基于纸张的趾控开关诊断工具的开发与患者验证：从设计到实施的研究

本方案描述了基于基因回路的诊断工具的设计、组装和验证方法。这些基于纸张的分子诊断技术成本低廉且灵敏度高，能够检测具有临床相关浓度的核酸，并可被设计用于检测几乎任何序列。该技术是一种可由用户根据自身需求进行设计的平台型技术，有望将临床级诊断应用于更多分散化的牙科资源有限环境。

无细胞趾控开关传感器几乎可以针对任何基于核酸的靶标进行设计。近期的研究已展示了针对埃博拉病毒、诺如病毒、SARS-CoV-2、艰难梭菌以及引起伤寒的细菌的无细胞诊断技术。本次实验操作将由本实验室的博士后研究员Severino Jefferson Rivero da Silva和博士生Pouriya Bayat进行演示。

为了设计趾控开关，从寨卡病毒基因组中确定靶序列，并按照文本方案所述从扩增子中选择寨卡病毒的靶序列。下载趾控开关设计软件包。打开 MATLAB 并导航至该设计软件所在的文件夹。

将目标序列输入到位于 input 子文件夹中的设计输入文件 csv 文件中。选择用于设计功能的参数。运行设计功能，以生成目标序列的toehold开关设计。

完成之后，导航至 final_designs 文件夹，找到以 CSV 格式电子表格保存的最佳趾头开关设计序列及其相应的目标序列。确保算法生成的趾头开关 DNA 序列在 5' 端包含 T7 启动子序列，在 3' 端包含一段保守的 21 个核苷酸的连接序列。使用 NCBI BLAST 通过检测序列同源性，将最佳趾头开关设计序列与其他常见病毒进行比对筛选。

接受同源性低于40%的序列。在无核酸酶水中配制浓度为10微摩尔的趾控开关发夹DNA寡核苷酸和反向扩增引物溶液。根据下表在冰上将反应体系加入PCR管中进行组装。

将反应管放入热循环仪中，按照本表所列的循环条件进行反应。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。纯化PCR产物，并用最小体积的无核酸酶水洗脱DNA，以确保获得足够高的浓度。

使用分光光度计定量DNA。通过将25毫克粉末溶解于1毫升无核酸酶水中，制备CPRG储备溶液。根据此处所示的标准方案，在冰上配制主混合液。

将无细胞主混合液加入PCR管中。对于无细胞对照和仅开关对照，加入无核酸酶水至终体积为5.94 µL。对于反应体系，加入经PCR纯化的toehold开关DNA，使其终浓度为33 nmol/L。

为了测试趾控开关（toehold switch）与目标RNA的组合，加入体外转录的目标RNA，使其终浓度为1微摩尔。用移液器充分混匀所有反应体系，并短暂离心。在黑色透明底的384孔板上，向反应孔周围的孔中加入30微升无核酸酶水。

然后使用2毫米活检打孔器和镊子切割经BSA封闭的滤纸片，并将其放入反应孔中。从每个反应管中取1.8 µL液体，分别以三复孔形式加入384孔板中的滤纸片上。用透明PCR封板膜覆盖板子，并将其放入酶标仪中。

每分钟在 37 摄氏度下测定 570 纳米处的吸光度，持续 130 分钟。在无核酸酶水中配制所有正向和反向引物组的 25 微摩尔储备溶液。使用此处所示的预混液配制 5 微升反应体系。

用移液器吹打混匀，直至白色沉淀溶解，然后分装至PCR管中。向相应的PCR管中加入正向引物和反向引物，随后加入1微升无核酸酶水或2皮摩尔的目标触发RNA。轻轻吹打混匀，并短暂离心收集管壁液体。

按照此处所示，在热循环仪上设置孵育程序。12分钟后，取出试管，向每支试管中加入1.25 µL酶混合液，随后混匀并离心。跳过41°C的保温步骤，将试管重新放回热循环仪，开始为期一小时的反应孵育。

然后，为评估引物性能，组装基于纸张的无细胞toehold开关反应并分析数据。进行灵敏度分析时，筛选候选引物对，并用无核酸酶水对目标RNA进行系列稀释。使用选定的引物组合，以生物学重复三次的条件重复NASBA和无细胞反应。

取1微升提取的患者RNA，按照第五部分所示进行NASBA扩增和基于纸张的无细胞反应。反应完成后，制备384孔反应板，并在便携式酶标仪中于37摄氏度下运行检测。随后，配制RT-qPCR组分，并根据此表格将试剂加入1.5毫升微量离心管中。

用移液器混合反应液。将6.5 µL反应液分装至96孔或384孔PCR板的每个孔中，随后每个RNA模板重复加入3.5 µL。在板的上方覆盖一层PCR密封膜。

将384孔板在600 × g条件下离心2分钟。将孔板放入实时定量PCR仪中，并按照此处所示的循环条件运行。根据计算机设计，构建了三个趾控开关，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

约 3,000 个碱基对处出现条带，表明反应成功。通过各自的体外转录触发 RNA 对趾控开关进行评估。尽管三种传感器均显示出吸光度增加，但传感器 27B 的开启速率最快，而开关 33B 和 47B 的开/关比值较低，表明存在背景活性且特异性降低。

在570纳米处吸光度的倍数变化显示，开关27B具有最佳的“开启/关闭”信号比。此外，当与NASBA联用时，其检测RNA的灵敏度可低至每微升124个分子，表明具有高灵敏度。为评估传感器的临床诊断准确性，使用便携式酶标仪检测了来自巴西的寨卡病毒患者样本。

颜色由黄色变为紫色表明样本为阳性。PLUM便携式酶标仪的集成软件将每个纸质反应的颜色变化随时间的变化绘制成图。超过阈值的样本被视为阳性。

通过与RT-qPCR比较，确定了该传感器的临床性能。当循环阈值（Ct值）小于或等于38时，样本被视为阳性。在开展患者试验之前，必须确保趾控开关检测和NASBA引物敏感性结果具有可重复性并已优化。

由于其简便性和适应性，本文所述的诊断平台为新型即时检测工具的开发铺平了道路，有望为医疗系统带来益处，尤其有利于低收入国家。