ACT1-CUP1测定确定出芽酵母中剪接体突变体的底物特异性敏感性

ACT1-CUP1测定可以确定突变是否影响信使RNA剪接前，并指示哪个剪接步骤受影响最大。ACT1-CUP1测定将剪接因子突变与其对复杂剪接过程的影响联系起来。它利用生长表型的简单读数，具有广泛的灵敏度范围。

在进行ACT1-CUP1测定时，有效利用时间很重要。从 5 到 10 种菌株的测定开始，以尽量减少压力引起的生长畸变。演示这个过程的将是我和我实验室的本科研究员Isabelle Marasigan。

首先，向每个瓶子中加入 790 毫克琼脂和搅拌棒。在一个大烧杯中，准备亮氨酸脱落生长培养基，以便倒入所有铜板。这包括 265 毫克酵母氮碱、64 毫克辍学混合物、减去亮氨酸和每块要倒入的板的 34 毫升去离子水。

搅拌溶解然后，向每个制备的100毫升瓶中加入34毫升亮氨酸辍学生长培养基溶液，并用铝箔盖住。接下来，使用高压灭菌器的推荐液体循环对琼脂进行灭菌和溶解。高压灭菌后，尽快向每瓶中加入四毫升20%葡萄糖。

然后，将试管标签与瓶子标签相匹配，将两毫升稀释的硫酸铜分别添加到其预期的瓶子中。使用搅拌板混合约30秒，然后将35毫升倒入或移液到标记的盘中，避免气泡。每个酵母菌株，将 9 毫升亮氨酸辍学生长培养基和 1 毫升 20% 葡萄糖加入无菌 50 毫升锥形管中。

使用无菌棒或移液器吸头收集一小块酵母样本并接种培养基。然后，在 180 RPM 和 30 摄氏度下摇动所有过夜培养物。接下来，向比色皿中加入 100 微升培养物，每个菌株含有 900 微升水。

然后，用分光光度计测量光密度，并计算在2毫升的最终体积中光密度为0.5所需的稀释度。然后，将每种菌株稀释至10%甘油中的光密度0.5，并重新测量光密度以确认细胞密度在所需范围内。设置无菌工作地点后，点燃本生燃烧器。

对于 48 针复制器，将 200 微升每种稀释菌株移液到 96 孔板的单独孔中，并用 200 微升 10% 甘油填充六乘八网格中的空白空间。然后，将复制器浸入95%乙醇和火焰的浅培养皿中进行灭菌。火焰熄灭后让它冷却至少两分钟，以避免热量冲击细胞。

将四个板放在燃烧器附近并取下盖子。将复制器浸入96孔板中，然后快速将其提起。然后，轻轻地放在盘子上，轻轻地来回摇晃，以促进良好的转移。

以一个快速的动作提起，并以完全相同的方向放置在96孔板中。板板镀好后，以平稳的动作向侧面移动，但仍在火焰的灭菌伞内。在盖上盖子之前让板完全干燥，通常是三到五分钟。

然后，将板在 30 摄氏度下孵育三天。从培养箱中取出板后，目视检查它们。生长测定表明，随着铜浓度的增加，剪接较低的菌株显示出汇合度降低，以至于铜浓度变得致命。

酵母背景包括一个被破坏的ADE2基因，导致菌落是不同深浅的红色。成熟的菌落呈深红色。在电镀时，如果在向左或向右移动时抬起复制器，以一定角度移动，或者如果在平板上方摇动，则可以从细胞溶液的小液滴中产生椭圆形的菌落或微菌落。

具有A3c报告基因的酵母存活至0.15毫摩尔铜，而野生型报告细胞在测试的铜浓度范围内保持活力。结果表明，U6 snRNA位57处的不同碱基结合5个初代或分支位点突变对剪接体有独特的影响。而U57c是一种加性突变，降低铜耐受性，结合A3c和分支位点G报告基因。

相比之下，U57a增加了铜的公差，因为它促进了第二步的进展。通过ACT1-CUP1鉴定剪接扰动后，研究可以转向更定量的方法，如引物延伸和通过EMSA和酶探测鉴定破坏的分子相互作用。ACT1-CUP1一直是基础测定，建立了我们对酵母剪接体的稳健性和选择性的理解。

它继续扩展我们对剪接体功能的理解。