完整小鼠和斑马鱼脑组织中的深层组织三光子荧光显微镜成像

该方案展示了如何在小鼠大脑和成年斑马鱼中进行活体深层组织三光子显微成像，这两种生物是生命科学领域重要的模型系统。长波长三光子显微技术能够实现对完整组织或器官在活体状态下高空间分辨率的成像，其成像深度是双光子显微技术无法达到的。

该技术可帮助我们理解神经疾病（如阿尔茨海默病和自闭症）的潜在机制，这些疾病目前尚缺乏对大脑影响的全面认识。小鼠脑成像操作将由本实验室的博士后研究员 Kibaek Choe 演示，斑马鱼脑成像操作将由 Fetcho 研究实验室的研究助理 Kristine Kolkman 演示。首先，打开激光器，并将非共线光学参量放大器的闲频光输出中心波长设置为 1,300 或 1,700 纳米，然后在光路中放置脉冲压缩器，对飞秒激光进行预啁啾，以优化三光子成像的脉冲持续时间。

将硅片与激光光路之间的角度设置为布儒斯特角，以最大化激光透射率，然后旋转硅片，通过最小化反射光来实现布儒斯特角。接着，放置翻转镜，以便在1,300和1,700纳米的光路之间方便切换。在旋转台上安装半波片，并配合偏振分束器以控制激光强度，然后在分束器的反射光路中放置光束挡块。

准备一个培养皿，加入0.5厘米厚的2%高熔点琼脂。待琼脂冷却并凝固后，在琼脂中切出一个比斑马鱼更长且略宽的矩形孔。使用石蜡将细管固定在培养皿上，一端置于矩形孔中，另一端连接较大直径的管路至培养皿边缘。

接下来，将鱼放入浓度为 0.2 毫克/毫升的三卡因溶液中进行麻醉，然后将麻醉后的鱼侧放在湿润的海绵上，使用微量注射器经眼后注射 3 微升泮库溴铵以使鱼体麻痹，并短暂将其置于 Hank's 溶液中以确保其完全麻痹。随后，将鱼背侧朝上放置于培养皿中，头部朝向导管，用镊子轻轻打开鱼的口腔，并将导管滑入口中。轻柔地将鱼向导管方向移动，使导管位于鱼口腔后部。

迅速但轻柔地吸干鱼体周围培养基上的水分，并除去鱼体表面的水。取一小块实验室用纸巾，蘸取实验室胶水，将纸巾贴在鱼体两侧的培养基上，并覆盖在鱼鳃后方的背部。接着，将少量布比卡因直接滴加在鱼头表面，以麻醉鱼体皮肤，然后将盛有鱼的培养皿移至显微镜下。

用鱼类养殖用水充满培养皿，并将管路连接至水泵，将系统中的水泵入鱼口中。确保通过气石对水进行充氧，并使用水族箱加热器将水温加热至30摄氏度。成像时，在三光子显微镜上安装低倍物镜，然后将装有鱼和管路的培养皿置于显微镜下，并使用LED光源照射培养皿以进行照明。

在图像采集软件中，打开相机模式，点击“Live”，在屏幕右侧选择通道A，并调整直方图设置以清晰显示图像。将电机控制器的电机设置调至“base”后，降低物镜直至观察到斑马鱼。将鱼头中心置于视野中央，然后将物镜向上移动，远离鱼头。

将低倍物镜更换为用于三光子成像的高数值孔径物镜，然后将其缓慢移近斑马鱼头部。将所有电机的轴值设为零。缓慢降低物镜，确保物镜不与头部发生物理接触。

在CCD相机软件中，当头部顶端可见时停止移动物镜，并将X、Y和Z位置设为零。关闭LED光源，合上系统周围的暗帘，然后将成像采集软件设置为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下的激光功率设为低于一毫瓦。单击图像采集软件中的“实时”按钮。

打开PMT通道，根据需要调整PMT增益和背景水平。缓慢上移物镜，通过监测大血管和窗口玻璃表面的三次谐波生成（THG）信号通道，定位颅骨窗口表面。当物镜接近颅窗时，在物镜与颅骨窗口之间滴加水，然后将所有电机的轴值设为零。

单击图像采集软件中的“Live”按钮。打开PMT通道，根据需要调整PMT增益和背景水平，然后缓慢上移物镜，通过监测大血管和窗口玻璃表面的THG信号来定位盖玻片表面。如有需要，调整窗口方向，然后将电机归零，以定义脑表面位置。

根据成像深度进行成像并调整功率水平。利用三光子显微镜，可实现对成年斑马鱼脑内遗传标记神经元的高分辨率、非侵入性和深层成像。还可观察到视顶盖和小脑中细胞层的分布情况。

使用显微镜的摄像功能来定位鱼。颅骨在THG通道中可见，有助于导航大脑并找到其顶面。在成年大脑深处，神经元具有高信噪比，可清晰分辨。

展示了成年小鼠脑中GCaMP6s标记的神经元、Texas Red标记的血管以及THG信号的多色三光子图像。通过系统优化，在海马体CA1区域，成功获得了距脑表面深达1.2毫米处的高对比度图像。在750微米深度处，GCaMP6s标记神经元在10分钟记录期间的钙活动轨迹显示出高保真的记录效果。

该装置可用于观察神经元活动，以了解大脑功能。它还可用于追踪生物组织内的细胞运动，以研究多种生物系统。此外，还可测量血流速度，以监测动物的健康状况。