产生空突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动中的作用

所以神经酸衍生物只存在于致病菌中，弱糖基化的鞭毛含有这种糖。在框架中去除基因中所含的区域可以帮助找到鞭毛糖基化簇。该技术，最新的特定区域或基因，如糖基转移酶，它们之间具有高同源性并且参与不同的过程，并分析其参与鞭毛糖基化过程。

该技术还可以帮助发现参与致病细菌中相关多糖生物合成的糖基转移酶的作用，以及参与鞭毛形成的编码蛋白的基因的作用。演示该程序将由我实验室的技术人员Maite Polo完成。设计两对引物，扩增要删除的选定基因或区域的上游和下游的DNA区域。

引物A和D需要在五个素数端包括一个内切酶的限制性位点，允许在pDM4中克隆。确保引物B和C位于要删除的基因内或要删除的区域的第一个和最后一个基因内。确保两个引物都在框架中，并且位于基因内的五到六个密码子之间。

确保两种引物在五个素端包括21个碱基对互补序列，以加入DNA扩增子AB和CD.使用100纳克纯化的染色体DNA作为模板，在两组不对称PCR中用AB和CD引物，然后在1%琼脂糖凝胶中分析所得产物。从电泳凝胶中纯化和定量切除的扩增子。将100纳克每种扩增子与PCR试剂混合，无需引物。

扩展后，加入A和D引物并将其作为单个片段扩增。接下来，如前所述分析，纯化和量化所得产品。用内切酶消化一微克pDM4和400纳克AD扩增子。

将消化的pDM4与AD扩增子以摩尔载体结合，插入比为1比4，并制备连接反应。在20摄氏度下孵育过夜。之后，在70摄氏度下灭活T4连接酶20分钟。

将大肠杆菌菌株接种到Luria Bertani Miller肉汤中，并在30摄氏度下孵育，以200 RPM振荡，直到观察到0.4至0.6之间的光密度。将细菌以5， 000倍G和4摄氏度离心15分钟进行沉淀培养。将颗粒悬浮在冷却的蒸馏水中，并重复清洁过程两次。

将细菌悬浮液转移到微量离心管中，并在14， 000倍G和4摄氏度下重复离心五分钟。将沉淀重悬于冷冻水中后，加入约3.5微升连接混合物并在冰上孵育5分钟。将内容物转移到冷却的两毫米间隙电穿孔比色皿中。

电穿孔后加入SOC培养基并将内容物转移到培养管中。在30摄氏度下孵育一小时，以200 RPM振荡。将转化后的细胞接种在补充氯霉素的LB琼脂平板上。

使用pDM4克隆侧侧的引物，通过PCR检查将缺失构建体插入pDM4。准备过夜培养物，使受体气单胞菌菌株耐利福平和两种不同的大肠杆菌菌株。具有pDM4重组质粒的供体菌株，以及具有PRK 2073质粒的辅助菌株在30摄氏度。

用150微升LB将相同数量的供体，受体和辅助菌株的菌落悬浮在三个LB管中。然后在不含抗生素的LB琼脂平板上将三种细菌悬浮液在接受者与辅助者与供体的比例为五比一的两滴中混合，并将板面朝上孵育在30摄氏度下过夜。通过在LB琼脂平板中加入一毫升LB肉汤来收获细菌。将细菌悬浮液转移到锥形1.5毫升微量离心管中并剧烈涡旋。

用利福平和氯霉素在LB琼脂平板上涂抹100微升细菌悬浮液。旋转200微升和600微升样品，将沉淀悬浮在100微升LB肉汤中，并用利福平和氯霉素将平板放在LB琼脂上，然后孵育。进行氧化酶测试以确认菌落是气单胞菌。

进一步确认使用E和F引物通过PCR将pDM4重组质粒插入到特定的染色体区域。用10%蔗糖和不含抗生素在30摄氏度下在两毫升LB中生长重组菌落过夜。制备不同的培养稀释液后，将100微升细菌培养物和稀释液放在LB琼脂平板上，用10%蔗糖在30摄氏度下孵育过夜。

第二天，拿起菌落并将其转移到含或不带氯霉素的LB平板上。在30摄氏度下孵育过夜后，选择氯霉素敏感菌落。使用EF引物对通过PCR分析敏感菌落，并选择其PCR产物与删除的构建体大小相关的菌落。

在盖玻片的四个角上滴一小滴硅胶，然后将过夜生长的气单胞菌培养物安装在盖玻片上。将挖掘出的载玻片放在盖玻片上，然后将滑梯倒置。使用光学显微镜通过光学显微镜分析游泳运动，然后将三微升培养物转移到软琼脂板的中心。

将板面朝上孵育在25至30摄氏度之间过夜。在孵育结束时使用尺子，测量细菌通过琼脂从板中心向外围的迁移。培养气单胞菌在25至30摄氏度之间的900毫升TSB中过夜。

离心后，将沉淀悬浮在pH为7.8的100毫摩尔三氯化氢缓冲液的20毫升中。为了去除锚定的鞭毛，将悬浮液在带有玻璃棒的漩涡中三到四分钟，然后重复通过21号注射器。通过四摄氏度的两次连续离心沉淀细菌，并将上清液收集到单独的管中。

超速离心上清液后，将沉淀悬浮在150微升含有两毫摩尔EDTA缓冲液的100毫摩尔三氯化氢中。将150微升富集的鞭毛部分转移到薄壁超透明管中，并用12毫升氯化铯溶液填充。在摆动的桶形转子中以60， 000倍G在4摄氏度下超速离心管48小时。

用注射器将鞭毛带收集到氯化铯梯度中，并透析100毫摩尔三氯化氢加两毫摩尔EDTA，然后通过电泳和考马斯蓝色染色或质谱分析。在下图中，通道 WT 是 Aeromonas piscicola AH3。泳道1至8显示第二种重组的氯霉素敏感菌落。

ST 段是膀胱亢进 1KB 标志物。泳道1至3和5至8显示具有野生型FGI4基因的菌落作为泳道WT。泳道四显示了一个具有已删除FGI4基因的集落。光学显微镜检测表明，极性或侧鞭毛修饰仅导致迁移直径减小，因此，AH-3 FGI突变体和AH-3 FGI-4突变体仅显示出相对于野生型菌株的运动性降低。

该图显示了来自泳道一的AH-3的极性鞭毛，以及泳道二的FGI区域和三车道的FGI-4基因中没有突变体，其中两个突变体都具有分子量低于野生型菌株的极性鞭毛，这表明鞭毛聚糖的改变。重要的是要确保突变不会影响下游基因，并导致鞭毛无法组装或鞭毛细丝无法发育。当鞭毛蛋白的变化不可检测到时，需要使用鞭毛蛋白肽的总蛋白进行质谱分析，以了解聚糖质量。