量的时间平均值（光子/秒）， z 是成像深度，且 EAL 是有效衰减长度14. 此处我们假设 EAL（通常 &gt; 100 µm）远大于显微镜的轴向分辨率（通常 &lt; 10 µm）。在近轴近似条件下， a3 等于 28.114. gp(3) 是 3rd激发光源的时间相干性顺序，以及 gp(3) 对于双曲正割平方脉冲和高斯脉冲分别为0.41和0.51。收集效率 ϕ 可通过考虑物镜的荧光收集效率、物镜透射率、二向色镜的反射率、滤光片的透射率以及探测器的检测效率（例如光电倍增管，或PMT）来估算。由于三光子荧光强度高度依赖于多种参数，因此需要优化三光子系统以最大化三光子荧光信号。
本方案阐述了典型三光子（3P）成像系统的优化过程，尤其适用于已具备双光子（2P）成像系统并计划将其功能扩展至三光子成像，或希望维持商用三光子系统处于最佳性能的生物学实验室。本视频文章还展示了在活体动物大脑中进行的深层组织三光子成像。第一部分介绍了使用商用激光源和多光子显微镜对典型三光子系统进行优化的方法。第二和第三部分分别描述了斑马鱼和小鼠神经结构与神经活动三光子显微成像前的样品制备流程。小鼠颅骨开窗手术此前已在多个方案文献中报道过15,16,17。第四部分展示了在斑马鱼和小鼠大脑中进行的活体三光子成像。

<table><tbody><tr><td>5% 聚维酮碘</td><td>Amazon</td><td>NDC 67818-155-32</td><td>手术区域的无菌清洁</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>手术区域的无菌清洁</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A4718-256</td><td>制备斑马鱼成像腔</td></tr><tr><td>阿托品</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bergamo II</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>多光子成像显微镜</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环形玻璃（内径4.5，外径6.5）</td><td>Potomac Photonics</td><td></td><td>用于开颅手术的盖玻片</td></tr><tr><td>眼膏（或局部眼用软膏）</td><td>Puralube Vet Ointment</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>作为润滑剂使用，防止术中和麻醉期间眼部刺激或缓解干眼症状</td></tr><tr><td>GaAsP 放大光电倍增管</td><td>Thorlabs</td><td>PMT2100</td><td>光电倍增管探测器</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>格隆溴铵</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热器（800 W）</td><td>Finnex</td><td></td><td>斑马鱼养殖用水加热器</td></tr><tr><td>异氟烷 USP 250 mL</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-0013-25</td><td>用于小鼠麻醉</td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td></td><td>用于斑马鱼样品制备的实验室擦拭纸</td></tr><tr><td>纳米注射器（10 微米）配 36 G 针头</td><td>WPI</td><td>NANOFIL + NF36BV</td><td>用于注射泮库溴铵的注射器和针头</td></tr><tr><td>光学胶</td><td>Norland</td><td>NOA 68</td><td>用于将圆形盖玻片与环形玻璃粘合在一起</td></tr><tr><td>泮库溴铵</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Elemental Science</td><td>ESI MP2</td><td>斑马鱼实验系统的水泵</td></tr><tr><td>聚乙烯管（内径 0.58 mm，外径 0.965 mm）</td><td>Elemental Science</td><td>MP2 泵用管</td><td>插入斑马鱼口部的管道</td></tr><tr><td>圆形盖玻片，德国玻璃 #1.5，5 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7229605</td><td>用于开颅手术的盖玻片</td></tr><tr><td>Spirit-NOPA</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>可调谐光学参量放大器</td></tr><tr><td>SR400</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR400</td><td>光子计数器</td></tr><tr><td>标准光电二极管功率传感器</td><td>Thorlabs</td><td>S122C</td><td>功率探测器</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU 806552-500ml</td><td>用于小鼠脑部手术</td></tr><tr><td>手术单</td><td>Dynarex 一次性毛巾式手术单</td><td>4410</td><td>用于无菌小鼠手术</td></tr><tr><td>细条状封蜡</td><td>Corning Rubber Co., Inc.</td><td></td><td>固定斑马鱼腔室中的管道</td></tr><tr><td>ThorImage</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>三卡因（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）</td><td>MP</td><td>103106</td><td>用于斑马鱼麻醉与安乐死</td></tr><tr><td>Tygon 管（内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸）</td><td>Tygon</td><td></td><td>用于斑马鱼样品制备中的水流管道</td></tr><tr><td>VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>用于回收异氟烷</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>用于将玻璃窗粘合至小鼠颅骨，以及在制备斑马鱼时粘合实验室擦拭纸</td></tr><tr><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Olympus</td><td></td><td>多光子激发专用物镜</td></tr></tbody></table>

完整小鼠和斑马鱼脑组织中的深层组织三光子荧光显微镜成像

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

多光子显微技术，例如双光子显微术（2PM）和三光子显微术（3PM），是用于深层组织成像的强大工具 体内 具有亚细胞分辨率的成像。与生物学实验室广泛使用的双光子显微镜（2PM）相比，三光子显微镜（3PM）在深层组织成像方面具有两大主要优势：（i）采用约1,300 nm或约1,700 nm的激发激光，可在散射组织中实现更长的衰减长度；（ii）由于更高阶的非线性激发，背景荧光产生更少。因此，3PM能够在散射组织内部实现高对比度的结构与功能成像，例如从小鼠大脑皮层至海马体的完整脑组织，以及成年斑马鱼的整个前脑。
目前，适用于三光子显微成像（3PM）的激光光源已有商业化产品，使得现有的双光子（2P）成像系统可以改装为三光子（3P）系统。此外，多种商用三光子显微镜也已上市，使该技术能够被生物学研究实验室便捷地采用。本文展示了典型三光子显微成像系统的优化方法，特别面向已具备双光子系统的生物学研究团队，并演示了在完整小鼠和成年斑马鱼脑组织中进行的活体三维成像。本实验方案涵盖了三光子成像的完整实验流程，包括显微镜光路校准、约1300 nm和约1700 nm激光脉冲的预啁啾调节、动物准备，以及在成年斑马鱼和小鼠脑组织深层进行的活体三光子荧光成像。

该方案的成功实施将获得正确校准的显微镜，具备最优的光照参数（如脉冲持续时间、数值孔径）以及适用于后续实验的动物样本制备 在体 3PM。商用的3P系统包含适用于约1,300 nm和约1,700 nm波长的合适镜片和透镜，因此在1,300 nm与1,700 nm激发波长之间切换时，无需更改光学元件。若3P系统的透镜不具备适用于1,300 nm和1,700 nm波长的适当镀膜，则需更换为合适的透镜，以减少激光功率损耗。通过优化的3PM系统并结合适当的动物准备， 体内 可在脑组织深层采集到高对比度的荧光和三次谐波成像图像。
图3展示了完整成年斑马鱼的代表性三光子（3P）图像。利用三光子显微镜（3PM），可实现对成年斑马鱼脑中基因标记神经元的高分辨率、非侵入性和深层成像。尽管已有研究报道使用双光子显微镜（2PM）对成年斑马鱼脑的端脑区域进行成像24,25,26,27，但3PM能够覆盖整个端脑以及使用其他技术难以或无法观察到的更深层区域。图3C中可观察到视顶盖和小脑中的细胞层分布。在成功的成像过程中，三次谐波生成（THG）通道中可见颅骨结构，而荧光通道中可见神经元。对于成年斑马鱼的成像，使用显微镜的相机功能来定位鱼体位置（图3A）。此步骤在小鼠脑成像中并非必需，因为小鼠颅窗较大，脑组织易于定位。利用前文所述系统获得了成年斑马鱼脑的高分辨率结构图像。颅骨在THG通道中可见（图3B），有助于导航脑组织并确定其表面位置。如图3C所示，在成年斑马鱼脑深层，神经元仍具有高信背比（SBR），清晰可辨。由于自发荧光的存在，脑组织上方的结构在荧光通道中亦可见。
图4 显示了使用1,340 nm激发波长在成年小鼠大脑中获得的多色三光子（3P）成像结果，包括GCaMP6s标记的神经元（绿色）、Texas Red标记的血管（红色）以及三次谐波产生（THG，蓝色）信号10。这些图像引自先前的研究工作10。在图4中，为了获得足够的荧光和THG信号，焦点处的脉冲能量在整个成像深度范围内保持在约1.5 nJ，激光最大平均功率约为70 mW。脉冲持续时间调整至约60 fs，有效数值孔径（NA）约为0.8。通过对三光子显微镜（3PM）系统的优化，在脑表面下深达1.2 mm的海马CA1区仍成功获得了高对比度图像（图4A、B）。图4C、D展示了在深度750 µm处GCaMP6s标记神经元在10分钟记录期间的Ca2+活动轨迹，显示出高保真的记录效果。
如果激发激光未正确对准，可能会观察到视场内信号亮度不均匀。此外，如果激光参数（如脉冲持续时间、焦点处的激发脉冲能量和有效数值孔径）未优化，则无法观察到鱼颅骨或小鼠脑部开颅窗口的三次谐波生成（THG）图像，和/或需要较高的激发脉冲能量（例如，焦点处 >2 nJ/脉冲）。因此，在开始深层组织成像之前，脑表面的THG信号可作为评估三光子显微镜（3PM）系统是否优化的指标。
<img alt="三光子显微镜装置；带泵浦激光器、棱镜压缩器和三光子显微成像系统示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：三光子显微镜（3PM）装置示意图。 激发激光的波长设定为约1,300 nm或约1,700 nm，来自非共线光学参量放大器（NOPA）的闲频输出端口。棱镜对压缩器和硅片压缩器分别用于对约1,300 nm和约1,700 nm的激光进行预啁啾。约1,300 nm和约1,700 nm的激光光束可通过翻转镜进行切换。NOPA的信号输出端口用于获取触发信号。通过半波片和偏振分束器（PBS）控制激发光功率。荧光和三次谐波产生（THG）信号由GaAsP光电倍增管（PMT）检测。采用适当的二向色镜和带通滤光片组合来分离荧光和THG信号。缩写：3PM = 三光子显微镜；NOPA = 非共线光学参量放大器；PBS = 偏振分束器；THG = 三次谐波产生；DAQ = 数据采集；PMT = 光电倍增管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜软件界面示意图；图像采集与分析设置显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：鱼类活体成像的代表性截图（实验方案第 4.1 节）。（A）图像采集软件的相机模式视图，使用4倍物镜。软件的主要功能以数字标出，如下所述：1. 图像采集软件的成像模式，可选模式包括 Camera、Multiphoton 和 Multiphoton GG。使用CCD相机进行白光成像时，选择 Camera 模式。2. 点击 Live 按钮可开启相机（或在多光子模式下开启PMT），从而观察显微镜的实时图像。3. 在 Capture Setup 选项卡中，设置所需的成像参数（功率、位置、深度）。4. 在 Capture 选项卡中，指定图像保存的文件夹位置，并可在此选项卡中启动成像。5. Z Control 设置通过移动Z轴电机来控制成像深度。6. 斑马鱼头部的代表性图像，头部前端位于左侧。（B）使用25倍物镜时 Camera 模式的代表性视图。（C）Multiphoton GG 模式的代表性视图，包含（B）中图像的THG图像。缩写：CCD = 电荷耦合器件；PMT = 光电倍增管；THG = 三次谐波生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示视顶盖（OT）和小脑（CB）区域的神经成像示意图，通过荧光显微镜在不同深度下呈现。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：使用图像采集软件获取的成年斑马鱼脑的代表性图像。（A）使用4倍物镜获取的成年斑马鱼头部的相机模式图像。图像上方为吻侧方向。视顶盖（OT）叶和小脑（CB）已标出。（B）使用25倍物镜在多光子GG模式下获取的代表性图像，包含（A）的三次谐波生成（THG）图像。（C）成年斑马鱼脑中小脑与视顶盖交界区域的荧光图像，其中绿色荧光蛋白（GFP）在不同深度的神经元细胞质中表达。比例尺 = 100 µm。缩写：OT = optic tectum；CB = cerebellum；THG = third-harmonic generation；GFP = green fluorescent protein。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示深度剖面、荧光显微图像和信号强度图的脑组织成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：小鼠脑组织中GCaMP6s标记的神经元（绿色）、Texas Red标记的血管（红色）以及在1,340 nm激发下产生的三次谐波信号（蓝色）的多色三光子显微成像（3PM）。（A）从脑表面开始向下采集的Z轴层扫图像，最大深度达1,200 µm，视场为270 × 270 µm（每帧图像512 × 512像素）。根据成像深度调整激光功率，以保持焦点处脉冲能量约为1.5 nJ。物镜下的最大平均功率为70 mW。（B）不同成像深度处选取的二维图像。（C）位于硬脑膜下750 µm处的神经活动记录位点，视场为270 × 270 µm（256 × 256像素）。（D）在清醒小鼠中记录到的来自（C）中标记神经元的自发性脑活动轨迹。成像帧率为8.3 Hz，像素驻留时间为0.51 µs。激光重复频率为2 MHz，物镜下的平均功率为56 mW。每条轨迹均以其基线进行归一化，并使用时间常数为0.72 s的汉明窗进行低通滤波。比例尺 = 50 µm。本图及图注引自10。缩写：3PM = 三光子显微术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱图；衰减长度与波长的关系；水吸收、组织散射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：小鼠脑新皮层中的有效衰减长度。 有效衰减长度（EAL，品红色线）由组织散射（红色线）和组织中水的吸收（蓝色线）计算得出，假设水含量为75%。黑色星号表示在小鼠脑新皮层中报道的EAL实验数据3,21,28,29。需注意，EAL在不同组织中有所差异。缩写：EAL = effective attenuation length。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>激发波长 
			(nm)</td>
			<td>浸没介质（水）</td>
			<td>最大激光功率 
			(mW)</td>
			<td>焦点处最大脉冲能量* 
			(nJ)</td>
			<td>小鼠皮层中的典型有效衰减长度 
			(µm)</td>
			<td>小鼠皮层中的成像深度** 
			(mm)</td>
			<td>物镜下方的脉冲能量*** 
			(nJ)</td>
			<td>最大激光重复频率**** 
			(MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O 或 D2O</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">100</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">50</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Static equilibrium; ΣFx≤0; diagram; physics; balance analysis; force vectors; stability conditions." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：小鼠大脑皮层成像中典型的三光子激发条件。 
*使用高数值孔径（~1.0）物镜、脉冲宽度约50 fs，以及典型荧光团（如荧光蛋白GFP和RFP）时的条件。 
**假设有效衰减长度（EAL）在整个皮层中均匀分布。 
***为在焦点处达到约1 nJ/脉冲的能量，根据EAL和成像深度计算得出。 
****根据物镜下的脉冲能量和激光器允许的最大功率计算得出。 
缩写：3P = 三光子；NA = 数值孔径；GFP = 绿色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；EAL = 有效衰减长度。

三光子显微镜能够以高时空分辨率对活体生物组织（如小鼠和斑马鱼大脑）深处进行高对比度荧光成像。

多光子显微技术，例如双光子显微术（2PM）和三光子显微术（3PM），是用于深层组织活体成像的有力工具……

该方案展示了如何在小鼠大脑和成年斑马鱼中进行活体深层组织三光子显微成像，这两种生物是生命科学领域重要的模型系统。长波长三光子显微技术能够实现对完整组织或器官在活体状态下高空间分辨率的成像，其成像深度是双光子显微技术无法达到的。该技术可帮助我们理解神经疾病（如阿尔茨海默病和自闭症）的潜在机制，这些疾病目前尚缺乏对大脑影响的全面认识。小鼠脑成像操作将由本实验室的博士后研究员 Kibaek Choe 演示，斑马鱼脑成像操作将由 Fetcho 研究实验室的研究助理 Kristine Kolkman 演示。首先，打开激光器，并将非共线光学参量放大器的闲频光输出中心波长设置为 1,300 或 1,700 纳米，然后在光路中放置脉冲压缩器，对飞秒激光进行预啁啾，以优化三光子成像的脉冲持续时间。将硅片与激光光路之间的角度设置为布儒斯特角，以最大化激光透射率，然后旋转硅片，通过最小化反射光来实现布儒斯特角。接着，放置翻转镜，以便在1,300和1,700纳米的光路之间方便切换。在旋转台上安装半波片，并配合偏振分束器以控制激光强度，然后在分束器的反射光路中放置光束挡块。准备一个培养皿，加入0.5厘米厚的2%高熔点琼脂。待琼脂冷却并凝固后，在琼脂中切出一个比斑马鱼更长且略宽的矩形孔。使用石蜡将细管固定在培养皿上，一端置于矩形孔中，另一端连接较大直径的管路至培养皿边缘。接下来，将鱼放入浓度为 0.2 毫克/毫升的三卡因溶液中进行麻醉，然后将麻醉后的鱼侧放在湿润的海绵上，使用微量注射器经眼后注射 3 微升泮库溴铵以使鱼体麻痹，并短暂将其置于 Hank's 溶液中以确保其完全麻痹。随后，将鱼背侧朝上放置于培养皿中，头部朝向导管，用镊子轻轻打开鱼的口腔，并将导管滑入口中。轻柔地将鱼向导管方向移动，使导管位于鱼口腔后部。迅速但轻柔地吸干鱼体周围培养基上的水分，并除去鱼体表面的水。取一小块实验室用纸巾，蘸取实验室胶水，将纸巾贴在鱼体两侧的培养基上，并覆盖在鱼鳃后方的背部。接着，将少量布比卡因直接滴加在鱼头表面，以麻醉鱼体皮肤，然后将盛有鱼的培养皿移至显微镜下。用鱼类养殖用水充满培养皿，并将管路连接至水泵，将系统中的水泵入鱼口中。确保通过气石对水进行充氧，并使用水族箱加热器将水温加热至30摄氏度。成像时，在三光子显微镜上安装低倍物镜，然后将装有鱼和管路的培养皿置于显微镜下，并使用LED光源照射培养皿以进行照明。在图像采集软件中，打开相机模式，点击“Live”，在屏幕右侧选择通道A，并调整直方图设置以清晰显示图像。将电机控制器的电机设置调至“base”后，降低物镜直至观察到斑马鱼。将鱼头中心置于视野中央，然后将物镜向上移动，远离鱼头。将低倍物镜更换为用于三光子成像的高数值孔径物镜，然后将其缓慢移近斑马鱼头部。将所有电机的轴值设为零。缓慢降低物镜，确保物镜不与头部发生物理接触。在CCD相机软件中，当头部顶端可见时停止移动物镜，并将X、Y和Z位置设为零。关闭LED光源，合上系统周围的暗帘，然后将成像采集软件设置为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下的激光功率设为低于一毫瓦。单击图像采集软件中的“实时”按钮。打开PMT通道，根据需要调整PMT增益和背景水平。缓慢上移物镜，通过监测大血管和窗口玻璃表面的三次谐波生成（THG）信号通道，定位颅骨窗口表面。当物镜接近颅窗时，在物镜与颅骨窗口之间滴加水，然后将所有电机的轴值设为零。单击图像采集软件中的“Live”按钮。打开PMT通道，根据需要调整PMT增益和背景水平，然后缓慢上移物镜，通过监测大血管和窗口玻璃表面的THG信号来定位盖玻片表面。如有需要，调整窗口方向，然后将电机归零，以定义脑表面位置。根据成像深度进行成像并调整功率水平。利用三光子显微镜，可实现对成年斑马鱼脑内遗传标记神经元的高分辨率、非侵入性和深层成像。还可观察到视顶盖和小脑中细胞层的分布情况。使用显微镜的摄像功能来定位鱼。颅骨在THG通道中可见，有助于导航大脑并找到其顶面。在成年大脑深处，神经元具有高信噪比，可清晰分辨。展示了成年小鼠脑中GCaMP6s标记的神经元、Texas Red标记的血管以及THG信号的多色三光子图像。通过系统优化，在海马体CA1区域，成功获得了距脑表面深达1.2毫米处的高对比度图像。在750微米深度处，GCaMP6s标记神经元在10分钟记录期间的钙活动轨迹显示出高保真的记录效果。该装置可用于观察神经元活动，以了解大脑功能。它还可用于追踪生物组织内的细胞运动，以研究多种生物系统。此外，还可测量血流速度，以监测动物的健康状况。

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来源：Hontani, Y., et al. 完整小鼠与斑马鱼脑中的深层组织三光子荧光显微镜技术. J. Vis. Exp.

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介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。...

利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

大规模二维电子显微镜（EM），即纳米解剖学，是指在组织范围内应用纳米级分辨率的电子显微镜技术。本文介绍了一种通用的纳米解剖学方法，用于研究健康状态下以及无创性脑损伤后的斑马鱼幼体脑组织。...

大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

学习深组织三光子荧光显微镜技术，用于小鼠和斑马鱼大脑的活体高分辨率成像。该方法可深入观察神经元结构与功能，助力阿尔茨海默病和自闭症等神经系统疾病的研究。

完整小鼠和斑马鱼脑组织中的深层组织三光子荧光显微镜成像

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