生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

单点散斑成像与牵引力显微镜的耦合分析可用于研究生长锥前进和导向的分子机制。由于这些技术使用 commercially available materials 和标准显微镜，研究人员几乎可以在其研究中直接应用这些技术。

从体外第3天开始，用四甲基罗丹明（TMR配体）以1:2000的比例稀释于培养基中处理神经元。随后将神经元置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，用预热的PBS洗涤TMR配体3次。

加入0.5毫升预热的Leibovitz's L-15培养基至神经元之前，先移除PBS。将神经元在37°C条件下维持1小时。接着，打开落射荧光显微镜，并将顶置培养箱设置为37°C。

然后将经TMR配体处理的神经元放入玻璃底培养皿中，并置于预热的显微镜载物台培养箱上。设置图像采集参数，Lifeact和HaloTag-actin荧光通道的曝光时间为500毫秒，像素合并设置为每像素0.065微米 × 0.065微米，时间间隔为3秒，共采集50帧。随后选择一个强烈表达Lifeact且弱表达HaloTag-actin的生长锥进行观察。

关闭光圈的视野，以照亮包含生长锥的最小区域，并采集延时图像。体外培养第3天，将培养基更换为0.5毫升预温的Leibovitz's L-15培养基，并在37°C下维持神经元培养1小时。进行牵引力显微镜观察时，打开激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为37°C。

将神经元置于玻璃底培养皿中，并放入预热的显微镜载台孵育器上。按照菜单脚本中所述设置图像采集参数，并选择一个高表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的生长锥。聚焦于凝胶表面，采集延时图像。

完成后，使用图像处理软件生成单通道时间序列的RGB图像堆栈，然后将图像保存为tiff文件。接着，向玻璃底培养皿中加入100微升10%（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）溶于蒸馏水的溶液，通过释放神经元与基质的连接使凝胶基质松弛。

然后将培养皿置于载物台培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，以稳定温度。在激光扫描共聚焦显微镜下，聚焦凝胶表面，获取未受应变基质中微珠的图像。生成未受应变基质中微珠的单通道 RGB 图像，并将该图像保存为 tiff 文件。

下载牵引力分析代码 TFM2021，并在 MATLAB 中打开 TFM2021。在 TFM2021 中打开 main.m 并运行。

当图形用户界面出现在屏幕上时，单击“加载未训练的基底图像”，并选择未应变基底中经过X-Y位置校正的微珠图像。然后转到“加载荧光微珠图像”，并选择微珠的时间序列图像堆栈。

然后点击“加载明场图像”以选择明场的延时成像序列，并使用“加载GFP图像”来选择EGFP的延时成像序列。在图形用户界面的下拉列表中，选择GFP，然后点击ROI，在显示的细胞图像上通过点击两个点来指定包含生长锥在内的矩形感兴趣区域。完成后，点击图形用户界面上的“保存”按钮，将选定的图像序列及感兴趣区域一并保存为mat文件。

接下来，单击“spot detect”，在对话框中输入期望的数值，以确定微珠检测的阈值。点击“确定”开始计算。完成计算后，单击“plot track”以放大之前选定的区域，并将检测到的微珠显示为白色圆点。

选择特定的微珠以划定一个多边形区域，该区域需包含生长锥下方的正确光点。然后按键盘上的回车键，多边形区域内的白色光点将变为红色。在图形用户界面中点击“估算力”。

然后根据论文中所述，输入像素大小和杨氏模量的数值。将泊松比的值设为0.3，并执行“估算力”以启动计算。软件会将计算结果保存为电子表格格式的文件。

神经元生长锥的荧光图像显示了高水平的 Lifeact 表达，使得在全开和狭缝光阑条件下均能观察到生长锥的形态。HaloTag-肌动蛋白的表达水平非常低，信号微弱。当光阑适当收窄时，背景信号减弱，生长锥中单个肌动蛋白斑点得以显现。

正确完成所有步骤的研究人员将观察到生长锥中的F-actin逆行流动。聚丙烯酰胺凝胶的刚度通过计算微球重量引起的压痕深度来确定。采用激光扫描共聚焦显微镜捕获凝胶表面及微球底部的图像。

在凹陷区域的凝胶表面，荧光微球的信号不可见。嵌入聚丙烯酰胺凝胶中的微球及神经生长锥的荧光图像显示了微球的原始位置和位移后的位置。同时观察到了生长锥的EGFP信号。

显微追踪图显示了相对于参考微珠的微珠运动。进行单点成像时，重要的是选择一个对肌动蛋白表达较弱的神经元，并确保其具有最小的成像区域。进行牵引力显微镜成像时，高倍放大成像是准确测定牵引力分布的关键。