本实验方案的目的是描述一种由B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）诱导的绒毛膜羊膜炎的临床前动物模型。该研究旨在探讨其潜在的发病机制、与发育障碍之间的可能因果关系，并最终开发具有转化意义的抗炎性胎盘保护和神经保护治疗方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
* These authors contributed equally
本实验方案的目的是描述一种由B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）诱导的绒毛膜羊膜炎的临床前动物模型。该研究旨在探讨其潜在的发病机制、与发育障碍之间的可能因果关系，并最终开发具有转化意义的抗炎性胎盘保护和神经保护治疗方法。
B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）是妊娠期间人类中最常分离到的细菌之一。它是导致胎盘感染/炎症（称为绒毛膜羊膜炎）的主要原因。绒毛膜羊膜炎使发育中的胎儿面临器官损伤、围产期发病率和死亡率的高风险，以及终身神经行为障碍和其他非神经系统发育问题。从母体和胎儿组织中分离出的GBS最常见的两个亚型为血清型Ia（13%–23%）和III型（25%–53%）。本实验室已建立并表征了一种由GBS诱导的绒毛膜羊膜炎大鼠模型，用于研究其对发育中胎儿中枢神经系统的后续影响，并阐明其潜在的机制。本文介绍了该临床前大鼠模型的设计及其应用，该模型能够高度模拟人类GBS诱导的绒毛膜羊膜炎的典型特征。本文旨在帮助科研人员重现该实验设计，并通过提供故障排除示例给予支持。该模型还有助于揭示目前在由绒毛膜羊膜炎引发的多种发育障碍中尚未明确的病因、机制及潜在治疗途径。此外，该模型的应用还可拓展至研究围产期常见的严重非神经系统疾病，例如影响视网膜、肠道、肺和肾脏的疾病。本研究的主要关注领域是GBS诱导的胎儿神经发育障碍，如脑性瘫痪（cerebral palsy, CP）、注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）和自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）。本文将阐述支持该模型的理论依据，并随后介绍实验步骤与结果。
母体免疫激活（Maternal immune activation, MIA）被认为是早产、胎儿死亡以及子代终身认知和行为障碍的最重要独立风险因素之一1,2,3,4。目前大量关于妊娠期炎症对胎盘及发育结局影响的临床前研究，通常使用病原体成分来模拟感染，例如来自大肠杆菌（E. coli）的脂多糖（LPS），以及模拟病毒感染的病毒双链RNA合成类似物——聚胞苷酸：聚肌苷酸（Poly[I:C]）。然而，尽管B族链球菌（Group B Streptococcus, GBS）是围产期感染最常见的致病原，但针对其在炎症机制中的作用及相关结局的动物模型研究仍十分有限5。
GBS 是一种有荚膜的革兰氏阳性球菌，约 15%–30% 的孕妇下生殖道会定植该菌6。它可导致胎盘感染/炎症，称为绒毛膜羊膜炎7,8。在十种 GBS 血清型中，Ia 型和 III 型是最常见的血清型，是母胎组织损伤的主要感染....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所有实验均经麦吉尔大学健康中心研究所（RI-MUHC）批准，并按照加拿大动物护理委员会的规定进行。
1. 妊娠Lewis大鼠
2. 细菌生长
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
GBS 腹腔接种导致胎盘感染
免疫组织化学（IHC）（使用靶向 GBS Ia 血清型的多克隆抗体）染色显示，GBS 感染已到达胎盘的蜕膜区。感染还从蜕膜扩散至迷路层、绒毛膜板，某些情况下甚至波及胎儿，导致胎儿死亡（GBS 暴露组为 5.8 ± 0.8 只活胎，对照组（CTL）为 9.3 ± 0.6 只活胎）18。因此，与未暴露胎儿相比，GBS 暴露胎儿出生时的产仔数减少18。在同窝仔鼠中观察到胎盘感染程度不一致的现象。所有母鼠及其新生仔鼠的 GBS 感染均为自限性，但部分母鼠出现 GBS 菌血症/败血症15。出现此类感染播散的母鼠同时表现出更强的促炎性细胞因子反应13。在出生后第1天（P1）的仔鼠中未检测到 GBS 阳性血培养14。妊娠晚期感染未影响母鼠行为。在出生后期间，GBS 暴露的仔鼠未出现死亡。
.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
实验方案中的关键步骤
该实验方案中有多个步骤至关重要，需要进行一些质量控制。例如，GBS 菌种可能存在被其他病原体污染的风险。可通过适当的 GBS 微生物鉴定技术快速识别这一问题，例如观察 GBS 在 BHI 琼脂上的菌落特征（如大小、形状、颜色），或将 β-溶血性 GBS 接种量平行划线接种于含 5% 绵羊血的哥伦比亚血琼脂和 CHROMID Strepto B 琼脂上，后者是一种用于 GBS 筛查的选择性显色培养基。
另一个问题是，一些母鼠是无症状的GBS携带者。因此，理论上在未接种GBS的对照组母鼠中也可能发生偶然感染。然而，在我们的实验中，对照组动物胎盘的GBS染色从未检测到GBS诱导的绒毛膜羊膜炎。如果这种极不可能的情况发生，也不会显著影响我们所提出的实验设计。基于这一原因，无需使用无病原体动物。
保护感染的母体及其后代免受过度应激至关重要。任何在感染基础上增加的应激都可能对实验动物产生有害影响。因此，必须高度重视适当的饲养管理、温和安抚的动物操作方式、防止背景噪音干扰、.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无经济利益冲突。
本研究由麦吉尔大学健康中心研究所（RI-MUHC）和加拿大卫生研究院（CIHR）资助。以下资助机构、院校和基金会为本研究的开展提供了支持：加拿大卫生研究院（CIHR）、Stars基金会、魁北克科学研究基金（FRQS）、麦吉尔大学和舍布鲁克大学。衷心感谢法国巴黎第七大学丹尼斯·狄德罗大学的克莱尔·波亚尔博士（Dr. Claire Poyart）和加拿大蒙特利尔大学的玛丽拉·塞古拉博士（Dr. Mariela Segura）慷慨提供GBS菌株。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 无菌管 | BD 生物科学 | ||
| 50 ml 离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339652 | |
| 刀片或手术刀 | BD Medical | 371716 | |
| 脑心浸液肉汤 | Criterion（Hardy diagnostics） | C5141 | |
| CHROMID Strepto B 琼脂平板 | 生物梅里埃，Saint-Laurent | 43461 | |
| 5% 羊血哥伦比亚血琼脂培养基 | 赛默飞世尔科技 | R01215 | |
| 上游引物 | 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3' | Sigma | |
| 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson and Co（BD） | 324702 | |
| Lewis大鼠 | 查尔斯河实验室 | ||
| 甲基丁烷 | Sigma Aldrich | M32631 | |
| Microtainer 血液采集管 | Becton, Dickinson and Co（BD） | 365965 | |
| 反向引物 | 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3' | Sigma | |
| 1 mL 血清移液管 | 赛默飞世尔科技 | 170353N | |
| 10 mL 血清移液管 | 赛默飞世尔科技 | 170356N | |
| 25 mL 血清移液管 | 赛默飞世尔科技 | 170357N | |
| 5 mL 血清移液管 | 赛默飞世尔科技 | 170355N | |
| Superfrost Plus 显微载玻片，优质 | VWR | CA48311-703 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本文已发表
视频即将推出