Name: 纸基脚趾开关诊断开发和患者验证的设计到实施研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习纸基分子诊断技术的设计与验证方法，利用无细胞脚趾开关传感器检测病毒RNA。该方案支持定制化检测多种核酸序列，适用于资源有限地区的分散式医疗诊断场景。

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作者感谢 Green、Pardee 和 Pena 实验室的所有成员，以及此前与本论文所述工作相关的所有论文的共同作者。S.J.R.d.S. 获得了巴西伯南布哥科学技术基金会（FACEPE）提供的博士奖学金资助，项目编号为 IBPG-1321-2.12/18，目前由加拿大多伦多大学资助的博士后奖学金支持。P.B. 获得了多伦多大学药学院颁发的 William Knapp Buckley 奖项支持。M.K. 获得了多伦多大学精准医学计划（PRiME）内部奖学金项目 PRMF2019-002 的支持。本研究工作获得了加拿大研究主席计划（文件编号 950-231075 和 950-233107）、多伦多大学重大科研项目管理基金、加拿大卫生研究院（CIHR）基础资助计划（201610FDN-375469）对 K.P. 的资助，以及加拿大卫生研究院/国际发展研究中心（CIHR/IDRC）团队资助项目“加拿大—拉丁美洲—加勒比寨卡病毒计划”（FRN: 149783）对 L.P.、A.A.G. 和 K.P. 的资助。此外，K.P. 还通过加拿大2019新型冠状病毒（COVID-19）快速研究资助计划，获得了加拿大国际发展研究中心（IDRC）的资金支持（资助编号 109434-001）。A.A.G. 的研究也获得了亚利桑那州生物医学研究委员会新研究者奖（ADHS16-162400）、盖茨基金会（OPP1160667）、美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖（1DP2GM126892）、NIH R21 项目（1R21AI136571-01A1，授予 K.P./A.A.G.）以及阿尔弗雷德·P·斯隆基金会（Alfred P. Sloan Fellowship，FG-2017-9108）的资助。图1 使用 Biorender.com 在 K.P. 的学术许可下制作。

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<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
</ol>

K.P. 和 A.A.G. 是基于纸张的toehold传感器相关技术的共同发明人。Y.G.、S.C. 和 K.P. 是 LSK Technologies, Inc. 的联合创始人，也是 PLUM 相关技术的共同发明人。M.K.、K.P. 和 A.A.G. 是 En Carta Diagnostics Ltd. 的联合创始人。其他作者无利益冲突。专利信息如下：PLUM 设备：Y.G.、S.C. 和 K.P. 的专利申请由多伦多大学提交，并转让给 LSK Technologies Inc.，美国临时专利申请号 62/982,323，提交于 2020 年 2 月 27 日；Toehold 开关专利：A.A.G.、P.Y. 和 J.J.C.，“核糖调控元件组合物及其使用方法”，专利号 WO2014074648A3，提交于 2012 年 11 月 6 日；基于纸张的诊断专利：K.P. 和 J.J.C.，“基于纸张的合成基因网络”，美国专利申请号 US15/963,831，提交于 2013 年 12 月 6 日；寨卡病毒专利 1：K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F. 和 J.J.C.，“便携式低成本病毒检测与毒株鉴定平台”，美国临时专利申请号 62/403,778，提交于 2016 年 10 月 4 日；寨卡病毒专利 2：K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F. 和 J.J.C.，“便携式低成本病毒检测与毒株鉴定平台”，美国临时专利申请号 62/341,221，提交于 2016 年 5 月 25 日。

本文所述的集成化纸质检测系统可将具有临床相关性的分子诊断技术带到现场即时检测场景，其性能在功能上可与RT-qPCR相媲美6。尤为重要的是，在偏远地区，现场诊断技术的可用性可将检测结果的等待时间从数天缩短至数小时。该方法具有良好的可编程性，所描述的检测流程几乎可用于检测任何病原体目标。我们将分子检测工具与专门设计的便携式酶标仪相结合，该设备结构紧凑，支持电池供电（8–9小时），并具备板载数据分析功能，适用于分布式应用场景。在其他研究中，我们已使用268份患者样本对该集成硬件与寨卡病毒诊断平台进行验证，同时与RT-qPCR平行比对，结果显示诊断准确率达到98.5%24。综上所述，我们的目标是推动该平台的技术转移，使研究人员能够重新利用并持续改进该系统，以满足尚未被满足的诊断需求。
这 计算机模拟 toehold开关设计流程已被整合并自动化为一个可分为三个阶段的流程。第一阶段生成一组toehold开关设计池，这些设计以单核苷酸递增的方式与目标序列杂交。第二阶段分析二级结构及toehold开关的可及性，并剔除含有同框提前终止密码子的传感器。随后采用综合考虑多个因素（如toehold开关缺陷水平、toehold开关可及性及目标位点可接近性）的评分函数，根据总体得分筛选出最优的toehold开关设计方案。在最后阶段，生成最优toehold开关设计及其对应目标触发序列的序列列表。最优传感器序列应使用NCBI/Primer-BLAST针对人类转录组及密切相关的病毒基因组进行特异性筛查。25还应最好对寨卡病毒基因组中的传感器靶标位点进行序列保守性筛查，以确保传感器能够实现广泛且稳健的检测。目前已开发出多个版本的趾控开关（toehold switch）设计软件，其设计算法允许用户生成两种版本，即A系列6&#160;或B系列脚趾开关6本文重点介绍B系列趾控开关的设计。
在商业合成DNA之后，可快速组装足垫开关，并通过针对目标基因组短区域（200-300 nt）的合成靶标触发序列进行初步筛选来测试其性能。在筛选基于足垫开关的传感器性能时，理想的方法是以RNA形式加入靶标序列。本文所述步骤用于添加 体外 已概述转录的触发RNA的使用方法。然而，如果有条件，也可使用全长基因组模板，例如定量的病毒RNA提取物、商业化的合成RNA基因组或标准品。在初始的趾头开关筛选中使用全长RNA基因组具有优势，因为它可揭示RNA二级结构等额外因素是否会影响传感器的性能。为了优化候选开关的开启/关闭比率，可将趾头开关DNA逐步滴定加入无细胞反应体系中。该步骤还可用于鉴定性能优异的趾头开关（如具有高倍数扩增或高开启/关闭比率），并排除泄漏性强的趾头开关（即在无目标RNA存在时信号仍较高），从而避免其进入后续的表征步骤。
为了提高性能最优的趾头开关候选物的检测限，采用核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术将临床相关浓度的靶标寨卡病毒RNA扩增至趾头开关可检测的水平6。通过筛选不同组合的正向与反向引物，确定最佳的NASBA引物与趾头开关组合，以实现在临床相关浓度下的检测。一旦确定了理想的引物组和趾头开关组合，该检测方法将进入临床验证阶段。需要注意的是，趾头开关与NASBA的筛选阶段可能耗费较多人力和资源，因此测试开发最适合在资源充足的科研场所进行。尽管我们尚未应用流程自动化，但自动化技术有望加速“设计—构建—测试”的迭代循环32。幸运的是，从传感器设计、测试到部署的周转时间可以非常短（少于一周），这使得该策略特别适用于疫情暴发等时间紧迫的情况6。
即使已经开发出具有临床相关灵敏度的生物传感器，仍存在需要解决的技术挑战。由于本实验方案涉及手动操作且为多步骤流程，因此存在样本间交叉污染的风险。我们通过严谨的实验室操作尽可能降低此类风险。在一项包含268例患者样本的近期临床试验中，未发现任何污染问题；然而，这仍是实验过程中需要重点考虑的因素。24因此，该方案仍属于实验室检测，需要由熟练掌握分子生物学技术的专业人员操作。部署时还需考虑其他因素&#160;从患者样本中分离RNA。本文描述了使用基于柱法的核酸提取试剂盒进行RNA提取的方法。然而，在其他研究中，我们已证明了一种有效且简单的煮沸裂解法（95 °C，2分钟），适用于低载量患者样本的处理6该策略几乎消除了成本&#160;与RNA提取相关，且避免使用基于离心柱的核酸提取试剂盒，这类试剂盒在资源有限的环境中可能带来物流挑战，或在危机期间（如COVID-19大流行）出现供应链问题33.
正如我们在新冠疫情期间所见，用于进行RT-qPCR的仪器本身可能成为瓶颈，限制患者获得检测的机会。这一因素在很大程度上也涉及经费问题，导致检测模式趋于集中化&#160;可能会限制诊断的可及性。例如，在2015/2016年寨卡病毒暴发期间，巴西仅有五个国家级参考实验室，导致患者检测延误。如果不考虑规模经济可能带来的成本优势，便携式酶标仪当前的物料成本约为500美元，即使将人工和商业利润计入而使成本增加五倍，该仪器仍具有良好的可负担性。相比之下，实时荧光定量PCR仪的价格范围为15,000至90,000美元34此外，拉丁美洲无细胞检测方法的单次测试成本估计约为5.48美元，而在寨卡病毒暴发期间，巴西RT-qPCR检测的单次测试成本约为10至11美元。36. 除了设备成本之外，便携式酶标仪体积小巧（20 cm3），自动分析，数据上传至云端 通过 互联网连接，并可由电池供电运行。这些特点极大地拓展了检测设备的潜在应用场所，同时扩大了可服务的患者群体。
迄今为止，最常见的商业化大肠杆菌（E. coli）无细胞蛋白表达系统（CFPS）平台是 S30 和 PURE 系统37；然而，在中低收入国家扩大诊断技术可及性的一个关键制约因素是这些试剂在国内的供应极为有限。解决这一挑战的重要一步是实现本地化 CFPS 生产。Federici 实验室近期在开发非商业化平台方面取得了显著进展，该平台可在基于裂解液的无细胞系统中实现足垫开关（toehold switch）传感器的应用，并对寨卡病毒 RNA 达到 2.7 fM 的检测限（LOD）14。这一成果不仅使得试剂可在使用国本地生产，避免进口关税和运输延误，而且人工成本也按当地标准计算，从而显著降低总体成本。根据 Federici 团队所述的研究工作，在智利生产一次 CFPS 表达反应（5 µL）的成本为 6.9 美分（USD）35,38，为推广基于裂解液的系统提供了双重优势（优化物流与降低成本）35,38。
将可与RT-qPCR相媲美的检测技术应用于分布式诊断网络，相较于目前依赖将样本运送至集中式RT-qPCR检测中心的常规做法，具有显著优势。在寨卡病毒病例较为集中的城乡结合地区，患者与诊断机构之间的物理距离会延缓诊断进程，并增加检测结果无法在临床关键时间内送达患者的风险。我们希望，本文所展示的工作能够通过知识的传递，助力科研界开发出用于人类健康、农业和环境监测的去中心化生物技术及便携式硬件设备。

由于具有优异的灵敏度和特异性，RT-qPCR 一直是临床诊断的金标准技术。尽管该方法高度稳健，但其依赖昂贵且专用的设备和试剂，且这些试剂需要温控运输和储存，这在全球范围内对高质量诊断技术的可及性构成了重大障碍，尤其是在疾病暴发期间以及实验室资源有限的地区1,2。2015/2016年巴西寨卡病毒暴发期间就出现了这种情况。当时仅有五个集中式实验室可提供 RT-qPCR 检测，导致严重的检测瓶颈，限制了诊断的可及性，对城郊地区人群尤为不利，这些人群受疫情的影响更为严重3,4。为提高诊断可及性，本方案展示了一种已开发的平台，有望在资源匮乏地区实现去中心化、低成本、高通量的诊断。作为该平台的一部分，建立了一条诊断发现流程，将等温扩增技术与基于合成RNA开关的传感器结合，并整合基于纸质的无细胞表达系统5,6。
无细胞蛋白合成（CFPS）系统，特别是基于E. coli的无细胞系统，已成为多种生物传感应用的有吸引力平台，应用范围涵盖环境监测7,8到病原体诊断5,6,9,10,11,12。CFPS系统包含转录和翻译所需的全部组分，相较于全细胞生物传感器具有显著优势。具体而言，其检测过程不受细胞壁限制，且通常具有模块化设计、生物安全性高、成本低廉，并可冻干以实现便携使用。将基于基因回路的反应冻干固定于纸张或纺织品等基底上的能力，使得检测体系可运输、在室温下长期储存5，甚至可集成至可穿戴设备中13。
先前的研究表明，E. coli 无细胞系统可用于检测多种分析物，例如汞等有毒金属、四环素类抗生素7,14、内分泌干扰物15,16、马尿酸等生物标志物17、病原体相关群体感应分子9,18，以及可卡因17和γ-羟基丁酸（GHB）19等非法物质。针对核酸的序列特异性检测，目前的策略主要依赖于基于开关的生物传感器与等温扩增技术相结合的方法。趾控开关（toehold switches）是一类合成型核糖调控元件（在本文后续部分中简称为“开关”），其包含一个发夹结构，可通过封闭核糖体结合位点（RBS）和起始密码子来阻断下游翻译。当其与目标触发RNA结合后，发夹结构被打开，从而启动报告基因开放阅读框的翻译20。
等温扩增也可用于分子诊断21；然而，这些方法容易发生非特异性扩增，从而降低检测的特异性，导致其准确性低于RT-qPCR22。在本研究中，将基于开关的传感器上游结合等温扩增，以实现联合信号放大，从而达到临床相关的核酸检出水平（飞摩尔至阿摩尔）。这两种方法的结合还提供了两个序列特异性的检测关卡，共同作用可实现高特异性。采用该策略，先前的研究已成功检测了包括寨卡病毒6、埃博拉病毒5、诺如病毒10在内的病毒，以及C. difficile23和耐药性伤寒沙门菌12等致病菌。最近，无细胞趾头开关已被用于SARS-CoV-2的检测，以期在COVID-19大流行期间提供可及的诊断手段11,12,13。
以下方案概述了用于寨卡病毒检测的无细胞、基于纸张的合成趾控开关检测方法的开发与验证过程，内容涵盖从in silico生物传感器设计、组装与优化步骤，直至使用患者样本进行实地验证。本方案首先进行基于RNA趾控开关的传感器及针对寨卡病毒RNA的等温扩增引物的in silico设计。尽管存在多种等温扩增方法，本文展示了基于核酸序列的扩增技术（NASBA）的应用，该方法可提高反应中病毒RNA靶标的浓度，从而实现具有临床意义的检测灵敏度。实际上，等温扩增方法具有在恒定温度下运行的优势，无需热循环仪等专用设备，而此类设备通常仅限于集中式实验室使用。
接下来，描述通过重叠延伸 PCR 将合成的趾控开关传感器与报告基因编码序列组装在一起的过程，并利用合成 RNA 在无细胞系统中筛选性能最优的合成趾控开关传感器。针对这组寨卡病毒传感器，我们选择了编码 β-半乳糖苷酶的 lacZ 基因，该酶能够切割比色底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷（CPRG），产生由黄色到紫色的颜色变化，可通过肉眼或酶标仪检测。在确定表现最佳的合成开关后，进一步描述利用合成 RNA 筛选针对相应目标序列的基于核酸序列的等温扩增引物的过程，以找出灵敏度最佳的引物组合。
最后，在拉丁美洲对诊断平台的性能进行现场验证（图1）。为了确定临床诊断准确性，使用寨卡病毒患者样本进行基于纸张的无细胞检测；同时并行开展金标准RT-qPCR检测作为对照。为监测比色法无细胞检测结果，我们在缺乏热循环仪的地区实现了现场结果的定量分析。本文还介绍了手工组装的平板读数仪——便携式、低成本、用户友好、多模式读数仪（Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal，简称PLUM；下文称便携式平板读数仪）24。该设备最初作为无细胞合成toehold开关诊断技术的配套装置开发，便携式平板读数仪为高通量孵育和读取结果提供了便捷的解决方案，并为用户提供集成的、基于计算机视觉的软件分析功能。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg" /> 
图 1：使用基于纸张的无细胞趾头开关反应检测患者样本的工作流程。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>384 孔板盖 - 铝制</td><td>Sarstedt</td><td>95.1995</td><td>用于在将 384 孔板插入 PLUM 读板仪之前覆盖孔板</td></tr><tr><td>384 孔板盖 - 透明</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td>用于在将 384 孔板插入 BioTek 读板仪之前覆盖孔板</td></tr><tr><td>384 孔板</td><td>VWR</td><td>CA11006-180</td><td>2 mm 纸基诊断器件被放置于这些孔板的孔中用于定量分析</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioShop Canada</td><td>AGA001.500</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001.500</td><td>用于 Whatman 滤纸的封闭剂</td></tr><tr><td>无细胞反应体系</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800L</td><td>PURExpress</td></tr><tr><td>CPRG</td><td>Roche</td><td>10884308001</td><td>氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷</td></tr><tr><td>一次性无菌活检打孔器</td><td>Integra Miltex</td><td>23233-31</td><td>用于制备可放入 384 孔板的 2 mm 纸片</td></tr><tr><td>DNA酶 I</td><td>Thermo Scientific</td><td>K2981</td><td>体外转录反应孵育后消化模板 DNA</td></tr><tr><td>DNA酶 I 试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>74104</td><td>用于从体外转录 RNA 中去除模板 DNA 的 DNase I 试剂盒</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487</td><td>用于运行琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>ChemiDoc XRS+ 成像系统</td></tr><tr><td>体外转录试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>用于体外转录开关筛选所需的模板（触发）RNA</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>用于测定核酸浓度</td></tr><tr><td>NASBA 试剂盒</td><td>Life Sciences Advanced Technologies</td><td>NWK-1</td><td>等温扩增反应组分</td></tr><tr><td>无核酸酶水 H2O</td><td>invitrogen</td><td>10977015</td><td>添加至反应混合物中</td></tr><tr><td>PAGE 电泳系统</td><td>Biorad</td><td>1658001FC</td><td>用于制备和运行聚丙烯酰胺凝胶</td></tr><tr><td>pCOLADuet-LacZ DNA</td><td>Addgene</td><td>75006</td><td>https://www.addgene.org/75006/</td></tr><tr><td>Phusion 聚合酶/反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>读板仪</td><td>BioTek</td><td>BioTek NEO2</td><td>多功能读板仪，Synergy Neo2</td></tr><tr><td>引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>定制寡核苷酸合成</td></tr><tr><td>Q5 聚合酶/反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>Qiagen PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>RNA 上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>2X RNA 上样染料</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>EN0521</td><td>QIAamp 病毒 RNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td>用于防止 RNase A、B 和 C 的污染</td></tr><tr><td>RT-qPCR 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>208352</td><td>QuantiNova 探针 RT-PCR 试剂盒</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen S11494</td><td>S11494</td><td>用于聚丙烯酰胺凝胶中核酸染色</td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>BioShop Canada</td><td>TAE222.4</td><td>凝胶电泳缓冲液</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td>用于温度循环和反应孵育</td></tr><tr><td>Whatman 42 滤纸</td><td>GE Healthcare</td><td>1442-042</td><td>用于嵌入纸基诊断器件中的分子组分</td></tr></tbody></table>

基于纸张的趾控开关诊断工具的开发与患者验证：从设计到实施的研究

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

获得可部署到社区用于检测的低负担分子诊断技术正变得越来越重要，这对社会福祉和经济稳定具有深远的广泛影响。近年来，为满足快速、低成本分子诊断的需求，已涌现出多种新型等温诊断技术。我们通过开发基于趾头开关（toehold switch）的诊断方法并进行患者验证，为此领域作出了贡献，其中包括针对蚊媒传播的寨卡病毒和基孔肯雅病毒的诊断技术，其性能可与金标准逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测相媲美。这些诊断方法研发和生产成本低廉，有望为资源匮乏的环境提供诊断能力。本文提供的方案详述了开发用于寨卡病毒检测的趾头开关诊断法所需的全部步骤。文章引导读者逐步了解诊断开发过程：首先，以寨卡病毒的基因组序列作为输入，利用开源软件进行候选开关的计算设计；随后展示如何利用合成RNA序列对传感器进行组装、实证筛选以及诊断灵敏度的优化；最后，使用患者样本与RT-qPCR平行开展验证，并结合专用光学读取仪PLUM进行检测。本研究为研究人员提供了一条技术路线图，用于开发低成本的基于趾头开关的传感器，以应用于人类健康、农业及环境监测领域。

按照计算设计流程，通过 PCR 构建了三个趾控开关。使用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物（图 2）。在约 3,000 bp 处出现清晰条带，大致对应于与趾控开关偶联的 lacZ 基因的大小，通常表明反应成功。相反，若泳道中无条带、出现多条带或条带大小不符，则表明 PCR 失败。若 PCR 失败，应优化反应条件和/或引物序列。
组装的趾控开关经过筛选，以评估每种传感器对其相应目标的响应性能 体外 转录的触发RNA (图3）。尽管这三种传感器均显示出OD值升高570 吸光度，开关&#160;27B图3A) 的结合速率最快。开关 33B 以及程度较轻的 47B 显示出 OD 值升高570 在无目标触发RNA存在时的吸光度，表明这些开关具有一些背景活性或渗漏性（图3B,C)-这一特性在候选传感器中并不理想，因为它会降低特异性。为了更清晰地识别出具有最高开/关信号比的传感器，需计算OD的倍数变化570 吸光度已计算（见补充信息第5部分）并绘图（图4）。由此分析可知，开关27B是具有最佳ON/OFF性能的传感器&#160;约60的比例。
通过测定激活该表现最优的toehold开关（27B）所需的最低RNA浓度，评估其灵敏度&#160;当与 NASBA 反应联用时，该图显示，性能最佳的寨卡病毒传感器可检测低至每 1.24 个分子的 RNA 浓度 &#181;L （相当于约 2 aM； 图5).
在鉴定并验证开关27B后，将传感器材料分发至巴西伯南布哥州累西腓市的团队成员。在巴西，使用寨卡病毒患者样本对寨卡病毒诊断平台的临床诊断准确性进行了评估，并平行采用RT-qPCR进行比较。为验证基于纸张的寨卡病毒诊断平台，使用了便携式酶标仪，该仪器能够孵育并读取基于纸张的传感器的比色信号输出。颜色由黄色变为紫色用于识别阳性样本，而阴性样本则保持黄色（图6）。便携式酶标仪生成结果的另一种可视化方法（图8）是绘制每个基于纸张的反应随时间变化的比色响应曲线。每个样本均设三个重复进行检测，信号超过阈值（红色阈值线设定为1）的样本被判定为阳性，低于阈值的样本则被判定为阴性（图6 和 图7）。
最后，为了评估和比较寨卡病毒趾头开关传感器与当前诊断寨卡病毒感染的金标准方法的临床性能，所有患者样本均平行地采用RT-qPCR进行检测。图9展示了两个代表性患者样本通过RT-qPCR检测寨卡病毒时的三重复扩增曲线。当循环阈值（Ct）≤38时，样本被判定为阳性；图中红线表示寨卡病毒阳性样本，蓝线表示阴性样本。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg" /> 
图2琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量。 PCR产物在1%琼脂糖凝胶（1X TAE缓冲液）中以80 V电泳90分钟进行分析。单一条带通常表明反应成功。第1道：1 kb DNA ladders；第2–4道：分别为27B switch DNA、33B trigger DNA和47B trigger DNA。左侧数字表示条带大小，单位为bp。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg" /> 
图3：用于纸质寨卡病毒传感器的三种趾控开关原型。 在37 °C条件下，对三种基于纸质的RNA趾控开关传感器的性能进行了超过130分钟的测量。每个图表包含两条曲线，一条代表仅含开关的对照组，另一条代表含有开关和触发物的实验组。三个图表分别展示了使用趾控开关传感器27B（A）、33B（B）和47B（C）获得的数据。误差线表示三次重复实验的平均值标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg" /> 
图4：通过计算在570 nm处吸光度的倍数变化来确定性能最优的传感器。 倍数变化（或最大ON/OFF比值）是通过测量130分钟时仅含开关的对照组与含有开关加触发物的CFPS反应体系之间的吸光度（OD570）比值来计算的。误差条表示三次重复实验的标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg" /> 
图5：高性能开关的灵敏度评估。 体外 转录的Zika病毒RNA被梯度稀释后加入NASBA反应。经过1小时孵育后，按1:7的比例将反应液加入含无细胞PURExpress系统的纸盘中。在130分钟后的倍数变化为 37 &#176;C 绘制完成。该图已复制&#160;从24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg" /> 
图6：便携式酶标仪捕获页面加载了捕获的图像数据。 本图展示了一次数据采集过程中便携式酶标仪所捕获的最终图像示例。图像顶部可见原始的日期/时间戳。黄色表示对照或阴性反应，紫色表示阳性反应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg" /> 
图7：数据分析模式。 在左侧，用户选择要绘制的数据集；图表将在右侧显示，每个样本或对照组以不同颜色区分。红色虚线作为判断阳性与阴性样本的阈值。超过该阈值的三个重复检测样本被视为阳性，而低于该阈值的样本则判定为阴性。误差条表示三次重复实验的标准差（SD）。Ctrl 1 至 Ctrl 5 表示对照组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg" /> 
图8. PLUM，一种便携式酶标仪。 该&#160;便携式酶标仪可作为“盒中实验室”，用作温度可控的酶标仪，用于孵育和监测比色反应。该便携式设备可对基于纸张的寨卡病毒传感器在现场进行定量和高通量检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg" /> 
图9：对两个患者样本进行三重检测以鉴定寨卡病毒的RT-qPCR扩增曲线图。 当循环阈值（Ct）≤38时，样本被视为阳性。红色虚线用作判断样本阳性和阴性的阈值。红色曲线表示阳性样本，蓝色曲线表示阴性样本。ΔRn（delta Rn）值表示RT-qPCR仪器检测到的所有样本荧光信号的归一化强度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充实验方案文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">请点击此处下载这些&#160;图。</a>

获得可分散部署于社区、用于分布式检测的低成本、高通量诊断工具，对于应对全球健康危机至关重要。本文描述了如何构建基于纸张的病毒RNA序列检测诊断工具，并可通过便携式光学读取设备进行检测。

获得可投入社区用于检测的低负担分子诊断技术正变得愈发重要，并具有深远的广泛意义……

本方案描述了基于基因回路的诊断工具的设计、组装和验证方法。这些基于纸张的分子诊断技术成本低廉且灵敏度高，能够检测具有临床相关浓度的核酸，并可被设计用于检测几乎任何序列。该技术是一种可由用户根据自身需求进行设计的平台型技术，有望将临床级诊断应用于更多分散化的牙科资源有限环境。无细胞趾控开关传感器几乎可以针对任何基于核酸的靶标进行设计。近期的研究已展示了针对埃博拉病毒、诺如病毒、SARS-CoV-2、艰难梭菌以及引起伤寒的细菌的无细胞诊断技术。本次实验操作将由本实验室的博士后研究员Severino Jefferson Rivero da Silva和博士生Pouriya Bayat进行演示。为了设计趾控开关，从寨卡病毒基因组中确定靶序列，并按照文本方案所述从扩增子中选择寨卡病毒的靶序列。下载趾控开关设计软件包。打开 MATLAB 并导航至该设计软件所在的文件夹。将目标序列输入到位于 input 子文件夹中的设计输入文件 csv 文件中。选择用于设计功能的参数。运行设计功能，以生成目标序列的toehold开关设计。完成之后，导航至 final_designs 文件夹，找到以 CSV 格式电子表格保存的最佳趾头开关设计序列及其相应的目标序列。确保算法生成的趾头开关 DNA 序列在 5' 端包含 T7 启动子序列，在 3' 端包含一段保守的 21 个核苷酸的连接序列。使用 NCBI BLAST 通过检测序列同源性，将最佳趾头开关设计序列与其他常见病毒进行比对筛选。接受同源性低于40%的序列。在无核酸酶水中配制浓度为10微摩尔的趾控开关发夹DNA寡核苷酸和反向扩增引物溶液。根据下表在冰上将反应体系加入PCR管中进行组装。将反应管放入热循环仪中，按照本表所列的循环条件进行反应。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。纯化PCR产物，并用最小体积的无核酸酶水洗脱DNA，以确保获得足够高的浓度。使用分光光度计定量DNA。通过将25毫克粉末溶解于1毫升无核酸酶水中，制备CPRG储备溶液。根据此处所示的标准方案，在冰上配制主混合液。将无细胞主混合液加入PCR管中。对于无细胞对照和仅开关对照，加入无核酸酶水至终体积为5.94 µL。对于反应体系，加入经PCR纯化的toehold开关DNA，使其终浓度为33 nmol/L。为了测试趾控开关（toehold switch）与目标RNA的组合，加入体外转录的目标RNA，使其终浓度为1微摩尔。用移液器充分混匀所有反应体系，并短暂离心。在黑色透明底的384孔板上，向反应孔周围的孔中加入30微升无核酸酶水。然后使用2毫米活检打孔器和镊子切割经BSA封闭的滤纸片，并将其放入反应孔中。从每个反应管中取1.8 µL液体，分别以三复孔形式加入384孔板中的滤纸片上。用透明PCR封板膜覆盖板子，并将其放入酶标仪中。 每分钟在 37 摄氏度下测定 570 纳米处的吸光度，持续 130 分钟。在无核酸酶水中配制所有正向和反向引物组的 25 微摩尔储备溶液。使用此处所示的预混液配制 5 微升反应体系。用移液器吹打混匀，直至白色沉淀溶解，然后分装至PCR管中。向相应的PCR管中加入正向引物和反向引物，随后加入1微升无核酸酶水或2皮摩尔的目标触发RNA。轻轻吹打混匀，并短暂离心收集管壁液体。按照此处所示，在热循环仪上设置孵育程序。12分钟后，取出试管，向每支试管中加入1.25 µL酶混合液，随后混匀并离心。跳过41°C的保温步骤，将试管重新放回热循环仪，开始为期一小时的反应孵育。然后，为评估引物性能，组装基于纸张的无细胞toehold开关反应并分析数据。进行灵敏度分析时，筛选候选引物对，并用无核酸酶水对目标RNA进行系列稀释。使用选定的引物组合，以生物学重复三次的条件重复NASBA和无细胞反应。取1微升提取的患者RNA，按照第五部分所示进行NASBA扩增和基于纸张的无细胞反应。反应完成后，制备384孔反应板，并在便携式酶标仪中于37摄氏度下运行检测。随后，配制RT-qPCR组分，并根据此表格将试剂加入1.5毫升微量离心管中。用移液器混合反应液。将6.5 µL反应液分装至96孔或384孔PCR板的每个孔中，随后每个RNA模板重复加入3.5 µL。在板的上方覆盖一层PCR密封膜。将384孔板在600 × g条件下离心2分钟。将孔板放入实时定量PCR仪中，并按照此处所示的循环条件运行。根据计算机设计，构建了三个趾控开关，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。约 3,000 个碱基对处出现条带，表明反应成功。通过各自的体外转录触发 RNA 对趾控开关进行评估。尽管三种传感器均显示出吸光度增加，但传感器 27B 的开启速率最快，而开关 33B 和 47B 的开/关比值较低，表明存在背景活性且特异性降低。在570纳米处吸光度的倍数变化显示，开关27B具有最佳的“开启/关闭”信号比。此外，当与NASBA联用时，其检测RNA的灵敏度可低至每微升124个分子，表明具有高灵敏度。为评估传感器的临床诊断准确性，使用便携式酶标仪检测了来自巴西的寨卡病毒患者样本。颜色由黄色变为紫色表明样本为阳性。PLUM便携式酶标仪的集成软件将每个纸质反应的颜色变化随时间的变化绘制成图。超过阈值的样本被视为阳性。通过与RT-qPCR比较，确定了该传感器的临床性能。当循环阈值（Ct值）小于或等于38时，样本被视为阳性。在开展患者试验之前，必须确保趾控开关检测和NASBA引物敏感性结果具有可重复性并已优化。由于其简便性和适应性，本文所述的诊断平台为新型即时检测工具的开发铺平了道路，有望为医疗系统带来益处，尤其有利于低收入国家。

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基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

本文介绍了一种用于开发脑卒中功能评估计算机自适应测试系统（CAT-FAS）的实验方案。CAT-FAS...

脑卒中功能评估的计算机自适应测试系统

本试验旨在确立基于网络的计算机教育作为结肠镜检查前患者准备工具的地位。将基于计算机的教育与常规护理（即护士咨询）进行比较，评估内镜质量指标和患者相关结局指标。...

E-患者咨询试验（E-PACO）：基于计算机的教育与护士咨询在结肠镜检查准备中的比较

本方案整合了多种评估方法，展示了一种用于评估智能手机键盘设计的方法。建议采用由英文字母组成的成对字符作为输入材料，并将两个按键之间的转换时间作为因变量。...

一种评估智能手机键盘设计的方法与工具包

我们的目的是提供一份更新的、易于遵循的表肌电图电极制备与测试指南。为此，我们提供了材料采购的说明，以及电极制备和测试过程的详细操作步骤。...

低成本表肌电图电极的开发：一种简化的制备与测试工作流程

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。...

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

本方案详细描述了一种从低至10...

基于纸张的细胞外囊泡分离与表征装置

本文介绍了一种在液体处理机器人上使用模块化克隆DNA组装方法实现模块化DNA“元件”组装的自动化工作流程。该方案采用一种直观的软件工具，用于生成组合式DNA元件文库的液体处理工作站移液清单，并通过两个液体处理平台进行了演示。...

模块化DNA器件的自动化机器人液体处理组装

学习纸基分子诊断技术的设计与验证方法，利用无细胞脚趾开关传感器检测病毒RNA。该方案支持定制化检测多种核酸序列，适用于资源有限地区的分散式医疗诊断场景。

基于纸张的趾控开关诊断工具的开发与患者验证：从设计到实施的研究

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