Name: ACT1-CUP1测定确定出芽酵母中剪接体突变体的底物特异性敏感性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 了解ACT1-CUP1测定法如何用于检测剪接体突变体对pre-mRNA剪接的影响，并通过生长表型读数确定受影响的剪接步骤。该方法为研究酿酒酵母剪接机制提供了高效可靠的工具。

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感谢威斯康星大学麦迪逊分校的 Aaron Hoskins 及其实验室成员提供酵母菌株和设备，用于生成图 3-5。感谢 Harpreet Kaur 和 Xingyang Fu 对本文手稿提出的深刻见解。感谢西北大学在本文撰写、编辑和拍摄过程中给予支持的学生、工作人员和教职员工。感谢 Isabelle Marasigan 在本方法拍摄过程中提供的帮助。

1. 酵母菌株构建
<ol>
	<li>构建或获取一种背景基因为 leu2 和 cup1Δ 的 S. cerevisiae 菌株。构建该背景时，可采用成熟的酵母转化方法，如乙酸锂法结合单链DNA39。 
	注意：单倍体酵母菌株可能含有一个、两个或多个 CUP1 拷贝6,38。设计用于侧翼包围 CUP1 基因位点的敲除引物时，应参考所选酵母菌株的基因组信息。</li>
	<li>对酵母进行转化，将QSP通过基因组整合或质粒形式引入。可采用已有成熟方案，例如先前研究中描述的方法40,41,42。</li>
	<li>利用步骤1.2中获得的菌株进行酵母转化，以引入所需的 ACT1-CUP1 报告质粒。 
	注意：转化后，细胞必须在缺乏亮氨酸的培养基（-Leu）平板和液体培养基中培养，以确保 ACT1-CUP1 报告质粒的稳定保留。</li>
	<li>针对每一个待检测的QSP和每一个ACT1-CUP1报告质粒（包括对照菌株），重复执行步骤1.2和1.3。</li>
</ol>
2. 铜板制备
<ol>
	<li>选择适合待测报告基因的铜浓度范围（参见表1中常用报告基因的致死性数据）。 
	注意：一个全面的铜浓度范围示例包括30个不同的铜浓度，分别为0 mM、0.025 mM、0.05 mM、0.075 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM和2.5 mM Cu2+。</li>
	<li>配制1 M的CuSO4储备液，并通过0.22 µm的PES（聚醚砜）无菌滤膜进行无菌过滤。</li>
	<li>为每个目标铜浓度平板，准备2 mL的CuSO4储备液稀释液，溶剂为无菌水。 
	注意：由于0 mM Cu2+的平板将始终作为参考进行分析和成像，建议在铺板步骤（步骤3.4）开始和结束时各制备一个0 mM Cu2+平板。
	<ol>
		<li>根据平板体积40 mL计算达到目标铜浓度所需的储备液体积（参见补充表1）。</li>
		<li>将计算量的无菌水和1 M CuSO4储备液加入一个无菌的2 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于ACT1-CUP1检测的平板。 
	注意：以下方案的一种替代方法是先将培养基与琼脂在大容器中混合，高压灭菌后分装至较小容器中，以使每个平板具有不同的铜浓度。无论采用哪种方法，都必须确保所有平板的培养基浓度一致，即使各平板的铜浓度不同。
	<ol>
		<li>为每个待制备的空平板标注其最终含有的铜浓度。每种铜浓度至少准备一个方形平板。</li>
		<li>为每种待测铜浓度标记一个100 mL的锥形瓶。</li>
		<li>向每个锥形瓶中加入790 mg琼脂（2% w/v琼脂）和一个搅拌子。</li>
		<li>在一个大烧杯中，混合所有待制备铜浓度平板所需的-Leu生长培养基。每制备一个平板，将265 mg酵母氮源基础（YNB）和64 mg缺少亮氨酸的营养缺陷型混合物（以及为维持细胞中QSP质粒所需的其他任何营养成分）溶解于34 mL去离子水中。</li>
		<li>将34 mL的-Leu生长培养基溶液加入每个已准备好的100 mL锥形瓶中，并用铝箔封口。在铝箔上标注对应的铜浓度。</li>
		<li>使用高压灭菌器推荐的液体程序进行灭菌，同时溶解琼脂。</li>
		<li>尽快向每个锥形瓶中加入4 mL 20% w/v葡萄糖溶液（经无菌过滤）。</li>
		<li>核对标签，将2 mL的CuSO4稀释液加入对应编号的锥形瓶中。 
		注意：由于可同时制备数十个不同铜浓度的平板，因此必须清晰地标记所有锥形瓶、离心管和平板上的铜浓度，以避免在倒平板过程中发生混淆。</li>
		<li>使用磁力搅拌器搅拌约30秒，然后将35 mL培养基倒入已标记的平板中，避免产生气泡。待其冷却后再进行储存或使用。 
		&#8203;注意：这些平板通常在检测前1至2天制备，并在4 °C保存，直到使用前几小时取出。在开始点板前（步骤3.4），平板应恢复至室温（RT）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ACT1-CUP1 检测
<ol>
	<li>将目标菌株划线接种至-Leu平板上。 
	注意：若使用冻存菌种，接种前应确保细胞已充分复苏。推荐操作如下：从冻存管中划线接种，并在30 °C培养3-5天；随后挑取少量菌落再次划线，于30 °C继续培养2-3天。</li>
	<li>在10 mL培养基中过夜培养。
	<ol>
		<li>使用与步骤2.4.2中所述相同的比例配制-Leu生长培养基。每10 mL培养基，将66 mg酵母氮源基础（YNB）和16 mg缺亮氨酸的 dropout 混合物加入9 mL去离子水中，经0.22 µm PES无菌滤膜过滤。</li>
		<li>每个酵母菌株分别取9 mL -Leu生长培养基和1 mL 20% w/v葡萄糖（经无菌过滤），加入无菌的50 mL锥形管中。</li>
		<li>使用无菌接种针或移液枪头，取少量（约1 mm圆形）酵母菌落接种至培养基中。</li>
		<li>将所有过夜培养物在180 rpm、30 °C条件下振荡培养。 
		注意：如有条件，可使用旋转摇床代替振荡摇床。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用10%甘油将菌液稀释至OD600为0.5 ± 0.05。
	<ol>
		<li>每个菌株取100 µL培养液，加入含有900 µL水的比色皿中。</li>
		<li>使用分光光度计测定OD600值。</li>
		<li>计算在终体积为2 mL时达到OD600 0.5所需的稀释倍数。</li>
		<li>将各菌株用10%甘油（无菌）稀释至OD600为0.5。</li>
		<li>重新测定OD600，确认细胞密度在0.5 ± 0.05的目标范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将菌株点种至含铜平板上。 
	&#8203;注意：可采用多种方法进行点种，包括手动移液5–10 µL体积、使用重复或多通道移液器，或使用点种仪（pin replicator）压印。以下描述最后一种方法，但无论采用何种方法，多数操作步骤均相似。
	<ol>
		<li>设置无菌操作区域并点燃本生灯。</li>
		<li>对于48针点种仪，将每种稀释后的菌液各200 µL加入96孔板的不同孔中。在6 × 8阵列的空孔中加入200 µL 10%甘油（无菌）。 
		注意：九种酵母菌株的点种方案示例见补充表2。</li>
		<li>将点种仪浸入盛有95%（v/v）乙醇的浅皿中，过火灭菌。火焰熄灭后至少冷却2分钟，以避免热激损伤细胞。</li>
		<li>将四块平板放置于本生灯附近，并取下皿盖。</li>
		<li>将点种仪插入96孔板中，迅速提起。</li>
		<li>轻轻放置于平板表面，并轻微前后晃动，以促进良好转移。</li>
		<li>迅速提起，并以完全相同的方向放回96孔板中。</li>
		<li>可连续对最多另外三块平板进行相同操作。每完成四块平板后，需重复乙醇浸泡、过火灭菌及冷却步骤。</li>
		<li>点种完成后，平稳地将平板移至一侧，但仍保持在火焰的无菌保护范围内。 
		注意：建议在火焰附近进行酵母稀释和点种操作。平板在干燥过程中极易受到污染。</li>
		<li>待平板完全干燥后再盖上皿盖，通常需要3–5分钟。</li>
		<li>将平板在30 °C条件下培养3天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据收集与分析
<ol>
	<li>从培养箱中取出平板并进行肉眼观察。</li>
	<li>使用现有的相机或其他数字成像系统记录平板的图像。</li>
	<li>记录（或评分）每种菌株在可见生长的最高铜浓度下的表现。 
	注意：细胞在此浓度下仍能进行剪接并保持存活。为保持一致性，应始终采用相同的方法（肉眼观察或基于平板图像）来判定最后的可存活铜浓度。有时肉眼可见非常微小的菌落，但在图像上无法辨识。直接肉眼观察与基于图像评分之间的差异通常很小，一般仅为梯度中的一个浓度梯度。由于菌落图像常用于发表文章，建议以图像为基础进行评分。</li>
	<li>整合同一菌株多次 ACT1-CUP1 实验的数据，以得出关于QSP如何影响剪接的结论。 
	注意：发表用图通常展示酵母菌落在 0 mM Cu2+ 浓度、最后可存活铜浓度以及下一浓度（菌落死亡）下的图像。数据也可用柱状图表示，并为重复实验之间的标准差添加误差线。数据无需归一化，但可通过将野生型剪接因子对照的存活率设为1，进而比较所引入突变的影响。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

ACT1-CUP1 是一种生长检测实验，需特别注意确保所观察到的生长差异仅可归因于剪接缺陷。所有菌株在点板前应以相似的方式处理，包括经历相似时长和类型的生长过程以及储存条件。若使用温度敏感型菌株，ACT1-CUP1 实验应仅在这些菌株的生长状况与野生型相当的条件下进行。类似地，对于 QSP 组分，建议使用相同的酵母背景并保持 QSP 基因表达水平一致，以避免干扰实验结果的解读。在考虑使用的 QSP 和报告基因数量时，不建议每次使用复制平板法同时检测超过 30 个菌株。由于每一步操作所需时间增加，细胞会逐渐沉降，导致细胞活力下降，从而使实验结果不一致。
除了ACT1-CUP1作为生长检测方法本身存在的局限性外，定量剪接分析（QSP）对剪接过程的影响可能比该方法所能解析的更为复杂。由于剪接是一个多步骤过程，且剪接因子会被循环利用，因此观察到的表型可能是由干扰影响了多个剪接步骤所致。这一点即使在后续可对ACT1-CUP1进行补充的分析中也同样成立，其中一些方法如下所述。数据将突出显示受干扰最显著的步骤，尽管剪接因子功能的改变可能也影响了其他步骤。
<p class="jove_c...

剪接体是一种大型生物分子机器，可催化前体信使RNA（pre-mRNA）中内含子（非编码区）的移除1,2。&#160;在研究近100种蛋白质和5种非编码RNA中的某一个组分时，若单独分析该蛋白或RNA，单个点突变效应的表征往往难以明确。&#160;突变组分功能的变化最好在完整且具有活性的剪接体背景下，通过体内（in vivo）实验进行评估。
本文所述的铜诱导生长实验是快速评估酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或芽殖酵母剪接效率的一种方法。该实验由 C.F. Lesser 和 C. Guthrie 开发并于1993年发表，结合了使用简单模式生物操作便捷以及细胞存活率读数直观的优点3。细胞存活率与这些细胞中剪接体识别和剪接报告转录本的能力密切相关。
这种铜生长检测通常被称为ACT1-CUP1检测。名称ACT1-CUP1来源于两个融合基因，用于报告剪接效率。ACT1是酵母的肌动蛋白基因，高度表达且含有一个高效剪接的内含子4,5。Cup1p是一种铜螯合蛋白，可在细胞内结合铜离子，防止其干扰正常的细胞功能6,7,8。ACT1-CUP1报告基因按顺序包含这两个基因，使得只有当ACT1的内含子发生前体mRNA剪接时，CUP1才处于正确的阅读框中（图1）。所产生的融合蛋白包含肌动蛋白的前21个氨基酸和全长的Cup1p蛋白，可在富铜环境中提高酵母的存活能力3。因此，报告基因剪接量的增加会导致Cup1p浓度升高，从而增强铜抗性（图1）。与其他报告基因相比，CUP1即使在低表达水平下也能影响细胞存活率，具有较宽的敏感范围，并可用于直接筛选剪接突变3,6,7。此外，CUP1对酵母的常规生长并非必需，因此在本检测的实验条件下不会影响细胞稳态。与基因缺失或温度生长检测相辅相成，ACT1-CUP1可在其他条件均为最适的酵母生长环境下提供有关剪接效应的信息。
剪接体通过三个内含子序列识别其底物，即5'剪接位点（5' SS）、分支位点（BS）和3'剪接位点（3' SS）。研究人员已构建了多种ACT1-CUP1报告基因，其内含子中包含这些位点的非共识序列。最常用的ACT1-CUP1报告基因部分示于图1和表1中。由于剪接体在剪接循环的不同阶段以特异性方式与各个剪接位点相互作用，因此可根据所使用的非共识报告基因，在不同步骤上检测剪接体的稳健性。非共识报告基因的命名依据其内含子中发生突变的位置以及突变为的碱基。例如，A3c表示在5'剪接位点处发生突变的报告基因，具体为将共识序列中的第3位腺苷突变为胞嘧啶。该报告基因将与影响5'剪接位点选择和利用的剪接体突变体产生强烈相互作用。Lesser和Guthrie在其最初的研究中确定了哪些5'剪接位点突变会抑制剪接过程3。同年晚些时候，Burgess和Guthrie通过针对ATP酶Prp16p突变体的抑制子筛选，发表了涵盖全部三个剪接位点的非共识报告基因9。通过比较共识与非共识报告基因，ACT1-CUP1检测已成为理解酵母剪接体稳健性和选择性的关键工具，并可用于推断其他真核生物剪接体的功能。
由于非共识性ACT1-CUP1报告基因可使剪接体对进一步扰动更为敏感，因此可通过某一剪接因子突变对这些报告基因产生的正向或负向影响来表征该突变的作用。这一方法已以多种方式应用于剪接研究。首先，ACT1-CUP1检测法可被用作筛选剪接因子突变的遗传学筛选工具。例如，Prp8p是分子量最大的剪接蛋白，作为剪接体RNA核心催化剪接反应的平台。这一结论的部分依据正是不同Prp8p突变体对各类ACT1-CUP1报告基因剪接效率的增强或抑制作用10,11,12,13,14,15,16,17。其他剪接体蛋白组分也已通过ACT1-CUP1系统进行了研究，包括Hsh155p、Cwc2p、Cef1p和Ecm2p18,19,20,21,22,23,24,25。此外，该检测方法还被用于研究Prp16p以及另外四种参与剪接体转换过程的ATP酶的能量阈值9,26,27,28,29,30。小核RNA（snRNAs）也已通过ACT1-CUP1系统得到广泛研究，用以鉴定其协调作用的前体mRNA序列以及在剪接过程中snRNAs自身发生的二级结构变化3,31,32,33,34,35,36,37。
ACT1-CUP1 检测需要一种酵母菌株，该菌株中所有的 CUP1 基因拷贝均已被敲除。由于 CUP1 基因可能具有较高的拷贝数6,38，构建完全敲除菌株可能需要多轮操作或大量筛选工作。因此，cup1Δ 酵母菌株以及报告系统经常在不同实验室之间共享。
如果待评估的剪接因子突变来自质粒拷贝，则应敲除该因子的野生型基因。此外，酵母背景应允许至少两种质粒的筛选：一种包含ACT1-CUP1报告基因，传统上位于亮氨酸营养筛选质粒上；另一种包含待研究的剪接机制中的突变或扰动（图2）。通常，在单次实验中，会使用多个酵母菌株，每个菌株携带待测剪接扰动（QSP）和不同的报告基因，以检测该扰动对剪接的影响。
ACT1-CUP1 实验中的自变量使研究人员能够评估剪接位点突变（QSP）的严重程度。这些自变量包括铜的浓度以及多种非共识剪接报告基因的选择。首先，由于酵母菌株在含有不同铜浓度的平板上生长（图2），实验设置时需选定所用的浓度梯度。研究可先采用较宽的铜浓度梯度获得存活率的初步结果，随后使用更精细的浓度梯度重复实验，以识别细微的存活差异。第二个变量是可测试的多种ACT1-CUP1报告基因（图1 和 Table 1）。如果QSP在非共识报告基因存在时对酵母存活率的影响与野生型不同，则可得出结论：该QSP影响了剪接过程中的某个步骤或剪接体中在识别或加工内含子特定区域时起重要作用的区域。
酵母工具箱内容广泛，ACT1-CUP1 检测是剪接研究中的重要组成部分。ACT1-CUP1 检测通常与更深入的遗传学、结构学和/或生物化学分析相结合，用于评估QSP的影响。由于这些更详细的研究通常实验流程较长和/或成本较高，常见的策略是首先利用ACT1-CUP1进行有趣突变体的筛选。
本文提供了一种ACT1-CUP1检测实验方案，包括铜板的制备。该检测可为研究人员提供关于QSP对剪接影响的初步答案，以及受扰动影响最显著的内含子区域信息。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 无菌微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>2 mL 无菌微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>50 mL 无菌离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-332</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>96孔圆底微量培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-760</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>190 proof 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-600</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>500 mL 过滤系统（0.22 &amp;micro;m）</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229707</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>任何分子级琼脂均可使用。</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Humboldt</td><td>PN6200.1</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>细胞密度计</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>或其他可在595 nm波长下测定吸光度的光谱设备。</td></tr><tr><td>五水硫酸铜</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC134051</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>数字成像系统</td><td>Cytiva</td><td>29399481</td><td>ImageQuant 4000（用于图3）、&amp;nbsp;Amersham ImageQuant 800，或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>营养缺陷型混合物（-Leu）</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>请根据实验选择合适的营养缺陷型混合物。若实验中还使用了其他酵母营养标记物，则应使用针对该标记物和亮氨酸（Leu）的营养缺陷型混合物。</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>凝胶条带定量分析软件</td><td>Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1（用于图5A），或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>手持式相机</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>近红外凝胶成像仪</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR（用于图5a），或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>实验室级夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>实验室级支架与夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-101</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>点样复制器</td><td>VP Scientific</td><td>VP 407AH</td><td></td></tr><tr><td>半微量一次性比色皿</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>摇床</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biowave</td><td>80-3000-45</td><td>或任何可在600 nm波长下测定吸光度的分光光度计。</td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>也可使用圆形培养皿，但若使用点样复制器则操作更具挑战性。</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-520-16S</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>或不同制造商的同类产品。</td></tr></tbody></table>

act1-cup1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。无论是与疾病相关还是经功能筛选获得，许多此类突变均已在模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，酵母）中通过生长实验进行了研究。剪接特异性的铜生长实验，即ACT1-CUP1实验，可在表型水平上对突变进行全面分析。ACT1-CUP1实验利用报告基因系统，当报告基因被正确剪接时，酵母获得铜耐受性。因此，在铜存在条件下，酵母存活能力的变化反映了通过剪接过程产生的mRNA水平的变化。在典型实验中，通过引入不同的非共识剪接报告基因以及感兴趣的剪接因子突变，对酵母剪接体施加挑战，以检测其对剪接产生的协同或拮抗效应。本文提供了铜平板制备、酵母细胞涂布及数据分析的完整操作流程，并介绍了一系列互补实验，突显了ACT1-CUP1报告系统的多功能性。由于能够直接读取突变效应，并且可在该研究领域持续进行比较分析，ACT1-CUP1实验已成为剪接研究工具箱中一种实用且有效的工具。

生长实验（如 ACT1-CUP1）需要对多个菌落进行视觉上的比较评估。在此实验中，每种菌株均在液体培养基中过夜培养至饱和，稀释至 OD600 为 0.5，随后接种于 20 块含有不同浓度铜（从 0 mM 到 1.1 mM CuSO4）的平板上（图 3）。该浓度范围比方案中列出的范围更小，以便全面评估后续所使用和描述的 QSPs 以及 ACT1-CUP1 报告系统的影响。平板随后被成像并进行评分（图 3 和 补充表 3）。
在本代表性实验中，酵母背景菌株的 ADE2 基因被破坏，导致菌落呈现不同程度的红色（图3A、B）。该基因是腺苷合成通路中常见的敲除位点，其失活会导致红色色素前体物质在细胞内积累。因此，红色深浅可作为酵母菌落成熟度的指标（即反映细胞数量和培养时间）。在 ACT1...

ACT1-CUP1 检测是一种铜生长检测方法，可快速评估前体信使RNA（pre-mRNA）的剪接情况，以及突变型剪接因子对剪接体功能的影响。本研究提供了一项实验方案，并强调了可根据感兴趣的剪接问题进行定制化的可能性。

ACT1-CUP1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。

ACT1-CUP1 检测可用于判断某种突变是否影响前体信使RNA的剪接过程，并提示受该突变影响最显著的剪接步骤。ACT1-CUP1 检测将剪接因子的突变与其对复杂剪接过程的影响关联起来，其检测结果通过简单的生长表型读出，具有较宽的灵敏度范围。进行ACT1-CUP1检测时，高效利用时间至关重要。应首先对五到十个菌株进行检测，以尽量减少应激诱导的生长异常。本次实验流程将由我本人以及我实验室的本科研究人员Isabelle Marasigan共同演示。首先，向每个瓶子中加入 790 毫克琼脂和一个搅拌子。在一个大烧杯中，为所有待倒制的铜板准备缺乏亮氨酸的生长培养基。每块平板需加入 265 毫克酵母氮源基础培养基、64 毫克缺乏亮氨酸的营养缺陷型混合物以及 34 毫升去离子水。搅拌至溶解。然后，向每个已准备好的100毫升培养瓶中加入34毫升亮氨酸缺陷型生长培养基溶液，并用铝箔封口。接下来，使用高压灭菌锅推荐的液体程序进行高压灭菌，以达到灭菌并溶解琼脂的目的。高压灭菌后应尽快向每个培养瓶中加入4毫升20%葡萄糖溶液。然后，将试管标签与瓶子标签对应，将每种硫酸铜的2毫升稀释液分别加入相应的瓶子中。使用摇床混合约30秒，然后将35毫升溶液倒入已标记的培养皿中，注意避免产生气泡。针对每种酵母菌株，向无菌的50毫升锥形管中加入9毫升亮氨酸缺陷型生长培养基和1毫升20%葡萄糖。使用无菌接种针或移液器吸头，挑取少量酵母菌落接种至培养基中。随后，将所有过夜培养物在30摄氏度、180转/分钟的条件下振荡培养。接着，将100 µL培养物加入比色皿中，每种菌株对应加入900 µL的水。随后，使用分光光度计测量光密度，并计算在最终体积为两毫升时达到光密度0.5所需的稀释倍数。然后，将每种菌株用10%甘油稀释至光密度0.5，并重新测量光密度，以确认细胞密度处于目标范围内。设置无菌工作区域后，点燃本生灯。对于48针复制器，将每种稀释后的菌株各200微升加入96孔板的独立孔中，并在六乘八的孔阵空位中加入200微升10%甘油。然后将复制器浸入盛有95%乙醇的浅皿中，用火焰灭菌。火焰熄灭后，至少冷却两分钟，以避免对细胞造成热休克。将四个平板放置在酒精灯附近并取下平板盖。将复制器浸入96孔板中，然后快速提起。接着轻轻将复制器放到平板上，并轻轻前后摇动，以促进良好的转移效果。快速抬起并以完全相同的朝向放入96孔板中。一块板接种完毕后，平稳地移至一旁，但仍需保持在火焰的无菌范围之内。待平板完全干燥后再盖上盖子，通常需要三到五分钟。然后，在 30 摄氏度下将平板培养三天。从培养箱中取出平板后，进行肉眼观察。生长实验表明，随着铜浓度的增加，剪接水平较低的菌株表现出汇合度下降，直至铜浓度达到致死水平。酵母背景包含一个被破坏的 ADE2 基因，导致菌落呈现深浅不一的红色。成熟的菌落呈深红色。在涂布过程中，如果在左右移动时将复制器抬起、以一定角度移动，或在平板上方晃动，可能导致形成椭圆形菌落，或由少量细胞溶液液滴形成微小菌落。携带A3c报告基因的酵母在0.15毫摩尔铜浓度下仍能存活，而野生型报告基因细胞在所测试的全部铜浓度范围内均保持活力。检测结果表明，U6 snRNA第57位的不同碱基与5'端或分支位点突变共同作用时，对剪接体具有独特的影响。其中U57c是一种累加性突变，与A3c及分支位点G报告基因联合作用时会降低铜耐受性。相比之下，U57a 能够提高铜耐受性，因为它促进了向第二步的进程。在通过 ACT1-CUP1 鉴定出剪接扰动后，研究可进一步采用更定量的方法，例如引物延伸实验，以及通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）和酶促探针法鉴定受干扰的分子相互作用。ACT1-CUP1 作为一种基础性检测方法，推动了我们对酵母剪接体稳健性和选择性的理解。并且不断拓展我们对剪接体功能的理解。

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