体外利用分析、下拉及分子伴侣实验对组蛋白伴侣蛋白的表征

本方案描述了如何利用拉下实验、分析型尺寸排阻色谱、分析型超速离心以及组蛋白伴侣活性检测等技术，来验证一种蛋白质是否具有组蛋白伴侣功能。此处涵盖的技术若联合使用，可直接用于表征候选伴侣蛋白，并可与结构生物学技术相结合。

这些技术适用于染色质研究领域。然而，根据需要，各个方法也可应用于任何其他目标蛋白。复杂的免疫共沉淀实验将由我实验室的博士生Surajit Gandhi先生进行演示；

Archana Samal（一名博士生）与 Ruchir C. Bobde 先生共同完成分析型超速离心实验；Somanath Baral 先生（一名博士生）与 Ketul Saharan 先生共同完成质粒超螺旋实验。首先，在 300 微升平衡缓冲液中混合 5 µM 组蛋白伴侣蛋白与 20 µM H2A/H2B 二聚体。离心组蛋白伴侣蛋白-H2A/H2B 复合物，以去除任何沉淀物。

将样品上样至预先用平衡缓冲液平衡的离心柱中。用100个柱体积或4毫升洗涤缓冲液洗涤柱子，以去除过量的H2A/H2B二聚体。接下来，将组蛋白伴侣H2A/H2B复合物与20至60微摩尔的H3/H4四聚体混合。

用100个柱体积或4毫升洗涤缓冲液重新洗涤层析柱，以去除未结合的H3/H4四聚体，然后用洗脱缓冲液洗脱样品。将洗脱的样品进行18% SDS-PAGE电泳。随后，用考马斯亮蓝R250染色并观察凝胶。

使用分析型尺寸排阻色谱法，分别用透析缓冲液纯化组蛋白伴侣中的H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体。保留色谱运行所用的缓冲液，用于后续稀释以及作为AUC样品池中的参比液。对于AUC样品，将纯化的伴侣蛋白分别与二聚体或四聚体在不同的离心管中混合，总体积为450微升，使用之前保留的透析缓冲液调节至OD280在0.3至0.6之间。

使用分析型超速离心机配备的双通道中心部件和石英窗组装离心池。分别向参比通道和样品通道中加入 400 µL 样品溶液和 420 µL 透析缓冲液。称重并精确平衡离心池，然后将其装载到四孔钛转子中。

使用细胞底部的标记和转子对齐细胞。将转子放入离心机中，关闭盖子并启动运行，以使真空形成且温度稳定。对于数据分析，使用程序 SEDNTERP 根据蛋白质的氨基酸组成计算蛋白质缓冲液组分的密度、黏度以及偏微比容。

将AUC仪器的数据载入SEDFIT程序。定义弯月面（红线）、细胞底部（蓝线）以及数据分析范围（绿线）。选择连续c(s)分布作为模型。

在参数部分，将分辨率最大值设置为100。接着，将沉降系数的最小值设为0，最大值设为10至15。初始时将摩擦比设为1.2，并选择浮动以从数据中推导该比值。

将 F 比值设为 0.68 以进行一西格玛正则化。根据 SEDNTURP 获得的部分比容、缓冲液密度和黏度进行设置。按下“运行”以允许软件求解 lam 方程。

按“拟合”以优化结果。在主工具栏的显示功能中选择“在CS中显示峰Mw”，以估算分子质量。在组装缓冲液中，将2微摩尔的H3/H4四聚体与4微摩尔的H2A/H2B二聚体混合，并加入浓度逐渐增加的组蛋白伴侣蛋白（范围为1至6微摩尔），最终体积为50微升。

将混合物在 4 摄氏度孵育 30 分钟。同时，在终体积为 50 µL 的组装缓冲液中，用 1 µg 的拓扑异构酶 I 处理 500 ng 的负超螺旋 PUC-19 质粒。接着，将含有四聚体、二聚体和组蛋白伴侣的预混溶液与松弛的质粒 DNA 混合。

加入100微升2X终止缓冲液，通过去除质粒DNA的蛋白质来终止连接反应。在含有反应混合物的试管中加入等体积的Tris饱和酚，并充分混匀反应混合物。然后，离心样品。

用微量移液器轻轻收集含有质粒DNA的上层水相，并加入等体积的氯仿。涡旋混合该混合物。接着，收集上层水相，加入1/10体积的pH 5.5的3摩尔乙酸钠溶液和2.5体积的预冷乙醇。

将溶液上下颠倒混匀3至4次。在16,200 G离心10分钟，轻轻弃去上清液。将离心管敞口置于室温，直至乙醇完全挥发，仅留下管中沉淀的质粒DNA。

分析型SEC结果表明，拟南芥蛋白FKBP53的重组N端核质素结构域在溶液中为五聚体，分子量为65千道尔顿。对核质素样品进行热处理后显示，该结构域具有高度热稳定性。该核质素结构域在氯化钠浓度高达2摩尔、尿素浓度高达4摩尔的条件下均表现出盐稳定性和尿素稳定性。

下拉实验证实，核质蛋白结构域与H2A/H2B二聚体的相互作用在氯化钠浓度高达0.4摩尔时仍保持稳定，而与H3/H4的结合则在高达0.7摩尔时仍稳定。该分子伴侣可同时结合H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体，且不受其加入顺序的影响，表明这两种寡聚体具有独立的结合位点。通过AUC-SV测定的分子质量显示，核质蛋白结构域与组蛋白寡聚体之间呈1:1的化学计量比。

在质粒超螺旋实验中，重组植物组蛋白伴侣蛋白 AtNRP1 和 AtNRP2 增加了超螺旋质粒的数量，表明它们可将组蛋白沉积到 DNA 上形成核小体，从而引起 DNA 超螺旋。质粒超螺旋实验需要特别注意，并可能需要针对组蛋白、DNA 和伴侣蛋白的特性进行优化。异构体表征遥测技术可作为分析型凝胶过滤实验的后续手段，用于确认结合稳定性。