Name: 体外 使用分析、下拉和伴侣测定表征组蛋白伴侣 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习使用下拉实验、分析型尺寸排阻色谱、分析型超速离心和质粒超螺旋实验等体外生化技术，表征组蛋白伴侣蛋白的结合特性与核小体组装功能。该方法适用于染色质生物学研究。

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我们非常感谢印度政府科学与工程研究委员会 [CRG/2018/000695/PS] 和印度科学技术部生物技术部 [BT/INF/22/SP33046/2019] 向 Dileep Vasudevan 提供的外部资助，以及印度布巴内斯瓦尔生命科学研究所提供的所内支持。&#160;我们感谢 Sudeshna Sen 女士和 Annapurna Sahoo 女士在组蛋白制备方面的帮助。同时感谢与同事 Chinmayee Mohapatra 博士、Manas Kumar Jagdev 先生以及 Shaikh Nausad Hossain 博士的有益讨论。

1. 采用分析型尺寸排阻色谱法阐明组蛋白伴侣蛋白的寡聚状态及其稳定性
<ol>
	<li>组蛋白伴侣寡聚状态分析
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，用 1.2 柱体积（CV），即 28.8 mL 脱气的凝胶过滤缓冲液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl 和 1 mM β-巯基乙醇（β-ME）] 平衡 24 mL 分析级尺寸排阻色谱（SEC）柱（参见 材料表）。 
		注意：柱类型、缓冲液组成和缓冲液 pH 可根据目标蛋白进行选择。对于 24 mL 柱，样品进样体积不应超过 500 µL。此外，柱压需维持在 5 MPa 以下。</li>
		<li>从较高浓度的蛋白储备液中制备 500 µL 浓度为 0.5 mg/mL 的蛋白样品，溶于脱气的 SEC 缓冲液中，并使用 500 µL 进样环将其注入预先平衡好的色谱柱。在 4 °C 条件下，以 SEC 缓冲液进行等度洗脱，流速为 0.2–0.3 mL/min。</li>
		<li>通过在 280 nm 波长下检测吸光度来监测蛋白的洗脱曲线。对于缺乏芳香族残基的蛋白，应在 214 nm 波长下检测吸光度。</li>
		<li>利用蛋白的洗脱体积，结合标准校准曲线21计算其近似分子量（kDa）。 
		注意：校准曲线通过在同一色谱柱上洗脱已知分子量的蛋白，以它们的保留体积对各自分子量的对数（log Mr）作图而得。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组蛋白伴侣热稳定性分析
	<ol>
		<li>取 500 µL 用脱气 SEC 缓冲液配制的 0.5 mg/mL 蛋白样品（同 1.1.1 中所用），分别加入若干微量离心管中，于水浴中在 20 °C 至 90 °C 范围内的特定温度（20 °C、40 °C、60 °C 和 90 °C）加热 10 分钟。</li>
		<li>随后，在 4 °C 条件下以 16,200 × g 离心 10 分钟，用移液器收集上清液，并使用 500 µL 进样环将各样品分别注入已用 SEC 缓冲液在 4 °C 预先平衡好的分析柱中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 SEC 缓冲液进行等度洗脱，流速为 0.2–0.3 mL/min。</li>
		<li>观察洗脱峰的位置和峰高，并检查不同样品是否出现额外峰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组蛋白伴侣化学稳定性分析
	<ol>
		<li>为检测组蛋白伴侣的盐稳定性，将 500 µL 用 Tris 缓冲液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 和 1 mM β-ME] 配制的 0.5 mg/mL 蛋白样品分别加入含递增浓度 NaCl（300 mM、600 mM、1 M、1.5 M 和 2 M）的 Tris 缓冲液中，在不同微量离心管中于 4 °C 孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下以 16,200 × g 离心 10 分钟，保留上清液。</li>
		<li>接着，使用 500 µL 进样环，将不同 NaCl 浓度下的蛋白样品分别上样至已用相应缓冲液（含递增 NaCl 浓度）在 4 °C 预平衡 1.2 CV（28.8 mL）的分析柱中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以相应缓冲液进行等度洗脱，流速为 0.2–0.3 mL/min，洗脱体积为 1 CV（24 mL）。</li>
		<li>观察洗脱峰的位置和峰高，并检查不同样品是否出现额外峰。</li>
		<li>类似地，为进行尿素稳定性分析，将 500 µL 用 Tris 缓冲液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 和 1 mM β-ME]&#160;配制的 0.5 mg/mL 蛋白样品分别加入含递增尿素浓度（1 M、2 M、3 M、4 M 和 5 M）的缓冲液中，在不同微量离心管中于室温孵育 16 小时。在室温下以 16,200 × g 离心 10 分钟，保留上清液。</li>
		<li>接着，使用 500 µL 进样环，将经尿素处理的蛋白样品分别上样至已用相应缓冲液（含不同尿素浓度）在室温预平衡 1.2 CV（28.8 mL）的分析柱中。</li>
		<li>在室温下，以相应缓冲液进行等度洗脱，流速为 0.2–0.3 mL/min，洗脱体积为 1 CV（24 mL）。 
		注意：避免在较低温度下使用含尿素的缓冲液进行实验，因为尿素易结晶，可能损坏色谱柱。</li>
		<li>观察洗脱峰的位置和峰高，并检查不同样品是否出现额外峰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基于盐浓度梯度的下拉实验，用于解析组蛋白寡聚体与组蛋白伴侣蛋白复合物形成过程中所涉及的相互作用类型
<ol>
	<li>进行每次pull-down实验时，用移液器将40 µL Ni-NTA树脂加入离心柱中，并用无菌双蒸水洗涤。随后用100 CV（4 mL）平衡缓冲液[20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM NaCl、10 mM 咪唑、10 µg/mL BSA和1 mM β-ME]对树脂进行平衡（见材料表）。 
	注意：pull-down实验也可在1.5 mL微量离心管中进行。</li>
	<li>在平衡缓冲液中混合5 µM带His标签的组蛋白伴侣蛋白与20 µM组蛋白H2A/H2B二聚体或H3/H4四聚体，制备样品。将样品置于冰上孵育1小时。 
	注意：H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体由重组人组蛋白制备21，其寡聚体完整性通过分析型超速离心（AUC）测定的估计分子质量加以确认。以下所有实验均使用相同的组蛋白寡聚体。</li>
	<li>将步骤2.1中预先平衡的含Ni-NTA树脂的离心柱分别加入上述样品，每根柱子标记对应特定盐浓度，在4 °C孵育30分钟。以1000 × g 离心1分钟。</li>
	<li>接着，用含不同盐浓度（即300 mM、&#160;500 mM、600 mM、700 mM、800 mM、900 mM和1 M NaCl）的100 CV（4 mL）洗涤缓冲液[20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、50 mM 咪唑、0.2% Tween-20和1 mM β-ME]洗涤各柱。每根柱子使用对应特定盐浓度的缓冲液进行洗涤。</li>
	<li>盐梯度洗涤后，使用100 µL洗脱缓冲液[20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM NaCl、300 mM 咪唑和1 mM β-ME]从不同柱子中洗脱蛋白。</li>
	<li>随后，将洗脱的样品进行18% SDS-PAGE22，并用考马斯亮蓝R250染色后观察凝胶（见材料表）。或者，也可直接将树脂上样至SDS-PAGE凝胶，而不必将结合的蛋白从Ni-NTA树脂上洗脱。 
	注意：可根据目标蛋白的特性调整平衡、洗涤和洗脱缓冲液的组成及pH。</li>
</ol>
3. 竞争性下拉实验以鉴定组蛋白伴侣对 H2A/H2B 或 H3/H4 的偏好性
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 所述准备离心柱。</li>
	<li>将 5 µM 的组蛋白伴侣蛋白与 300 µL 平衡缓冲液（在步骤 2.1 中配制）中的 20 µM H2A/H2B 二聚体混合，冰上孵育 30 分钟。 
	注意：反应中组蛋白寡聚体与组蛋白伴侣蛋白的比例可根据已知的结合化学计量数据选择；若无相关信息，可使用五倍过量的组蛋白。</li>
	<li>将组蛋白伴侣蛋白-H2A/H2B 复合物在 4 °C 下以 16,200 × g 离心 5 分钟，以去除任何沉淀物。随后，将样品加载至预先用平衡缓冲液（在步骤 2.1 中配制）平衡的离心柱上，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl、50 mM 咪唑、0.2% Tween-20 和 1 mM β-ME] 洗涤柱子 100 CV（4 mL），以去除过量的 H2A/H2B 二聚体。接着，将组蛋白伴侣蛋白-H2A/H2B 复合物与 20–60 µM 的 H3/H4 四聚体混合，并在冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（在步骤 3.4 中配制）再次洗涤柱子 100 CV（4 mL），以去除未结合的 H3/H4 四聚体，并使用洗脱缓冲液（在步骤 2.5 中配制）洗脱样品。将洗脱的样品进行 18% SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝 R250 染色后观察结果。 
	注意：该检测可逆向进行，即首先将 H3/H4 四聚体与伴侣蛋白混合，使复合物结合至 Ni-NTA 琼脂糖珠，然后将该复合物与不同浓度的 H2A/H2B 二聚体孵育。</li>
</ol>
4. 分析型超速离心-沉降速度（AUC-SV）实验用于分析组蛋白伴侣蛋白与组蛋白之间的结合化学计量比
<ol>
	<li>用于 AUC 的样品制备
	<ol>
		<li>将重组的组蛋白 H2A/H2B 二聚体、H3/H4 四聚体以及组蛋白伴侣蛋白分别通过 7 kDa 截留分子量的透析袋，在透析缓冲液 [20 mM Tris (pH 7.5)、300 mM NaCl 和 1 mM β-ME] 中进行透析23（见材料表）。为尽量减少因缓冲液不匹配引起的背景误差，建议在 24 小时内对透析缓冲液进行至少三次充分透析。 
		注意：蛋白样品的初始 OD280 应为最终 OD280（0.3–0.5）的 2 至 3 倍，以抵消稀释效应。</li>
		<li>使用透析缓冲液（如步骤 1 所述）通过分析型尺寸排阻色谱法分别纯化 H2A/H2B 二聚体、H3/H4 四聚体和组蛋白伴侣蛋白。保存色谱运行过程中的缓冲液，用于后续稀释及作为 AUC 样品池中的参比液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AUC 样品上样
	<ol>
		<li>使用步骤 4.1.1 中的透析缓冲液，将纯化的蛋白混合至终体积为 450 µL，使 OD280 达到 0.3–0.6。在不同的反应管中，将组蛋白伴侣蛋白分别与 H2A/H2B 二聚体或 H3/H4 四聚体混合以形成复合物。将蛋白混合物孵育 2–3 小时。 
		注意：也可使用分析型超速离心机中的干涉光学扫描系统获取沉降数据。另外，在混合纯化蛋白时，固定组蛋白伴侣蛋白浓度，并与逐渐增加浓度的组蛋白寡聚体共孵育，以确定精确的化学计量比。</li>
		<li>按照先前详细描述的方法24，为 AUC-SV 实验组装带有双通道中心部件和石英窗的样品池，并使用分析型超速离心机的吸光度检测器。</li>
		<li>向样品池的两个通道（分别为样品通道和参比通道）中分别加入 400 µL 样品溶液和 420 µL 透析缓冲液。 
		注意：参比通道中使用较大体积的缓冲液，以确保参比液弯月面高于样品液弯月面。然而，若使用光学干涉系统，则两个通道应加入等体积的液体。</li>
		<li>称重并精确平衡样品池，然后将其装入四孔钛转子中（见材料表）。利用样品池和转子底部的标记对齐样品池。将转子装入离心机，关闭盖子，抽真空至压力低于 15 微米汞柱，并使转子温度稳定在 20 °C（通常需要 2–2.5 小时）。 
		注意：AUC 操作参数包括实验温度、转子转速、扫描间隔以及需采集的扫描次数。对于 SV 实验，扫描间隔根据蛋白分子质量设定；较小的蛋白需要更长的扫描时间间隔。转子转速也根据蛋白预期分子质量设定，实验在 20 °C 下进行。吸光度数据在 280 nm 处监测。</li>
		<li>为确定精确的化学计量比，保持组蛋白伴侣蛋白浓度恒定，并与逐渐增加浓度的组蛋白寡聚体孵育，直至达到饱和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AUC 数据分析
	<ol>
		<li>按照先前所述方法进行数据分析25。简而言之，使用程序 SEDNTERP26 计算缓冲液组分的密度和黏度（见材料表）。同样，基于蛋白的氨基酸组成，使用 SEDNTERP 计算其偏比容。</li>
		<li>将 AUC 仪器的数据导入程序 SEDFIT27，并定义弯月面（红线）、池底（蓝线）及数据分析边界（绿线）。选择连续 C(s) 分布作为分析模型。</li>
		<li>随后，将分辨率最大值设为 100；设定沉降系数 (s)，s min：0，s max：10–15；初始摩擦比设为 1.2，并选择浮动以从数据中推导该比值；设定置信水平（F 比值，决定正则化程度）为 0.68，对应 1 sigma 正则化；将偏比容、缓冲液密度和缓冲液黏度值设为 SEDNTERP 所得数值。</li>
		<li>点击RUN，使软件求解 Lamm 方程27。若出现显著的数据不匹配，调整参数。参数调整后，点击FIT以优化所有参数。根据均方根偏差（RMSD）值评估拟合质量，该值应小于 0.01 信号单位。</li>
		<li>在主工具栏的显示功能中选择“显示峰 &#34;Mw in c(s)&#34;”选项，估算各峰的分子质量，从而获得分子/复合物的“s”值信息。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 质粒超螺旋实验以验证组蛋白伴侣功能
<ol>
	<li>核小体组装反应
	<ol>
		<li>在组装缓冲液 [20 mM Tris HCl (pH 7.5)、1 mM DTT、1 mM MgCl2、0.1 mg/mL BSA 和 100 mM NaCl] 中，将 2 µM H3/H4 四聚体与 4 µM H2A/H2B 二聚体混合，并加入浓度递增的组蛋白伴侣（1–6 µM），总体积为 50 µL。在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>同时，在另一反应体系中，将 500 ng 负超螺旋 pUC19 质粒与 1 µg 拓扑异构酶 I（见材料表）在组装缓冲液中预处理，总体积为 50 µL，在 30 °C 下孵育 30 分钟。 
		注：拓扑异构酶 I 通过产生单链切口使超螺旋双链质粒 DNA 松弛。可使用真核来源的拓扑异构酶 I，例如市售的小麦胚芽拓扑异构酶 I 或重组表达的 Drosophila melanogaster 拓扑异构酶 I。</li>
		<li>随后，将 H3/H4 四聚体、H2A/H2B 二聚体与组蛋白伴侣的混合物（来自步骤 5.1.1）、已松弛的质粒 DNA 反应混合物（来自步骤 5.1.2）合并，在 30 °C 下继续孵育 90 分钟。 
		注：为该实验设置两个对照反应：一个包含组蛋白伴侣和已松弛的质粒 DNA（但不含组蛋白），另一个包含组蛋白寡聚体和已松弛的质粒 DNA（但不含组蛋白伴侣）。</li>
		<li>加入 100 µL 2× 终止缓冲液（40 mM EDTA、2% SDS 和 0.4 mg/mL 蛋白酶 K）以终止组装反应，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。 
		注：终止缓冲液通过使结合的组蛋白变性并降解，实现质粒 DNA 的去蛋白化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苯酚-氯仿抽提及乙醇沉淀
	<ol>
		<li>向含有步骤 5.1.4 反应混合物的离心管中加入等体积的 Tris 饱和苯酚，充分混匀，然后在室温下以 16,200 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>用微量移液器小心收集含有质粒 DNA 的上层水相，加入等体积氯仿，涡旋混匀后在室温下以 16,200 × g 离心 10 分钟。 
		注：此步骤可加入异戊醇以避免水相与有机相之间界面模糊。</li>
		<li>接着，收集上层水相，加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.5）和 2.5 倍体积的冰乙醇（见材料表）。通过反复倒置离心管 3–4 次充分混匀溶液，并将混合物置于 -20 °C 冰箱中 30 分钟，使质粒 DNA 完全沉淀。</li>
		<li>将步骤 5.2.3 的样品在 16,200 × g 下离心 10 分钟，小心弃去上清液。将离心管敞口置于室温，直至微量乙醇完全蒸发，管中留下沉淀的质粒 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行琼脂糖凝胶电泳以观察质粒超螺旋效应。
	<ol>
		<li>将步骤 5.2.4 中沉淀的质粒 DNA 溶解于无菌双蒸水中。</li>
		<li>在 1× Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液（40 mM Tris、20 mM 乙酸和 1 mM EDTA）中，使用 1% 琼脂糖凝胶分离样品（见材料表）。</li>
		<li>用 0.2–0.5 µg/mL 溴化乙锭染色凝胶，并在紫外光下观察以显示凝胶上的 DNA 条带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

本研究展示并验证了一套用于生化与生物物理表征潜在组蛋白伴侣蛋白的综合性实验方案。文中以重组表达并纯化的NAP家族蛋白AtNRP1和AtNRP2，以及AtFKBP53的N端核质素结构域为例，演示了这些实验方法。相同的一系列实验亦可广泛用于解析来自任何生物体的尚未被表征的组蛋白伴侣蛋白的功能特性。
方案部分的第一部分&#160;涉及组蛋白伴侣寡聚状态及其稳定性的研究。已有多个研究报告指出，组蛋白伴侣在寡聚状态上表现出显著的多样性。例如，人源CAF-1以单体形式存在29NAP家族成员以二聚体或四聚体形式存在29,30,31核质素呈现五聚体且常为十聚体的寡聚状态32,33分析型SEC实验可确定组蛋白伴侣的寡聚状态，AUC-SV实验可用于验证该...

由DNA和组蛋白构成的核小体是染色质的结构单元，调控多种关键的细胞事件。核小体可动态重定位和重塑，从而使DNA对复制、转录和翻译等过程具有可及性1,2。组蛋白具有高度碱性，倾向于与细胞环境中的酸性蛋白相互作用或发生聚集，从而导致多种细胞缺陷3,4,5。一类称为组蛋白伴侣蛋白的专一性蛋白可协助组蛋白从细胞质转运至细胞核，并防止异常的组蛋白-DNA聚集事件6,7。从根本上讲，大多数组蛋白伴侣蛋白可在生理离子强度下储存并将其转移至DNA上，从而促进核小体的形成8,9。某些组蛋白伴侣蛋白对组蛋白寡聚体H2A/H2B或H3/H4具有明确的偏好性10。
组蛋白伴侣根据其在依赖或不依赖DNA合成的情况下组装核小体的能力进行表征11例如，染色质组装因子-1（CAF-1）依赖于DNA合成，而组蛋白调控因子A（HIRA）则不依赖于DNA合成。12,13同样，核质素家族的组蛋白伴侣参与精子染色质去凝集和核小体组装。14核小体组装蛋白（NAP）家族成员促进核小体样结构的形成 体外 参与组蛋白在细胞质与细胞核之间的穿梭15核质素和NAP家族蛋白均为功能性组蛋白伴侣蛋白，但二者不共享任何结构特征。本质上，目前尚无单一的结构特征可用于将某种蛋白归类为组蛋白伴侣蛋白16功能分析、生物物理实验结合结构研究是表征组蛋白伴侣蛋白的最佳方法。
本研究描述了用于鉴定一种作为组蛋白伴侣蛋白并协助核小体组装的蛋白质的生化与生物物理方法。首先，采用分析型尺寸排阻色谱法分析组蛋白伴侣蛋白的寡聚状态及其稳定性。接着，通过下拉实验（pull-down assay）确定组蛋白伴侣与组蛋白相互作用的驱动力及其竞争性特征。然而，由于蛋白质的形状及其形成的复合物会影响其在色谱柱中的迁移行为，因此无法通过分析型尺寸排阻色谱法准确计算这些相互作用的流体动力学参数。为此，采用了分析型超速离心技术，该方法可提供溶液中大分子的精确参数，包括分子量、相互作用的化学计量比以及生物分子的形状。以往的研究已广泛使用体外（in vitro）组蛋白伴侣功能实验来对组蛋白伴侣蛋白进行功能表征，例如 yScS11617、DmACF18、ScRTT106p19 和 HsNPM120。组蛋白伴侣功能实验也被用于将其他蛋白质功能上鉴定为组蛋白伴侣。

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>MP Biomedicals</td><td>814326</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>MP Biomedicals</td><td>193983</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure 25M FPLC</td><td>Cytiva</td><td>29018226</td><td>蛋白质纯化仪器</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>An-60Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td>用于分析型超速离心的转子</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R 250</td><td>Sigma</td><td>1.15444</td><td></td></tr><tr><td>透析袋（7 kDa 截留分子量）</td><td>Thermo Fisher</td><td>68700</td><td>用于蛋白质样品透析</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>MP Biomedicals</td><td>100597</td><td></td></tr><tr><td>DNA 上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）</td><td>MP Biomedicals</td><td>194822</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Shimadzu</td><td>ATX224R</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭（EtBr）</td><td>Sigma</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>用于染色后凝胶成像</td></tr><tr><td>水平凝胶电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td>1704405</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳的仪器</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>MP Biomedicals</td><td>102033</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779</td><td>用于微升体积的移液操作</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000</td><td>用于 SDS-PAGE 的仪器</td></tr><tr><td>N,N-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>MP Biomedicals</td><td>800172</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>用于测定蛋白质和 DNA 浓度</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td>用于下拉实验的树脂珠</td></tr><tr><td>Optima AUC 分析型超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B86437</td><td>用于分析型超速离心的仪器</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT30130863</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.07393</td><td></td></tr><tr><td>pUC19</td><td>Thermo Fisher</td><td>SD0061</td><td>用于超螺旋实验的质粒</td></tr><tr><td>制冷高速离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 蛋白质分子量标准</td><td>Bio-Rad</td><td>1610317</td><td></td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>用于分析型超速离心数据分析的免费软件程序</td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>用于估算缓冲液黏度和密度以及蛋白质偏比容的免费软件程序</td></tr><tr><td>SigmaPrep 离心柱</td><td>Sigma</td><td>SC1000</td><td>用于下拉实验</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Merck</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>MP Biomedicals</td><td>102918</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>用于分析型尺寸排阻色谱的色谱柱</td></tr><tr><td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>29148721</td><td>用于分析型尺寸排阻色谱的色谱柱</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>1.10732</td><td></td></tr><tr><td>拓扑异构酶 I</td><td>Inspiralis</td><td>WGT102</td><td>用于质粒超螺旋实验的酶</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>MP Biomedicals</td><td>191450</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>N&amp;uuml;ve</td><td>NB 5</td><td>用于蛋白质样品的热处理</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇（&amp;beta;-ME）</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

体外利用分析、下拉及分子伴侣实验对组蛋白伴侣蛋白的表征

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

组蛋白与DNA结合形成真核生物染色质。染色质的基本单位是核小体，由一个组蛋白八聚体构成，该八聚体包含两份核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4，其外缠绕着DNA。该八聚体由两份H2A/H2B二聚体和一份H3/H4四聚体组成。带高度正电荷的核心组蛋白容易与细胞质和细胞核中的多种蛋白质发生非特异性相互作用。组蛋白伴侣是一类多样化的蛋白质，可将组蛋白从细胞质转运至细胞核，并协助其沉积到DNA上，从而促进核小体的组装过程。某些组蛋白伴侣特异性识别H2A/H2B或H3/H4，而另一些则可同时作为两者的伴侣。本实验方案描述了如何 体外 实验室技术如pull-down实验、分析型凝胶过滤层析、分析型超速离心以及组蛋白伴侣活性检测可联合使用，以验证某种特定蛋白是否具有组蛋白伴侣功能。

蛋白FKBP53的重组N端核质素结构域 拟南芥 经分析型SEC检测。将洗脱峰体积与标准曲线比对，以确定其寡聚状态。分析型SEC结果显示，该结构域在溶液中以五聚体形式存在，分子质量约为58 kDa（图1A，B）。此外，结合分析型SEC对核质素结构域进行了热稳定性和化学稳定性分析。经加热处理至多 90 °C 与在相同条件下保存的样品相比，洗脱体积和峰高均未表现出明显变化 20 °C，表明该结构域具有高度热稳定性（图1C）。同样，核质蛋白结构域在 NaCl 浓度高达 2 M 时仍表现出盐稳定性（图1D)以及高达4 M的尿素稳定性（图1E然而，核质素五聚体在较高浓度的尿素中开始解离。
采用梯度盐洗脱 pull-down 实验，分析组蛋白伴侣（AtFKBP53 的核质素结构域）与组蛋白寡聚体 H2A/H2...

本方案描述了一系列方法，包括采用分析型尺寸排阻色谱研究组蛋白伴侣的寡聚化状态与稳定性，通过下拉实验解析组蛋白伴侣与组蛋白之间的相互作用，利用分析超速离心分析蛋白复合物的化学计量比，以及开展组蛋白分子伴侣功能检测以对潜在的组蛋白伴侣进行功能性表征 体外.

组蛋白与DNA结合形成真核生物染色质。染色质的基本单位是核小体，由包含八个组蛋白的八聚体组成……

本方案描述了如何利用拉下实验、分析型尺寸排阻色谱、分析型超速离心以及组蛋白伴侣活性检测等技术，来验证一种蛋白质是否具有组蛋白伴侣功能。此处涵盖的技术若联合使用，可直接用于表征候选伴侣蛋白，并可与结构生物学技术相结合。这些技术适用于染色质研究领域。然而，根据需要，各个方法也可应用于任何其他目标蛋白。复杂的免疫共沉淀实验将由我实验室的博士生Surajit Gandhi先生进行演示；Archana Samal（一名博士生）与 Ruchir C. Bobde 先生共同完成分析型超速离心实验；Somanath Baral 先生（一名博士生）与 Ketul Saharan 先生共同完成质粒超螺旋实验。首先，在 300 微升平衡缓冲液中混合 5 µM 组蛋白伴侣蛋白与 20 µM H2A/H2B 二聚体。离心组蛋白伴侣蛋白-H2A/H2B 复合物，以去除任何沉淀物。将样品上样至预先用平衡缓冲液平衡的离心柱中。用100个柱体积或4毫升洗涤缓冲液洗涤柱子，以去除过量的H2A/H2B二聚体。接下来，将组蛋白伴侣H2A/H2B复合物与20至60微摩尔的H3/H4四聚体混合。用100个柱体积或4毫升洗涤缓冲液重新洗涤层析柱，以去除未结合的H3/H4四聚体，然后用洗脱缓冲液洗脱样品。将洗脱的样品进行18% SDS-PAGE电泳。随后，用考马斯亮蓝R250染色并观察凝胶。使用分析型尺寸排阻色谱法，分别用透析缓冲液纯化组蛋白伴侣中的H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体。保留色谱运行所用的缓冲液，用于后续稀释以及作为AUC样品池中的参比液。对于AUC样品，将纯化的伴侣蛋白分别与二聚体或四聚体在不同的离心管中混合，总体积为450微升，使用之前保留的透析缓冲液调节至OD280在0.3至0.6之间。使用分析型超速离心机配备的双通道中心部件和石英窗组装离心池。分别向参比通道和样品通道中加入 400 µL 样品溶液和 420 µL 透析缓冲液。称重并精确平衡离心池，然后将其装载到四孔钛转子中。使用细胞底部的标记和转子对齐细胞。将转子放入离心机中，关闭盖子并启动运行，以使真空形成且温度稳定。对于数据分析，使用程序 SEDNTERP 根据蛋白质的氨基酸组成计算蛋白质缓冲液组分的密度、黏度以及偏微比容。将AUC仪器的数据载入SEDFIT程序。定义弯月面（红线）、细胞底部（蓝线）以及数据分析范围（绿线）。选择连续c(s)分布作为模型。在参数部分，将分辨率最大值设置为100。接着，将沉降系数的最小值设为0，最大值设为10至15。初始时将摩擦比设为1.2，并选择浮动以从数据中推导该比值。将 F 比值设为 0.68 以进行一西格玛正则化。根据 SEDNTURP 获得的部分比容、缓冲液密度和黏度进行设置。按下“运行”以允许软件求解 lam 方程。按“拟合”以优化结果。在主工具栏的显示功能中选择“在CS中显示峰Mw”，以估算分子质量。在组装缓冲液中，将2微摩尔的H3/H4四聚体与4微摩尔的H2A/H2B二聚体混合，并加入浓度逐渐增加的组蛋白伴侣蛋白（范围为1至6微摩尔），最终体积为50微升。将混合物在 4 摄氏度孵育 30 分钟。同时，在终体积为 50 µL 的组装缓冲液中，用 1 µg 的拓扑异构酶 I 处理 500 ng 的负超螺旋 PUC-19 质粒。接着，将含有四聚体、二聚体和组蛋白伴侣的预混溶液与松弛的质粒 DNA 混合。加入100微升2X终止缓冲液，通过去除质粒DNA的蛋白质来终止连接反应。在含有反应混合物的试管中加入等体积的Tris饱和酚，并充分混匀反应混合物。然后，离心样品。用微量移液器轻轻收集含有质粒DNA的上层水相，并加入等体积的氯仿。涡旋混合该混合物。接着，收集上层水相，加入1/10体积的pH 5.5的3摩尔乙酸钠溶液和2.5体积的预冷乙醇。将溶液上下颠倒混匀3至4次。在16,200 G离心10分钟，轻轻弃去上清液。将离心管敞口置于室温，直至乙醇完全挥发，仅留下管中沉淀的质粒DNA。分析型SEC结果表明，拟南芥蛋白FKBP53的重组N端核质素结构域在溶液中为五聚体，分子量为65千道尔顿。对核质素样品进行热处理后显示，该结构域具有高度热稳定性。该核质素结构域在氯化钠浓度高达2摩尔、尿素浓度高达4摩尔的条件下均表现出盐稳定性和尿素稳定性。下拉实验证实，核质蛋白结构域与H2A/H2B二聚体的相互作用在氯化钠浓度高达0.4摩尔时仍保持稳定，而与H3/H4的结合则在高达0.7摩尔时仍稳定。该分子伴侣可同时结合H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体，且不受其加入顺序的影响，表明这两种寡聚体具有独立的结合位点。通过AUC-SV测定的分子质量显示，核质蛋白结构域与组蛋白寡聚体之间呈1:1的化学计量比。在质粒超螺旋实验中，重组植物组蛋白伴侣蛋白 AtNRP1 和 AtNRP2 增加了超螺旋质粒的数量，表明它们可将组蛋白沉积到 DNA 上形成核小体，从而引起 DNA 超螺旋。质粒超螺旋实验需要特别注意，并可能需要针对组蛋白、DNA 和伴侣蛋白的特性进行优化。异构体表征遥测技术可作为分析型凝胶过滤实验的后续手段，用于确认结合稳定性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

体外 使用分析、下拉和伴侣测定表征组蛋白伴侣

本方案描述了一种用于测量热激后细胞内蛋白质重折叠的方法。该方法可用于研究分子伴侣及其辅助因子，或能够影响其活性的化合物等折叠酶类。通过检测萤火虫荧光素酶的活性作为报告信号，以衡量分子伴侣的重折叠活性。...

细胞内复性实验

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。...

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

本视频介绍了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的方案，这是一种用于证明蛋白质与DNA相互作用的经典技术。该技术可用于鉴定人类慢性淋巴细胞白血病细胞中的靶基因。...

染色质免疫沉淀实验：一种用于研究细胞内蛋白质-DNA相互作用的技术

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

本研究描述了用于表征分子伴侣活性的生物物理、生物化学和分子技术 大肠杆菌...

pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内

染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。...

用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。...

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

本方案介绍了一种利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠和GST融合的TPR基序共伴侣蛋白，以及与Hsp90来源肽段偶联的受体微珠来检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。我们已应用该技术筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并鉴定出高效且选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。...

使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

学习使用下拉实验、分析型尺寸排阻色谱、分析型超速离心和质粒超螺旋实验等体外生化技术，表征组蛋白伴侣蛋白的结合特性与核小体组装功能。该方法适用于染色质生物学研究。

体外利用分析、下拉及分子伴侣实验对组蛋白伴侣蛋白的表征

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