Name: 肌动蛋白动力学、离合器耦合和牵引力分析，促进生长锥体前进 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解单斑点成像与牵引力显微镜联用技术，用于分析神经元生长锥中肌动蛋白动力学、离合器耦合及牵引力机制。该方法利用标准显微镜设备，可实时观察F-肌动蛋白逆行流动并量化生长锥运动相关力学特性。

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本研究部分由AMED（课题编号21gm0810011h0005，N.I. 和 Y.S.）、JSPS科研费（JP19H03223，N.I.）以及JSPS早年研究人员资助项目（JP19K16258，T.M.）、难治性疾病大阪医学研究基金会（T.M.）和NAIST下一代跨学科研究项目（Y.S.）提供支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中描述的实验方案使用了所有实验室、研究机构和大学中常规配备的市售材料和显微镜设备。因此，研究人员可以轻松地在其研究中采用本研究所述的单颗粒成像和牵引力显微镜技术。
斑点成像可用于分析肌动蛋白聚合和离合器偶联。此外，斑点成像还可用于监测与F-肌动蛋白逆行流相互作用的离合器分子（如shootin1和cortactin）的逆行流动。利用全内反射荧光显微镜（TIRF），也可监测细胞黏附分子L1-CAM的逆行流动23,41；L1-CAM表现出“抓握”和“滑脱”行为，这些行为反映了离合器偶联的效率23,41。尽管本研究采用TMR-HaloTag系统进行斑点成像，但其他荧光蛋白（如EGFP和单体红色荧光蛋白）也可用于此类分析16,18,20,23,24,27,39。实现肌动蛋白斑点可视化的关键在于荧光标记肌动蛋白的低表达水平以及最小区域的照明（图2）。在本实验方案中，Lifeact和HaloTag-肌动蛋白信号是依次采集的。由于肌动蛋白逆行流速度相对较慢（4.5 ± 0.1 µm/min）24，不同荧光通道的顺序图像采集（约1秒间隔）不会影响F-肌动蛋白逆行流和肌动蛋白聚合的分析。Lifeact是一种广泛使用的F-肌动蛋白标记物，但可能与肌动蛋白结合蛋白产生竞争47。更为重要的是，Lifeact可能改变肌动蛋白动力学，从而影响F-肌动蛋白结构和细胞形态47,48,49。
牵引力显微镜可用于检测驱动生长锥前进的作用力。通过将神经元嵌入细胞外基质中，研究者还可以在准三维环境中分析其所产生的力11。由于生长锥产生的牵引力较弱，高倍成像对于牵引力的精确定量至关重要7。尽管也有使用纳米柱或应力敏感型生物传感器等其他方法来测量牵引力50,51，但基于聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的方法具有高度可调性，可通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度来调节基底刚度41,44,52。在本实验方案中，PAA凝胶的终浓度为3.75%丙烯酰胺和0.03%双丙烯酰胺；其杨氏模量约为270 Pa22，该刚度处于脑组织弹性模量范围（100–10,000 Pa）之内53,54,55。由于PAA凝胶具有一定厚度（约100 µm），该方法在显微镜观察时限制了高倍物镜的使用。为获得高倍图像，研究者应使用激光扫描共聚焦显微镜的放大功能。
综上所述，当前的散斑成像与牵引力显微镜技术能够对力生成过程中的关键事件进行定量分析。这些信息对于深入理解生长锥前进与导向机制具有重要价值。

在发育中的脊椎动物大脑中，神经元会经历高度有序的迁移，并将轴突投射至适当的突触伙伴，以建立功能性的神经元网络1,2,3。位于神经突末端的生长锥是具有感觉和运动功能的结构，可决定神经元迁移和轴突发育的速度与方向3,4,5。由于神经元处于高度密集的微环境中，生长锥必须对其周围环境施加作用力才能向前移动6,7。为了理解神经元迁移和轴突导向的分子机制，对生长锥前进过程中分子力学机制的分析至关重要。
数十年的研究表明，驱动生长锥前进的牵引力是通过“离合器”机制产生的；该机制不仅存在于轴突生长锥中，也存在于迁移神经元的前导突起生长锥中8,9,10,11,12。具体而言，生长锥中的肌动蛋白丝（F-actins）在前沿处发生聚合，并在近端区域解聚，从而推动前沿膜向外延伸13,14,15。由此产生的力与肌球蛋白收缩共同作用，引发F-actin向后运动，称为逆行流（retrograde flow）7,11,16,17,18,19,20,21。离合器分子和细胞黏附分子介导了F-actin逆行流与黏附基底之间的机械耦合，并将F-actin流动的力传递至基底，从而产生推动生长锥前进的牵引力7,8,9,11,12,22。同时，肌动蛋白与基底的耦合降低了F-actin的流动速度，并将肌动蛋白的聚合转化为推动前沿膜突出的力9,10。
轴突生长锥能够感知局部化学信号，并将其转化为驱动生长锥定向迁移的驱动力3,23,24,25。例如，轴突导向分子netrin-1可激活其受体结肠癌缺失蛋白（DCC），进而激活Rho鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）和Ras相关C3肉毒毒素底物1（Rac1），以及它们下游的激酶p21活化激酶1（Pak1）26。Cdc42和Rac1促进1）肌动蛋白聚合，而Pak1则磷酸化一种“离合器”分子shootin122,26。shootin1通过肌动蛋白结合蛋白cortactin与F-肌动蛋白逆行流相互作用27，同时也与L1细胞黏附分子（L1-CAM）相互作用20,24。shootin1的磷酸化可增强其与cortactin和L1-CAM的结合亲和力，并加强shootin1介导的2）离合器耦合效应24,27。在生长锥内，肌动蛋白聚合和离合器耦合的不对称激活增加了朝向netrin-1来源一侧的3）牵引力，从而产生驱动生长锥转向的定向驱动力（图1）24。过去几十年中，关于神经元迁移和轴突导向的深入研究加深了人们对导向分子、其受体以及相关下游信号通路的理解2,10,28,29,30。然而，介导生长锥前进力生成的分子机制才刚刚开始被揭示；这可能归因于用于力学-生物学分析的实验方案应用尚有限。
本研究介绍了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白逆行流动的详细实验方案16,18使用超分辨率显微镜、转盘共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜已广泛用于监测F-肌动蛋白的向后流动25,31,32,33,34,35,36,37,38然而，本研究中的方案采用标准的落射荧光显微镜，因此可轻松推广应用11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42与Lifeact标记F-actin结合时43,&#160;单点斑成像技术可实现对肌动蛋白聚合速率以及F-肌动蛋白向后流动与黏附基底之间耦合效率的量化分析39,42本研究进一步描述了一种使用嵌有荧光微球的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶进行牵引力显微镜的详细实验方案11,22,23,24,27,39,41,42,44该方法通过监测力致微珠移动来检测并量化生长锥下方的牵引力44,45提供了一套开源的牵引力分析代码，并详细解释了在生长锥迁移过程中量化牵引力的方法。结合单颗粒成像与牵引力显微镜技术，将有助于深入理解生长锥迁移与导向的分子力学机制。这些技术同样适用于分析树突棘增大过程中的分子力学机制，而树突棘的增大已被证实与学习和记忆密切相关。42.

<table><tbody><tr><td>0.5% 台盼蓝染色液</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷</td><td>Sigma</td><td>281778-100ML</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺单体</td><td>Nacalai</td><td>00809-85</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Cytiva</td><td>17-1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>落射荧光显微镜（单点成像）</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td><td>Zeiss</td><td>421787-9970-799</td><td>物镜（牵引力显微镜）</td></tr><tr><td>盖玻片（直径 18 mm）</td><td>Matsunami</td><td>C018001</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Nacalai</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>开源软件包</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球 0.2 mm，红色（580/605），2% 固体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>羧基修饰微球</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿（直径 14 mm）</td><td>Matsunami</td><td>D1130H</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿（直径 27 mm）</td><td>Matsunami</td><td>D1140H</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma</td><td>G5882-10X10ML</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR 配体</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td></td></tr><tr><td>HBO103 W/2</td><td>Osram</td><td>4050300382128</td><td>汞灯（单点成像）</td></tr><tr><td>图像处理工具箱</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 EHS 肿瘤来源层粘连蛋白溶液</td><td>Wako</td><td>120-05751</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Nacalai</td><td>16919-42</td><td></td></tr><tr><td>LSM710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>共聚焦激光显微镜（牵引力显微镜）</td></tr><tr><td>MATLAB2018a</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 C57BL/6</td><td>Japan SLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠神经元核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Nacalai</td><td>22402-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td>电穿孔仪</td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td>CMOS 相机（单点成像）</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Nacalai</td><td>26036-34</td><td></td></tr><tr><td>并行计算工具箱</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>1528177</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>pFN21A-HaloTag-actin</td><td>(Minegishi et al., 2018)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4（10倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td><td>Zeiss</td><td>420790-9901-000</td><td>物镜（单点成像）</td></tr><tr><td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td><td>(Kastian et al., 2021)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SAMPHO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Nacalai</td><td>08933-05</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Nacalai</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>钢珠</td><td>Sako tekkou</td><td>N/A</td><td>用于测定 PAA 凝胶刚性的微球。直径 0.6 mm，密度 7.87 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>ZEN2009</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>图像采集软件（牵引力显微镜）</td></tr><tr><td>ZEN2012</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>图像采集软件（单点成像）</td></tr></tbody></table>

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

为了建立功能性神经网络，神经元必须迁移到其适当的位置，然后向靶细胞延伸轴突。这些过程依赖于位于神经突末端的生长锥的前进。轴突生长锥通过感知局部微环境并调节细胞骨架动力学以及肌动蛋白-黏附耦合（离合器耦合）来产生驱动力。数十年的研究已鉴定了调控神经元迁移和轴突导向的引导分子、其受体及下游信号级联；然而，驱动生长锥前进和导航所需产生作用力的分子机制才刚刚开始被阐明。在神经元生长锥的前沿，肌动蛋白丝经历向后流动，这一过程由肌动蛋白聚合和肌球蛋白收缩提供动力。F-肌动蛋白的向后流动与黏附基质之间的离合器耦合可产生推动生长锥前进的牵引力。本研究描述了一种通过单点成像技术监测F-肌动蛋白向后流动的详细方案。重要的是，当该技术与F-肌动蛋白标记物Lifeact联用时，能够量化：1）F-肌动蛋白的聚合速率；以及2）F-肌动蛋白向后流动与黏附基质之间离合器耦合的效率。这两项均为生成生长锥前进和导航所需作用力的关键变量。此外，本研究还描述了牵引力显微镜技术的详细操作流程，可用于量化：3）生长锥产生的牵引力。因此，通过结合&#160;单点成像与牵引力显微镜的分析，研究人员可监测生长锥前进和导航背后的分子力学机制。

单颗粒成像法用于量化肌动蛋白聚合速率和分子离合器耦合效率 
高水平的 Lifeact 表达可实现生长锥内 F-肌动蛋白的可视化；低水平的 HaloTag-肌动蛋白表达则可用于监测 F-肌动蛋白的向后流动（图3，补充文件2）。通过追踪肌动蛋白颗粒可测量 F-肌动蛋白流动速度（图3C，D）。由于 F-肌动蛋白向后流动与黏附基底之间的力学耦合会降低其流动速度，因此可通过速度估算分子离合器的耦合效率。此外，使用 Lifeact 标记 F-肌动蛋白有助于观察 F-肌动蛋白的延伸，并可用于量化肌动蛋白聚合速率（图3E，F）。
牵引力的定量分析 
严格遵循此处所述的方法将揭示生长锥下方荧光微珠的运动（图6C，补充文件4）。F-肌动蛋白向基底的逆行流动产生牵引力，导致荧光微珠在生长锥下方向后移动。牵引力分析代码通过荧光微珠的位移估算牵引力，并将计算得到的牵引力表示为力矢量。牵引力的方向和大小由力矢量的x分量和y分量确定（图8C、D）。图8D中的红色框表示一个力矢量的x分量和y分量；图8C描绘了相应的生长锥。以x-y坐标系表示，该矢量相对于x轴指向-93.8°；此方向朝向生长锥的后部（图8C）。牵引力F的大小按如下公式计算：
<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg" />
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg" /> 
图 1：生长锥产生牵引力及导向运动的分子机制。 净素-1（netrin-1）化学吸引梯度可诱导其受体 DCC 在轴突生长锥上发生不对称激活。这进一步激活 Rac1 和 Cdc42 及其下游激酶 Pak1。Rac1 和 Cdc42 促进（1）肌动蛋白聚合，而 Pak1 对 shootin1 进行磷酸化，增强 shootin1 介导的（2）离合器耦合（clutch coupling）。生长锥内肌动蛋白动力学和离合器耦合的不对称激活，增加了朝向净素-1 来源侧的（3）牵引力，从而产生驱动生长锥定向移动的驱动力。本文所述实验方案可用于定量分析生长锥导向过程中关键变量（1）–（3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg" /> 
图2：在全开和缩小的光圈下观察到的神经元生长锥的荧光图像。该生长锥表达 Lifeact 和 HaloTag-actin。 (A) 高水平的 Lifeact 表达可实现对生长锥形态的可视化。另一方面，HaloTag-actin 的表达水平非常低，即使在光圈完全打开时信号仍较弱。B当光圈适当缩小后，背景信号减弱，生长锥中出现单个肌动蛋白斑点。比例尺： 5 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg" /> 
图3：使用图像处理与分析软件 Fiji 定量测定 F-肌动蛋白流动速度和肌动蛋白聚合速率的步骤。 （A）调整图像角度以进行分析。（1）找到并选择一个在 F-肌动蛋白束中流动的肌动蛋白斑点（箭头所示）。（2）选择 图像 &#62; 变换 &#62; 旋转。（3）设置角度，使 F-肌动蛋白束方向朝上。（4）图像的角度将被改变。（B）划定包含肌动蛋白斑点和 F-肌动蛋白束的区域。（1）点击工具栏上的 矩形。（2）在图像上划定一个区域。提高图像的亮度和对比度，以便清晰显示肌动蛋白斑点及 F-肌动蛋白束的末端。（3）选择 图像 &#62; 复制。（4）输入显示肌动蛋白斑点在 F-肌动蛋白束中流动的五个时间帧。（5）选定的图像堆栈将显示在屏幕上。（C）在肌动蛋白斑点上叠加圆形。（1）点击工具栏上的 椭圆。（2）在肌动蛋白斑点上绘制一个圆形。（3）选择 图像 &#62; 叠加 &#62; 添加选区。（4）圆形被叠加。（5）在其余肌动蛋白斑点上重复叠加圆形操作。（D）测量五个时间帧期间肌动蛋白斑点的位移距离。（1）点击工具栏上的 直线。（2）绘制一条连接各圆心的直线。（3）选择 分析 &#62; 测量。结果由参数 高度（红色框）表示，反映肌动蛋白斑点的位移距离。（E）测量五个时间帧期间 F-肌动蛋白突起长度的变化。（1）绘制一条连接 F-肌动蛋白突起末端的直线。（2）选择 分析 &#62; 测量。结果（红色框）高度表示 F-肌动蛋白束的延伸长度。（F）肌动蛋白聚合速率由 F-肌动蛋白流动速度与延伸速率之和计算得出。&#160;另见 补充文件2。补充文件3 可协助研究人员练习上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg" /> 
图4：PAA凝胶制备步骤。 详细说明请参见步骤7.1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg" /> 
图5：PAA凝胶刚性的测定。（A）微球压痕法。当微球置于嵌有荧光微珠的PAA凝胶表面时，微球的重量会导致凝胶产生压痕。通过将微球底部的z轴位置减去PAA凝胶表面的z轴位置，可计算出压痕深度。（B、C）由微球压痕并含有荧光微珠的PAA凝胶的荧光图像。使用激光扫描共聚焦显微镜采集凝胶表面（B）和微球底部（C）的图像。在压痕区域的凝胶表面，荧光&#160;微珠的信号不可见（B，圆圈）。然而，在微球底部可以观察到这些信号。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg" /> 
图6：神经元生长锥的力图谱分析。（A-C）嵌入聚丙烯酰胺（PAA）凝胶中的微珠荧光图像以及用EGFP标记的神经元生长锥图像。A）采集延时图像后，通过加入SDS溶液将神经元从凝胶基底上释放，并采集未受应力基底中微珠的图像（B）。C）未受应力基底中微珠图像显示了微珠在原始位置（绿色）和位移后位置（红色）的分布。生长锥的EGFP信号以蓝色显示。右侧的时空图显示了在147秒内每隔3秒微珠的移动情况，箭头指示方框区域1和2中的微珠运动轨迹。区域2中的微珠为参考微珠。比例尺：A）、B）和C）左侧为2 µm，C）中图为1 µm。另见补充文件4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg" /> 
图7：使用Fiji校正未受应变基底中微珠图像x-y位置的步骤。（A）将未受应变基底中的微珠图像与荧光微珠的时间序列图像堆栈进行拼接。（1）选择 图像 &#62; 图像堆栈 &#62; 工具 &#62; 拼接。（2）分别在 图像1 和 图像2 中选择未受应变基底中的微珠图像和荧光微珠的时间序列图像堆栈。点击&#160;确定。（3）未受应变基底中的微珠图像将被添加到时间序列图像堆栈中。（B）校正荧光微珠图像的x-y位置。（1）使用滚动条（红色框）在图像堆栈中选择第二帧（红色箭头）。（2）选择 插件 &#62; StackReg。（3）从下拉列表（红色框）中选择 刚体，然后点击 确定。x-y位置的校正将开始。（C）保存经过x-y位置校正的微珠图像。在选择经过x-y位置校正的图像堆栈的第一帧后，（1）选择 图像 &#62; 复制。（2）在 范围 中输入 1，并取消选中 复制堆栈，然后点击 确定。（3）屏幕上将显示未受应变基底中经过x-y位置校正的微珠图像。将此图像保存为tiff文件。补充文件6可帮助研究人员练习上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg" /> 
图8：使用开源牵引力分析代码对神经元生长锥下方的牵引力进行分析。（A）用于分析牵引力的图形用户界面（GUI）。可通过下拉列表和滑块（红框所示）确认在GUI中选定的时间序列图像。（B）选择包含生长锥的区域。（1）在GUI上点击ROI，然后在细胞图像上用鼠标光标指定两个点（箭头所示）。（2）细胞图像上将出现一个红色方框，两次点击确定该方框两个角的位置。（C）选择生长锥下方检测到的微珠（白色点）。（1）在GUI上点击选择微珠（Select beads），通过点击在图像上划定一个包含生长锥的多边形区域，然后按Enter键。（2）多边形区域内的白色点将变为红色。（D）计算得到的牵引力方向与大小结果。表格中的红色方框表示由牵引力分析估算出的力矢量的x分量和y分量。在右侧图中的x-y坐标系中，生长锥产生的力矢量相对于x轴指向-93.8°；该方向指向图（C）中生长锥的后侧。补充文件6可帮助研究人员练习上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
补充文件1：本研究中使用的溶液和培养基配方。 详细使用方法见正文。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 1-63227R1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：神经生长锥中 Lifeact 的荧光成像及 HaloTag-actin 的荧光散斑成像。 Lifeact（绿色）和 HaloTag-actin（洋红色）。图像每 3 秒采集一次，总时长为 147 秒。比例尺：2 µm。另见 图 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件3：F-肌动蛋白流动速度与肌动蛋白聚合速率定量分析的练习数据。 Lifeact（绿色）和HaloTag-肌动蛋白（品红色）的多通道时间序列图像堆栈。另请参见图3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental file 3.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件4：检测神经元生长锥牵引力的力图视频。 微珠的原始位置（绿色）和位移后位置（红色）。生长锥中的EGFP信号以蓝色显示。图像每3秒采集一次，共147秒。比例尺：2 µm。另见图6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件5：牵引力分析代码。 详细使用方法请参见步骤8.12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental file 5.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件6：牵引力定量分析练习数据。 未受应力基底中微珠的单通道RGB图像，以及生长锥下方荧光微珠、EGFP和明场的单通道延时RGB图像序列。另请参见图7和8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental file 6.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。

为了建立功能网络，神经元必须迁移到其适当的目的地，然后向靶细胞延伸轴突。这些过程……

单点散斑成像与牵引力显微镜的耦合分析可用于研究生长锥前进和导向的分子机制。由于这些技术使用 commercially available materials 和标准显微镜，研究人员几乎可以在其研究中直接应用这些技术。从体外第3天开始，用四甲基罗丹明（TMR配体）以1:2000的比例稀释于培养基中处理神经元。随后将神经元置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，用预热的PBS洗涤TMR配体3次。加入0.5毫升预热的Leibovitz's L-15培养基至神经元之前，先移除PBS。将神经元在37°C条件下维持1小时。接着，打开落射荧光显微镜，并将顶置培养箱设置为37°C。然后将经TMR配体处理的神经元放入玻璃底培养皿中，并置于预热的显微镜载物台培养箱上。设置图像采集参数，Lifeact和HaloTag-actin荧光通道的曝光时间为500毫秒，像素合并设置为每像素0.065微米 × 0.065微米，时间间隔为3秒，共采集50帧。随后选择一个强烈表达Lifeact且弱表达HaloTag-actin的生长锥进行观察。关闭光圈的视野，以照亮包含生长锥的最小区域，并采集延时图像。体外培养第3天，将培养基更换为0.5毫升预温的Leibovitz's L-15培养基，并在37°C下维持神经元培养1小时。进行牵引力显微镜观察时，打开激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为37°C。将神经元置于玻璃底培养皿中，并放入预热的显微镜载台孵育器上。按照菜单脚本中所述设置图像采集参数，并选择一个高表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的生长锥。聚焦于凝胶表面，采集延时图像。完成后，使用图像处理软件生成单通道时间序列的RGB图像堆栈，然后将图像保存为tiff文件。接着，向玻璃底培养皿中加入100微升10%（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）溶于蒸馏水的溶液，通过释放神经元与基质的连接使凝胶基质松弛。然后将培养皿置于载物台培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，以稳定温度。在激光扫描共聚焦显微镜下，聚焦凝胶表面，获取未受应变基质中微珠的图像。生成未受应变基质中微珠的单通道 RGB 图像，并将该图像保存为 tiff 文件。下载牵引力分析代码 TFM2021，并在 MATLAB 中打开 TFM2021。在 TFM2021 中打开 main.m 并运行。当图形用户界面出现在屏幕上时，单击“加载未训练的基底图像”，并选择未应变基底中经过X-Y位置校正的微珠图像。然后转到“加载荧光微珠图像”，并选择微珠的时间序列图像堆栈。然后点击“加载明场图像”以选择明场的延时成像序列，并使用“加载GFP图像”来选择EGFP的延时成像序列。在图形用户界面的下拉列表中，选择GFP，然后点击ROI，在显示的细胞图像上通过点击两个点来指定包含生长锥在内的矩形感兴趣区域。完成后，点击图形用户界面上的“保存”按钮，将选定的图像序列及感兴趣区域一并保存为mat文件。接下来，单击“spot detect”，在对话框中输入期望的数值，以确定微珠检测的阈值。点击“确定”开始计算。完成计算后，单击“plot track”以放大之前选定的区域，并将检测到的微珠显示为白色圆点。选择特定的微珠以划定一个多边形区域，该区域需包含生长锥下方的正确光点。然后按键盘上的回车键，多边形区域内的白色光点将变为红色。在图形用户界面中点击“估算力”。然后根据论文中所述，输入像素大小和杨氏模量的数值。将泊松比的值设为0.3，并执行“估算力”以启动计算。软件会将计算结果保存为电子表格格式的文件。神经元生长锥的荧光图像显示了高水平的 Lifeact 表达，使得在全开和狭缝光阑条件下均能观察到生长锥的形态。HaloTag-肌动蛋白的表达水平非常低，信号微弱。当光阑适当收窄时，背景信号减弱，生长锥中单个肌动蛋白斑点得以显现。正确完成所有步骤的研究人员将观察到生长锥中的F-actin逆行流动。聚丙烯酰胺凝胶的刚度通过计算微球重量引起的压痕深度来确定。采用激光扫描共聚焦显微镜捕获凝胶表面及微球底部的图像。在凹陷区域的凝胶表面，荧光微球的信号不可见。嵌入聚丙烯酰胺凝胶中的微球及神经生长锥的荧光图像显示了微球的原始位置和位移后的位置。同时观察到了生长锥的EGFP信号。显微追踪图显示了相对于参考微珠的微珠运动。进行单点成像时，重要的是选择一个对肌动蛋白表达较弱的神经元，并确保其具有最小的成像区域。进行牵引力显微镜成像时，高倍放大成像是准确测定牵引力分布的关键。

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肌动蛋白动力学、离合器耦合和牵引力分析，促进生长锥体前进

本文介绍了一种用于可视化和定量神经元生长锥中F-肌动蛋白裸端的方法。将神经元在玻璃盖玻片上培养后，用含皂苷的溶液对细胞进行透化处理。随后，在含罗丹明标记肌动蛋白的皂苷缓冲液中短时间孵育，使荧光肌动蛋白结合到游离的肌动蛋白裸端上。...

在透化神经元生长锥中用罗丹明标记F-肌动蛋白的钝端

肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。...

用于癌细胞侵袭足和牵引力测定的聚丙烯酰胺凝胶

我们提出了一种软件解决方案，用于沿动态细胞突起长度方向半自动追踪相对蛋白质浓度。...

用于软件辅助追踪动态细胞突起中蛋白质浓度的图形用户界面

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

在本实验方案中，我们介绍了基于活细胞显微镜技术的细胞铺展实验的操作步骤。我们提供了一个开源的计算工具，用于对荧光标记的细胞进行无偏分割，并对细胞铺展过程中的片状伪足动态进行定量分析。...

细胞铺展过程中细胞边缘动力学的定量分析

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。...

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。...

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。...

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

了解单斑点成像与牵引力显微镜联用技术，用于分析神经元生长锥中肌动蛋白动力学、离合器耦合及牵引力机制。该方法利用标准显微镜设备，可实时观察F-肌动蛋白逆行流动并量化生长锥运动相关力学特性。

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

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